支气管哮喘(asthma,简称哮喘)发病机制十分复杂，可能是多种机制共同作用的结果。已有研究表明，实验性哮喘豚鼠尿中水通道蛋白2(aquaporin 2,AQP2)含量增加^{[1, 2]}，提示AQP2参与的水液代谢可能为哮喘的发病机制之一，本课题组前期研究发现哮喘急性发作期尿液AQP2增高^[3]，提示AQP2可能参与了哮喘的发病过程。为进一步探讨不同临床控制水平哮喘患者尿液AQP2的差异性，本研究采用ELISA方法检测尿液中AQP2的含量，探讨不同临床控制水平的哮喘患者以及健康受试者之间的差异性及与炎症因子的相关性。本研究为前瞻性调查研究，研究方案符合人体试验伦理学标准，并得到新疆医科大学附属中医医院伦理委员会的批准，受试者在受试前签署知情同意书。

支气管哮喘患者均来自2012年3月至2013年7月间新疆医科大学附属中医医院呼吸内科门诊及住院患者，诊断标准参照中华医学会呼吸病学分会支气管哮喘学组 2008 年支气管哮喘防治指南^[4]。按照哮喘控制测试(asthma control test，ACT)进行控制水平的分级：通过回答有关哮喘症状和生活质量的 5 个问题的评分进行综合判定，25 分为控制、20～24 分为部分控制、19 分以下为未控制。纳入标准：(1)年龄≥18 周岁且≤68 周岁；(2)符合支气管哮喘诊断标准；(3)同意参与本试验且资料完整者。排除标准：(1)妊娠期或哺乳期妇女，女性经期；(2)合并有其他引起呼吸困难等症状的疾病，如气胸、纵隔气肿、慢性阻塞性肺病、肺结核、慢性肺源性心脏病、慢性呼吸衰竭等；(3)近期有手术外伤者，合并其他急性感染性疾病者等；(4)合并冠心病、心功能不全、糖尿病、高血压病、肝肾疾病及造血系统等严重原发性疾病、风湿免疫结缔组织疾病、精神病患者。最终纳入符合条件者60例，均为非吸烟者，年龄23～68岁，平均年龄(44.79±9.85)岁，男性18例，女性42例，其中未控制组 36例、部分控制组 24 例。另选取21名无呼吸系统疾病的健康人作为正常对照组，年龄23～65岁，平均年龄(45.29±8.97)岁，无哮喘和其他过敏性疾病及家族史，均为新疆医科大学附属中医医院体检中心体检正常者，均不吸烟。各组的其他临床资料见表 1。

表 1 (Table 1)

表 1 哮喘患者(部分控制及未控制组)与健康受试者的临床特征比较 特征 正常对照组n=21 未控制组n=36 部分控制组n=24 P值 年龄(岁), x±s 42.20±10.65 44.94±9.79 41.91±11.24 0.781 性别n 0.161 男 7 11 7 女 14 25 17 BMI(kg·m-2), x±s 25.70±4.20 24.43±5.14 21.54±4.50 0.377 过敏性疾病n <0.001 是 0 25 11 否 21 11 13 ICS使用n <0.001 是 0 12 14 否 21 24 10 预测的FEV1% x±s 93.64±12.37 72.67±22.84 84.51±6.57 0.142 预测的FVC% x±s 100.07±8.56 92.50±23.37 91.25±5.40 0.604 FEV1/FVC% x±s 82.80±8.76 62.22±15.24 80.47±7.88 0.024 按哮喘控制测试分级 (分), x±s - 16.41±2.98 21.64±1.29 <0.001 BMI:体质指数；ICS：吸入糖皮质激素；FEV1：1 s用力呼气量；FVC：用力肺活量

表 1 哮喘患者(部分控制及未控制组)与健康受试者的临床特征比较

Andygene公司人AQP2酶联免疫分析(ELISA)试剂盒；美国 BD公司流式液相多重蛋白定量技术试剂盒(CBA Human Th1/Th2/Th17 Kit)。

收集受试者清晨空腹禁饮时尿液，1 500×g离心20 min，仔细收集上清，于-80℃冰箱中保存，待测AQP2含量。抽取受试者清晨空腹禁饮时静脉血 3 mL，抗凝，1 500×g离心20 min，于－80℃冰箱中保存，待测血浆白介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、肿瘤坏死因子(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)的水平。

采用SPSS 10.0统计软件进行分析,实验数据以x±s表示,组间比较采用t检验，检验水准(α)为0.05。

表 2可见，哮喘未控制组及部分控制组患者尿液中AQP2含量均高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，而未控制组较部分控制组增高，但差异无统计学意义。哮喘未控制组血浆中IL-4含量高于正常对照组及哮喘部分控制组，差异均有统计学意义(P<0.01)。哮喘未控制组血浆中IL-6的含量高于正常对照组及哮喘部分控制组，但差异无统计学意义(P=0.058)。哮喘未控制组及部分控制组患者血浆中TNF-α含量均高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表 2 (Table 2)

表 2 哮喘患者(部分控制及未控制组)与正常对照组尿液AQP2及炎性因子含量 ρB/(pg·mL-1)，x±s 指标 正常对照组n=21 未控制组n=36 部分控制组n=24 AQP2 36.14±13.29 174.28±40.81** 146.55±64.60** IL-2 1.94±0.29 2.00±0.31 1.62±0.58 IL-4 0.60±0.27 1.10±0.25**△△ 0.62±0.26 IL-6 1.63±0.44 2.33±0.85 1.76±0.32 IL-10 0.61±0.21 0.77±0.32 0.69±0.15 IL-17 17.70±4.41 21.23±4.97 20.72±3.17 TNF-α 1.25±0.35 1.88±0.33* 1.87±0.51* IFN-γ 2.03±0.56 2.04±0.60 2.37±0.70 AQP2：水通道蛋白2；IL-2：白介素2；IL-4：白介素4；IL-6：白介素6；IL-10：白介素10；IL-17：白介素17; TNF-α:肿瘤坏死因子α; IFN-γ: 干扰素γ; *P<0.05，** P<0.01与正常对照组比较；△△P<0.01与部分控制组比较

表 2 哮喘患者(部分控制及未控制组)与正常对照组尿液AQP2及炎性因子含量

结果显示(表 3)，尿液AQP2与血浆IL-4、IL-6均有相关性(P=0.049，P=0.010)。IL-4与IL-10、IFN-γ也相关(P=0.002，P=0.019)，而与IL-17不相关。IL-6、IL-10均与TNF-α有相关性(P=0.001，P=0.010)；IL-10与IFN-γ相关(P=0.005)。

表 3 (Table 3)

表 3 尿液AQP2与外周血炎性因子的相关系数 IL-2 IL-4 IL-6 IL-10 TNF-α IFN-γ IL-17 AQP2 -0.191 0.275* 0.354* 0.010 0.172 -0.007 -0.060 IL-2 0.204 0.062 0.221 0.068 0.007 -0.207 IL-4 0.060 0.406** 0.110 0.317* 0.240 IL-6 0.052 0.683** -0.120 0.099 IL-10 0.344* 0.370** 0.177 TNF-α -0.017 0.083 IFN-γ 0.048 AQP2：水通道蛋白2；IL-2：白介素2；IL-4：白介素4；IL-6：白介素6；IL-10：白介素10；IL-17：白介素17; TNF-α:肿瘤坏死因子α; IFN-γ: 干扰素γ. *P<0.05, **P<0.01

表 3 尿液AQP2与外周血炎性因子的相关系数

AQP2基因是在1993 年克隆确认的水通道蛋白(AQP)家族中的一种,AQP2最早发现于肾脏集合管主细胞浆内，是肾小管重吸收水的主要通道蛋白，在血管升压素的调控下以穿梭形式参与快速水分子转运机制，是生理条件下肾脏最主要的水通道，是维持调节体内水平衡的必需物质。AQP2 敲除后小鼠几乎不能存活，并表现为严重的尿崩症^[5]。有研究表明哮喘动物模型中肾脏AQP2基因 mRNA 和蛋白的表达明显增加^[6]。但肾脏 AQP2 的检测具有创伤性，探索尿液 AQP2 蛋白的检测方法及其意义成为了当前 AQP2 的研究热点。近来研究发现，AQP2“穿梭”于集合管主细胞的胞质和小管侧细胞膜，部分AQP2 蛋白可以从细胞膜脱落于小管腔而被尿液冲出^[7]。AQP2是目前唯一可以在尿液中检测到的水通道蛋白，具有检测方便、无创、易于临床推广的特点。Wu等^[8]研究发现，AQP5可以调节AQP2的表达，上调AQP5可能通过影响AQP2膜定位导致多尿，提示AQP2与AQP5的关系密切。而近期多项研究表明AQP5与哮喘、肺水肿及黏液分泌有关^{[9, 10, 11]}，因而AQP2在哮喘发病机制中的作用值得进一步研究。

从免疫病理学的角度来看，哮喘是一种全身变态反应性疾病，哮喘患者的IL-4占优势，Th前体细胞向Th2方向分化，分泌IL-4等Th2类因子，介导变态反应，其中IL-4促进B淋巴细胞合成IgE，Th2类因子在哮喘患者气道高反应性、气道慢性炎症和气道重塑的形成中起着关键作用^[12]。Kelly-Welch等^[13]研究发现，IL-4表达在哮喘发病过程中明显增高，IL-4通过其受体而发挥生物效应，Th细胞在抗原诱导下分泌大量的IL-4、IL-13等细胞因子，继而引起与变态反应、哮喘以及自身免疫性疾病相关的一系列相似的反应。在调节T细胞增殖等方面，IL-4同样具有重要的作用。Kelly-Welch等^[13]研究表明，蛋白酪氨酸激酶转导及转录激活因子以及磷脂酰肌醇-3-激酶途径是生理情况下介导IL-4受体所诱导的T细胞增殖的途径。同时在哮喘的发病机制中IL-6水平的升高起着非常重要的作用。IL-6在诱导Th17分化过程起着关键的作用，IL-6通过促进Th17细胞可抑制Foxp3⁺调节性T淋巴细胞的分化、增殖，维持效应性T淋巴细胞和调节性T淋巴细胞的平衡，在调节免疫和炎性反应中起重要的作用。吸入丙酸氟替卡松可通过降低血浆IL-6水平的机制增加哮喘患儿外周血中单个核细胞中CD4⁺Foxp3⁺调节T淋巴细胞的数量^[14]。吸入糖皮质激素的治疗作用与下调血清中的IL-6、IL-8和TNF-α水平有关。陈华佳等^[15]研究发现，与治疗前比较，吸入糖皮质激素治疗3个月后哮喘患儿血清中IL-6、IL-8和TNF-α浓度下降； IL-6与Th17细胞分化有关，共同参与了哮喘过敏性的气道炎症^[16]。Matsumoto等^[17]的研究发现，通过双链RNA的复制，一些呼吸道病毒可以抑制Foxp3⁺T cell/IL-10，从而诱导IL-6的表达增加并促进了哮喘的发展。IL-6有可能在严重的病毒性感染中成为阻碍哮喘发展的作用靶点。

与之前的研究结果类似，本研究数据同样显示出血浆IL-6在未控制组表达增高，但各组间差异无统计学意义(P=0.058)；同时未控制组哮喘患者的血浆TNF-α明显增高，与正常对照组比较差异有统计学意义(P=0.010)；血浆IL-4也表现为未控制组较正常组及部分控制组增高，差异均有统计学意义(P<0.01)；未控制组哮喘患者处于病情不同程度发作的状态，血浆IL-4、IL-6、TNF-α细胞因子表达明显增强，而部分控制组患者的血浆IL-4、IL-6、TNF-α细胞因子表达较未控制组减弱但仍较对照组有不同程度的增高。哮喘组尿液中AQP2较对照组增高(P<0.01)，尤以未控制组增高明显，提示尿液AQP2参与了哮喘的发病过程。目前未见关于AQP2与IL-4、IL-6关系的报道，但已有研究表明AQP2与TNF-α相关的机体系统性炎症反应有关，李慧玉等^[18]研究甘遂醇提取物与注射生理盐水小鼠排尿的关系，组织切片发现AQP2表达下降的同时伴有TNF-α的表达增强。应用顺铂注射液患者经过罗格列酮预处理后可降低体内TNF-α水平，减轻系统性炎症反应的同时表现为AQP2表达恢复^[19]。本研究还发现，尿液AQP2与血浆 IL-4、IL-6有相关性，IL-6与TNF-α明显相关，提示AQP2在哮喘IL-4、IL-6、TNF-α相关系统性炎症反应网络中的作用，可能成为探讨哮喘发病机制新的研究方向。