2015, Vol. 36
免疫性血小板减少症(immune thrombo-cytopenia,ITP)是最常见的一种出血性疾病，由于血小板抗体致敏的血小板导致血小板免疫性破坏过多，以广泛皮肤黏膜及内脏出血、血小板减少、骨髓巨核细胞发育成熟障碍、血小板生存时间缩短等为特征。其发病机制目前尚未完全阐明。ITP在祖国医学上证属“紫癜病”病证门类，根据发病机制分为血热妄行、阴虚火旺、气不摄血等证型[1]。本研究拟从现代免疫学角度开展对不同中医证型ITP病因的探讨。
既往观点认为，血小板的减少是因为机体体液免疫异常,B淋巴细胞产生大量血小板膜糖蛋白特异性自身抗体，介导血小板被单核吞噬细胞系统破坏[2]。研究发现T细胞亚群之间的平衡紊乱也可能导致ITP发病[3]。Th17 细胞是最新发现的一种新的T细胞亚群，其和CD4+CD25+调节性 T 细胞 (Treg)之间的平衡失调被认为是诱发ITP发生的机制之一[4]。本研究着眼于ITP患者中Treg细胞、Th17 细胞的水平与中医证型的关系，评价其在辅助ITP中医辨证分型中的价值。
1 资料和方法 1.1 一般资料所有ITP病例均来源于2012年8月至2014年1月本科门诊及住院的ITP患者，共92例。年龄16~68岁，中位年龄49岁，平均年龄(50.32±14.87)岁；其中16～20岁3例(3.26%)，21～40岁32例(34.78%)，41～60岁37例(40.22%)，60岁以上20例(21.74%)。男性42例，女性50例。对照组为健康志愿者，共30例，年龄23~58岁，中位年龄34岁，平均年龄(47.56±12.84)岁，男性16例、女性14例。两组性别及年龄差异无统计学意义。
1.2 诊断标准 1.2.1 西医诊断标准西医诊断标准参照张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》[5]有关ITP的诊断标准。(1)至少2次检查显示血小板计数减少，血细胞形态无异常。(2)脾脏一般不增大。(3)骨髓检查：巨核细胞数增多或正常、有成熟障碍。(4)以下5项中应具有其中1项：泼尼松治疗有效；切脾治疗有效；PAIgG增多；PAC3增多；血小板寿命缩短。(5)须排除其他继发性血小板减少症。
1.2.2 中医诊断依据ITP中医证型标准参照国家中药管理局“十一五”重点专科协作组紫癜病证候分型，病例辨证分型由2名副高以上职称医师完成。(1)血热妄行证。主症：出血(肌肤紫斑、鼻衄、齿衄、或月经过多)量多，色红。 次症：①起病急骤；②发热、烦渴；③中脘胀满，或关节腰腹疼痛；④小便黄赤；⑤大便干结；⑥舌质红，苔黄或黄腻；⑦脉滑数或弦数。(2)气不摄血证。主症：肌肤斑色淡红。 次症：①鼻衄、齿衄、肌衄，月经量多；②病程较长，时发时止，稍劳即发； ③神疲乏力，头晕，气短，自汗；④面色苍白或萎黄；⑤食少，便溏或便干不爽；⑥舌质淡，苔薄白；⑦脉濡细。(3)阴虚火旺证。主症：肌肤斑色鲜红或紫暗。 次症：①起病缓慢，时发时止；②五心烦热、口干、潮热盗汗；③头晕目眩；④腰酸耳鸣；⑤鼻衄，齿衄，月经量多；⑥舌红少津，苔薄或剥；⑦脉细数。
以上3证型均为具备主症+次症①~③中的一项+次症④~⑦中的2项，即可确诊。
1.3 纳入条件 1.3.1 纳入标准(1)符合ITP西医诊断标准、中医证型标准。(2)入选前没有使用或已经停用糖皮质激素及免疫抑制剂2周以上。(3)患者同意接受本项试验，并签署知情同意书。
1.3.2 排除标准(1)继发性血小板减少性紫癜，如结缔组织病、免疫系统疾病、血液系统肿瘤、脾功能亢进等。(2)妊娠期或哺乳期患者。(3)合并有较严重的心肝肾等器质性病变者。(4)有脑出血或较严重内脏出血者。(5)合并其他免疫性疾病者、精神病患者。
1.4 流式细胞术检测Treg细胞和Th17 细胞取所有纳入研究的人员外周血5~10 mL，肝素抗凝。用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMCs)，调整细胞密度为1×107/mL。(1)取PBMCs悬液100 μL，分别加入HRP-CD3、FITC-CD4及PE-CD25，混匀，温室避光孵育15 min，加入破膜剂200 μL，混匀，温室避光孵育15 min，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，上流式细胞仪检测。(2)另取PBMCs悬液100 μL，加入FITC-CD4，混匀，室温避光孵育15 min，加入破膜剂200 μL，混匀，室温避光孵育15 min，再加入PE-IL17A 10 μL，混匀，室温避光孵育15 min，PSB洗涤3次后，上流式细胞仪检测。检测结果分别以Treg细胞、Th17 细胞占CD4+ T细胞的百分率表示。
1.5 RT-PCR检测Foxp3和ROR-γt mRNA表达将收集到的外周血样本加入红细胞裂解液，收集白细胞，加入1 mL TRIzol液，充分吹打混匀。22℃条件下静置5 min，加入氯仿0.2 mL，颠倒15 s后，22℃条件下静置3 min。静置液在4℃条件下离心15 min，取上清液0.5 mL，加入0.5 mL异丙醇并混匀。再22℃静置10 min，再次离心10 min，弃上清液，真空干燥5 min。用40 μL DEPC处理水溶解，-80℃保存。以Foxp3和ROR-γt mRNA特异性引物扩增。
1.6 统计学处理采用SPSS 18.0软件进行统计分析。实验数据为非正态分布数据，以中位数(四分位间距)表示，采用多个独立样本两两比较的Nemenyi法进行检验，检验水准(α)为0.05。
2 结 果 2.1 不同中医证型ITP患者血小板计数、Treg细胞水平、Th17细胞水平比较ITP患者92例，阴虚火旺组31例，气不摄血组31例，血热妄行组30例。由表 1可见：ITP患者各证型组血小板计数和Treg细胞水平均低于正常对照组(P<0.05，P<0.01)；在各证型组间，血热妄行组低于阴虚火旺组和气不摄血组(P<0.05，P<0.01)，气不摄血组低于阴虚火旺组(P<0.05)。ITP患者各证型组Th17细胞水平高于正常对照组(P<0.05)；在各证型组间，血热妄行组高于阴虚火旺组和气不摄血组(P<0.05)。ITP患者各证型组Treg/Th17水平低于正常对照组(P<0.05)；在各证型组间，血热妄行组低于阴虚火旺组和气不摄血组(P<0.05)。
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表 1 不同中医证型ITP患者血小板计数、Treg细胞、Th17细胞及ROR-γt、Foxp3 mRNA水平的比较 |
由表 1可见：ITP患者各证型组ROR-γt mRNA水平均高于正常对照组(P<0.01)；在各证型组间，血热妄行组高于阴虚火旺组和气不摄血组(P<0.05)，气不摄血组高于阴虚火旺组(P<0.05)。ITP患者各证型组Foxp3 mRNA水平均低于正常对照组(P<0.05)；在各证型组间，血热妄行组低于阴虚火旺组和气不摄血组(P<0.05)，气不摄血组低于阴虚火旺组(P<0.05)。
3 讨 论ITP既往称为特发性血小板减少性紫癜，以自身免疫紊乱为特征，单独引起血小板减少，而不伴有红系、髓系以及淋巴系的异常[6, 7]。传统观点认为，ITP中血小板减少是由于血小板抗自身抗体促进了血小板的破坏[8]、巨核细胞增生异常以及血小板生成减少[9, 10]。
证据表明T细胞异常表达可能与ITP的发病机制有关，如Th1/Th2比例失衡、Th17细胞和白介素-17(IL-17)水平升高、毒性T淋巴细胞对血小板的破坏等[11, 12, 13]。Treg是一种表面标志为CD4+CD25+Foxp3+的T细胞，约占CD4+ T细胞的5%~10%[14]，具有免疫无能和免疫抑制等功能。ITP患者Treg数量降低，减弱了对自身免疫反应的抑制作用，从而出现了针对自身血小板的免疫反应[15]。Th17细胞是一种不同于Th1、Th2亚群的新型CD4+T细胞亚群，其特征是高分泌IL-17[16],具有独立分化和发育调节机制[17]。Th17分泌的细胞因子IL-17是一种多效性细胞因子，其通过诱导多种促炎因子(如IL-6和TNF-α)和趋化因子来介导组织炎症反应，并且IL-17可招募和刺激中性粒细胞和巨噬细胞导致细胞和组织破坏，促进肿瘤和自身免疫发生[18]。Ji等[4]研究发现，Th17细胞表达在ITP患者中较正常对照组升高。Th17细胞与Treg细胞之间的平衡在免疫稳态中有重要作用[19],ROR-γt和Foxp3是它们各自的特异性转录因子。Th17细胞分化与Treg细胞诱导存在一定的相互排斥的关系，细胞因子TGF-β、IL-6对初始CD4+ T细胞分化为Th17细胞或Treg细胞具有主要调节作用，正常情况下，TGF-β诱导Foxp3表达，使初始CD4+ T细胞分化为CD4+CD25+ Treg细胞，但是当有较高浓度的IL-6存在时，IL-6和TGF-β共同作用诱导转录因子ROR-γt表达，使初始CD4+ T细胞分化为Th17细胞[18]，此时高浓度IL-6则抑制TGF-β诱导的Foxp3表达[18],并且抑制Treg细胞。
本研究发现，在不同证型的ITP患者中，Treg细胞的表达均低于正常对照组，Th17细胞的表达均高于正常对照组，与既往研究结果相一致。Foxp3水平与Treg细胞水平均降低，ROR-γt水平升高，Th17细胞增加，Treg/Th17水平减低。说明ITP患者Treg细胞的生成受到了抑制，并且其特异性转录因子的表达也随之降低，而ROR-γt表达增强，Th17细胞增加，分泌IL-17增多；另一方面由于Foxp3的水平受到抑制，对ROR-γt及Th17细胞的抑制作用减弱，Treg细胞的免疫保护功能受限，两方面的因素均导致体内免疫紊乱，从而导致ITP的发病。
ITP归属于中医学的“血证”、“发斑”范畴。《景岳全书·血证》认为“血动之由，惟气惟火耳”，血证的病因病机高度概括为“气”和“火”。脾主统血，脾气虚则血液失其约束行于脉外，发为紫癜；又火之异常有实火、虚火之分，火热盛可迫血妄行，血溢脉外发为紫癜；阴虚可致火旺，灼伤血络亦能出现紫癜的症状。说明中医证型中气虚、血热、阴虚是ITP不同的致病因素，根据其发病机制不同可将ITP分为血热妄行、阴虚火旺、气不摄血3个证型。本研究证实ITP患者存在Treg/Th17细胞平衡失调，且Treg细胞表达水平、Foxp3 mRNA水平在ITP各证型间的分布规律为血热妄行组＜气不摄血组＜阴虚火旺组；在3组不同的中医证型中，血小板的分布表现出在阴虚火旺、气不摄血、血热妄行证型中递减的趋势。结合ITP病情随着血小板的减少呈现病情加重的情况，可以认为3种中医证型中血热妄行导致的发病其病情较重。这与Treg及Foxp3的表达也是相对应的。
本研究初步探讨了Treg、Th17及Treg/Th17比例失衡在ITP与中医证型中的关系。然而由于样本量的局限，本研究未探讨复杂证型中不同免疫指标分布情况。
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