脑梗死是最常见的脑血管病，梗死后脑组织缺血坏死，再生困难。目前对脑梗死导致的神经功能损伤缺乏有效的治疗手段，仍采取以支持治疗为主的综合治疗方法来改善患者神经功能障碍。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种具有多向分化潜能的干细胞，近年来，MSCs移植治疗脑梗死已成为重要的研究方向。Nogo-A在髓鞘损伤后具有强烈的抑制轴突生长作用^[1]。Nogo-A与其受体NgR结合，介导神经生长抑制作用，是影响神经修复的重要通路^[2]。已有实验证实下调Nogo-A或NgR均可促进脑梗死后神经恢复^[3]。骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植可降低脊髓梗死模型中Nogo-A及NgR的表达，从而减轻神经损伤^{[4, 5]}。但是受到其体积及迁徙能力的影响，MSCs在移植过程中易形成血栓，通过微循环到达病灶发挥作用的细胞数量有限，故其临床应用仍有局限性。

研究发现三维(3-D)水平培养所得球体MSCs能够明显减小MSCs的细胞体积，通过静脉途径移植未发现血管栓塞现象，并且3-D球体培养细胞较普通MSCs归巢效应明显，具有更强的多潜能分化能力^{[6, 7]}。本研究将3-D球体MSCs应用于大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型，观察大鼠脑缺血区(海马区)Nogo-A及其受体NgR的变化规律，探讨胎盘来源MSCs移植对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能恢复的作用，以及对大鼠脑缺血区Nogo-A及其受体NgR的影响。

胎盘来源的3-D球体MSCs为清华大学深圳研究生院培养并传代^{[7, 8]}，用红色荧光染料DiL标记；Nogo-A、NgR PCR引物及兔抗大鼠Nogo-A、NgR单克隆抗体(南京金斯瑞生物科技有限公司)；蛋白质印迹化学发光试剂盒(北京康为生物科技公司)。Centrifuge 5804R型冷冻离心机(德国艾本德生命科学公司)；PCR仪(美国Bio-Rad T100 Thermal Cycler)；Leica CM1860/1860UV冰冻组织切片机(德国Leica公司)。

随机选取健康雄性Wistar大鼠54只，体质量(300±50) g，由山东青岛实验动物中心提供。普通颗粒饲料喂养，饮用自来水。室温控制在14~25℃。随机分为：假手术组(Sham组)、MSCs治疗组(MSCs组)、溶剂处理对照组(Vehicle组)，每组再分为移植后1、3、7 d 3个亚组(n=6)。MSCs组和Vehicle组根据改良Longa等^[9]的方法制备大脑中动脉闭塞(MCAO)模型，造模前大鼠禁食水24 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉,正中颈部切口，分离并暴露左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，结扎ECA及CCA，夹闭ICA远心端。于CCA近分叉处用眼科剪剪一小口。线栓入ICA，深18.0~20.0 mm。缝合皮肤，以插入鱼线成功开始计时，缺血后2 h给予再灌注处理[鱼线外拉约10 mm恢复大脑中动脉(MCA)供血]。Sham组除鱼线不插入颈内动脉外,其余处理同上。对大鼠进行神经功能评分后选取手术成功的模型，MSCs组于再灌注24 h后腹腔注射移植MSCs，细胞含量5×10⁶个；Vehicle组腹腔注射等容量培养液；Sham组不予处理。

再灌注清醒时及移植后1、3、7 d测定大鼠神经运动功能并评分，评分标准如下：0分，无明显神经功能缺损；1分，不能伸展右前肢；2分，行走时向右侧旋转；3分，行走时向右侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。再灌注清醒时神经功能评分1~3分者为手术成功模型。

各组大鼠在移植后1、3、7 d进行神经功能评分后，10%水合氯醛腹腔麻醉，打开胸腔，暴露心脏，剪开右心耳，从左心室快速灌注生理盐水，至流出液透明、动物肝脏及肠系膜苍白，继续以4%多聚甲醛灌注，待动物出现四肢肌肉抽搐后停止灌注，开颅取脑，脑组织固定于多聚甲醛中。自大鼠前囟后4.3 mm处向后切取1.5 mm 脑组织(相当于大脑海马区)制作冰冻切片(厚度20 μm),切片用蒸馏水洗2 min，置于尼氏染液中15 min，双蒸水洗涤2次(数秒)，95%乙醇分化约5 s，在显微镜下观察到尼氏体(呈蓝紫色颗粒状或斑片状)后用双蒸水终止分色，常规脱水透明，中性树胶封片。

按照RNA提取试剂盒说明书(康为世纪)制备总RNA，反转录反应按照试剂盒说明书操作，采用三步RT-PCR法测定Nogo-A、NgR mRNA含量。Nogo-A引物序列：上游5′-CGC TGG TGC TTC TGT AGT GC-3′，下游5′-CTT TGT GCT GGG CTA CTG-3′(扩增产物470 bp)。NgR引物序列：上游5′-ACA GTC TTG ACC GTC TCC TCT TGC-3′，下游5′-TGG CTA CGG GTG CGG TTC TT-3′(扩增产物679 bp)。Nogo-A及NgR扩增条件：95℃预变性3 min；94℃变性1 min、56℃退火40 s、72℃延伸1 min，进行30个循环。β-actin引物序列：上游5′-CCT TCC TGG GCA TGG AGT CCT G-3′；下游5′-GGA GCA ATG ATC TTG ATC TTC-3′(扩增产物208 bp)。β-actin扩增条件：94℃预变性5 min； 94℃变性40 s、55℃退火40 s、72℃延伸40 s，进行30个循环。最后72℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统成像，ID Image Analysis Software半定量分析。

取冰冻脑组织梗死区用生理盐水匀浆后，加入蛋白裂解液，离心后取上清液定量，上样量为20 μg，以10% SDS凝胶进行电泳分离，然后将蛋白转移至PVDF膜上。5%脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗(1∶100)，4℃孵育过夜，TBST溶液充分洗膜3次后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10 000)，37℃孵育1 h，TBST溶液洗膜。ECL法发光，放入X线夹片中曝光，显影，然后进行拍照；用Image J软件分析各组蛋白相对比值。

采用SPSS 17.0软件进行数据处理，数据以x±s表示，所得数据经正态分析和方差齐性检验后，组间比较采用单因素方差分析，检验水准(α)为0.05。

冰冻切片荧光显微镜观察DiL标记的移植MSCs细胞，结果(图 1)可见，MSCs组在脑损伤大鼠海马CA1区有红色荧光信号表达，表明MSCs移植入脑组织并存活良好。

图 1 大鼠脑组织海马区标记MSCs分布 Fig 1 Rat hippocampus brain tissue distribution of labeled MSCs MSCs: Mesenchymal stem cells. Original magnification:×100

Sham组神经细胞形态完好，大小一致，分布较密集，细胞内尼氏体含量丰富，分布均匀；Vehicle组神经细胞内尼氏体消失，仅少量细胞可见残留尼氏体；MSCs组较Vehicle组胞内尼氏体增多，肿胀细胞内可见尼氏体分布(图 2)。

图 2 大鼠脑组织海马区神经元尼氏染色 Fig 2 Nissl staining of neurons in rat hippocampus MSCs: Mesenchymal stem cells. Original magnification:×100

Sham组大鼠神经运动功能正常，Vehicle组、MSCs组大鼠均出现右侧肢体功能异常，向右侧(瘫痪侧)旋转、倾倒，提尾悬空可出现右前肢伸展异常。与Vehicle组相比，MSCs组移植后1、3 d神经功能无明显改善，移植后7 d神经功能明显改善，差异有统计学意义(P<0.05，表 1)。

表 1 (Table 1)

表 1 各组大鼠不同时间点神经运动功能评分 Tab 1 Neuromotor function score of each group rats at different time points n=6, x±s Group 1 d 3 d 7 d Sham 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 Vehicle 2.16±0.68* 2.50±0.76* 2.33±0.74* MSCs 2.00±0.81 2.50±0.50 1.83±0.68△ MSCs: Mesenchymal stem cells. *P<0.05 vs Sham group; △P<0.05 vs Vehicle group

表 1 各组大鼠不同时间点神经运动功能评分 Tab 1 Neuromotor function score of each group rats at different time points

结果(表 2)表明：Sham组移植后1、3、7 d Nogo-A mRNA和蛋白表达量均较低；Vehicle组Nogo-A mRNA和蛋白表达量的变化规律为移植3 d后表达量较Sham组增多(P<0.05)，7 d回归正常水平；MSCs组移植后1、3、7 d Nogo-A mRNA和蛋白表达量均低于Vehicle组(P<0.05)。Sham组移植后1、3、7 d NgR mRNA和蛋白表达量均较低；Vehicle组表达量在各时间点均较Sham组增多(P<0.05)；MSCs组的表达量在各时间点均低于Vehicle组(P<0.05)。

表 2 (Table 2)

表 2 各组大鼠脑组织不同时间点Nogo-A及NgR mRNA和蛋白的表达量 Tab 2 mRNA and protein expression of Nogo-A and NgR at different time points in each group n=6, x±s Nogo-A NgR 1 d 3 d 7 d 1 d 3 d 7 d mRNA Sham 0.57±0.26 0.53±0.19 0.56±0.22 0.33±0.18 0.35±0.19 0.36±0.14 Vehicle 0.62±0.20 0.89±0.17* 0.51±0.10 0.43±0.28* 0.73±0.24* 0.73±0.20* MSCs 0.41±0.15△ 0.64±0.24△ 0.30±0.20△ 0.36±0.16△ 0.55±0.35△ 0.52±0.27△ Protein Sham 0.88±0.39 0.88±0.37 0.89±0.26 0.63±0.30 0.68±0.28 0.66±0.26 Vehicle 1.26±0.30* 1.45±0.33* 0.94±0.29 0.86±0.30* 1.16±0.32* 1.16±0.23* MSCs 0.93±0.36△ 1.05±0.38△ 0.84±0.30△ 0.64±0.34△ 0.97±0.22△ 0.86±0.38△ MSCs: Mesenchymal stem cells. *P<0.05 vs Sham group; △P<0.05 vs Vehicle group

表 2 各组大鼠脑组织不同时间点Nogo-A及NgR mRNA和蛋白的表达量 Tab 2 mRNA and protein expression of Nogo-A and NgR at different time points in each group

近年来脑梗死后的神经再生及功能恢复问题备受关注。本研究结果提示胎盘来源的3-D球体MSCs可以改善大鼠脑梗死后的神经功能恢复，机制可能涉及多方面，其中Nogo-A的作用不容忽视。早期神经元再生失败的主要原因是存在Nogo、髓鞘相关糖蛋白(MAG)、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(OMgp)等髓磷脂抑制物的过表达^{[10, 11]}。这3种抑制因子均与相同的受体Nogo受体(NgR)结合^[12]。而Nogo-A是已知最强的轴突再生抑制蛋白^[1]。因此，Nogo-A及其受体NgR的研究已成为热点。Cajal^[13]研究发现，中枢神经系统轴突损伤后开始发芽，但很快发生退变，推测中枢神经系统中存在抑制轴突生长的因子。Nogo-A是中枢神经系统髓鞘磷脂中最重要的一种抑制轴突生长的因子,广泛表达于成年大鼠神经元和少突胶质细胞中。Nogo-A 通过结合NgR激活细胞内RhoA信号通路，抑制神经轴突的生长和诱导生长锥塌陷^[14]。许多研究已证明，应用Nogo-A和NgR拮抗剂降低其表达可以改善神经功能。Liebscher等^[15]发现，应用Nogo-A特异性抗体(IL-1)可以促进脊髓损伤模型恢复。Fischer等^[16]应用NgR阻断剂阻断大鼠Nogo受体后发现可促进轴突再生。

干细胞移植技术是近年来神经再生研究的热点。MSCs具有向外胚层来源的神经系细胞定向分化的潜能，并能分泌多种神经营养因子以促进神经再生^{[17, 18, 19]}；且具有来源广泛，易于采集、制备及保存，避免免疫排斥反应，不涉及社会、伦理及法律等问题的优点^[20]。本研究应用3-D球体MSCs更是克服了普通干细胞体积过大的缺点，使MSCs能够更顺利通过肺循环和血脑屏障，到达病变部位，发挥更强的修复作用。

本研究观察了3-D球体MSCs移植对脑缺血再灌注后脑组织Nogo-A及NgR的表达水平及对缺血再灌注损伤大鼠神经功能的作用。结果显示，移植MSCs出现在大鼠脑组织内，表明3-D球体MSCs顺利通过肺循环及血脑屏障，进入脑组织发挥作用，改善了大鼠神经功能。RT-PCR法和蛋白质印迹法检查结果显示，在Vehicle组的多个时间点Nogo-A表达水平较Sham组增加，其趋势为移植后1 d开始增加，移植后3 d增加较明显，移植后7 d恢复到正常水平，与闫凤霞等^[21]的研究结果一致；而NgR的表达水平在移植后1 d开始增加，移植后3 d增加明显，移植后7 d仍处于较高水平。Nogo-A和NgR的表达水平不同步的原因可能为NgR同时为Nogo、MAG、OMgp的受体。而MSCs组海马中Nogo-A及NgR水平在移植后1、3、7 d均较Vehicle组下降，差异有统计学意义(P<0.05)。结果提示MSCs进入大鼠脑组织后通过下调Nogo-A及NgR的表达从而达到了改善大鼠神经功能的效果。

综上所述，胎盘来源的3-D球体MSCs可以有效保护脑缺血再灌注损伤脑组织，改善神经运动功能，其可能的机制是下调脑梗死后脑组织Nogo-A及其受体NgR的表达。