第二军医大学  2015, Vol. 36 Issue (1): 34-38   PDF    
引用本文
张俊华, 郑配国, 马雪涵, 刘红春, 明亮. 间充质干细胞治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的疗效和免疫调节机制[J]. 第二军医大学学报, 2015, 35(1): 34-38  
ZHANG Jun-hua, ZHENG Pei-guo, MA Xue-han, LIU Hong-chun, MING Liang. Mesenchymal stem cells for treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis and the immunoregulation mechanism[J]. Academic Journal of Second Military Medical University, 2015, 35(1): 34-38 (in Chinese with English abstract)  
间充质干细胞治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的疗效和免疫调节机制
张俊华, 郑配国, 马雪涵, 刘红春, 明亮    
郑州大学第一附属医院检验科, 郑州 450052
收稿日期:2014-05-28     接受日期: 2014-10-30.
基金项目：国家自然科学基金(81172835).
作者简介：张俊华,硕士生.E-mail:zjhfc520@163.com
通信作者(Corresponding author)：刘红春, xingyunerliu@163.com;明亮, jykmingliang@163.com
摘要：目的 观察间充质干细胞(MSC)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的疗效并探讨其免疫调节机制.方法 用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35-55)和弗氏完全佐剂诱导建立C57BL/6小鼠EAE模型,随机分为MSC治疗组和EAE组.分离纯化培养GFP-C57BL/6 小鼠骨髓MSC细胞.在EAE诱导后的第15天,MSC治疗组以每只1×106/400 μL的量经尾静脉注射MSC细胞,EAE组尾静脉注射400 μL PBS.采用临床评分和脊髓组织切片评估小鼠的发病情况,ELISA检测小鼠外周血细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白介素4(IL-4)和转化生长因子β(TGF-β)的含量,流式细胞术分析小鼠脾脏细胞中CD4+Foxp3+T细胞(Treg)的比例变化和GFP+细胞在受体小鼠体内的比例变化.结果 与EAE组相比,MSC治疗组小鼠的临床评分降低(P<0.05); 脊髓组织切片中T细胞浸润减少;血浆中细胞因子IL-4和TGF-β的含量升高,而IFN-γ和TNF-α降低;脾脏细胞中CD4+Foxp3+T细胞(Treg)的比例明显升高.移植10 d后MSC消失.结论 MSC移植对小鼠EAE疗效显著.MSC通过增加血浆中抗炎因子IL-4和TGF-β的含量,降低促炎因子IFN-γ和TNF-α的含量,从而促使原始T细胞向Treg细胞分化,发挥免疫调节作用, 且MSC消失后一段时间仍对EAE有一定治疗作用.
关键词： 间质干细胞     实验性自身免疫性脑脊髓炎     调节性T淋巴细胞     免疫调节    
Mesenchymal stem cells for treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis and the immunoregulation mechanism
ZHANG Jun-hua, ZHENG Pei-guo, MA Xue-han, LIU Hong-chun, MING Liang    
Department of Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan, China
Abstract: Objective To observe the efficacy of mesenchymal stem cells (MSC) for treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and the related immunoregulation mechanism. Methods EAE models of C57BL/6 mice were established with MOG35-55/CFA emulsion and the EAE mice were randomly divided into MSC treatment group and EAE model group. MSCs were purified and cultured from the bone marrow of GFP-C57BL/6 mice. On the 15th day of EAE model establishment, MSCs (1×106/400 μL) were injected via the tail vein for the MSC treated group, and 400 μL PBS were injected for the EAE model mice. Then we recorded the clinical scores and analyzed the pathological changes of spinal cord so as to evaluate the state of EAE in each group. The peripheral blood tumor necrosis factor-α (TNF-α), interferon-γ (IFN-γ), interleukin-4 (IL-4) and transforming growth factor-β (TGF-β) cytokines were evaluated by ELISA. The percent of CD4+Foxp3+ Treg cells and GFP+ cells were analyzed by Flow cytometry. Results Compared with EAE model group, the MSC treated group had significantly decreased clinical score(P<0.05) and less T-cell infiltration in the spinal cord. MSC treated group had increased peripheral blood IL-4, TGF-β and decreased IFN-γ, TNF-α levels. Moreover, the MSC treated group also had greatly increased ratio of CD4+Foxp3+ T cells (Treg). The MSC cells almost disappeared 10 days after transplantation. Conclusion Mesenchymal stem cell transplantation can effectively treat experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. MSC may exert immunoregulation effect through increasing blood anti-inflammatory cytokines (IL-4, TGF-β) and decreasing proinflammatory cytokines(IFN-γ, TNF-α), which can prompt the naive cell differentiation into Treg cells. The effect of MSC remains even after disappearing for a certain time period.
Key words: mesenchymal stem cells     experimental autoimmune encephalomyelitis     regulatory T-lymphocytes     immunoregulation    

间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是具有自我复制、自我更新和多分化潜能的成体干细胞，在体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、软骨、骨、肌肉、肌腱、神经、肝、心肌、胰岛β细胞和内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能[1]。不论是自体还是同种异源的MSC，一般都不会引起宿主的免疫反应,即MSC具有低免疫原性。MSC抑制同种异体T细胞活化和增殖的免疫调节作用也被不断证实[2, 3, 4, 5]。

多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)是髓鞘特异性T细胞介导的自身免疫性疾病，机体产生自身反应性T细胞是MS发病的主要原因[6]。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是MS的理想动物模型。本研究将分离纯化的MSC移植至EAE小鼠模型，观察MSC对EAE的疗效，探讨其免疫调节机制，为MSC治疗自身免疫病的机制研究提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 试剂和仪器

胎牛血清(FBS)为Gibco公司产品；DMEM培养基为Invitrogen产品；髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG35-55；肽序列：Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr- Arg-Ser-Pro-Phe-Ser-Arg-Val- Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys),纯度98%，购于上海吉尔生化公司；弗氏完全佐剂(CFA，灭活结核分枝杆菌含量5 mg/mL)购于上海三踏生物科技有限公司；百日咳毒素(PT)购于北京联立信生物技术有限公司；大鼠抗小鼠抗体anti-CD4-FITC和anti-Foxp3-Flu647均购于eBioscience公司； ELISA试剂盒购于上海科兴生化试剂有限公司；BD FACS Calibur流式细胞仪为美国BD公司产品；石蜡切片机为德国SLEE公司产品；ELISA酶标仪为Bio-Tek公司产品。 1.2 实验动物及分组

6~8周龄的雄性C57BL/6小鼠和GFP-C57BL/6小鼠，体质量20~25 g[北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001]，饲养在河南省实验动物中心SPF级环境中。选用30只C57BL/6小鼠进行EAE诱导，至发病高峰期即诱导后第15天，除去2只死亡的小鼠，随机分为EAE组和MSC治疗组。 1.3 小鼠EAE模型的建立及临床评分标准

小鼠背部皮下多点免疫CFA和MOG35-55的乳化剂(5 mg/mL的CFA与1.5 mg/mL的MOG35-55溶液按等体积混合，使用注射器反复推拉成油包水的乳剂)，200 μL/只，在免疫后第0天和第2天尾静脉注射PT试剂(稀释在200 μL PBS中)，2 μL/只。按照如下标准对小鼠进行临床评分：0分，正常小鼠；0.5分，尾部无力；1.0分，尾部完全瘫痪；1.5分，一后肢无力；2.0分，两后肢均无力；2.5分，一后肢瘫痪，另一后肢无力；3.0分，两后肢均瘫痪；3.5分，部分前肢瘫痪；4.0分，前肢完全瘫痪；5.0分，死亡。 1.4 MSC的分离纯化和移植

颈椎脱臼处死20只正常GFP-C57BL/6小鼠，在无菌条件下剥离小鼠胫骨和股骨，暴露骨髓腔，使用PBS冲洗出骨髓腔中的细胞，394.2×g离心5 min收集细胞，使用含15% FBS的DMEM培养液重悬细胞，调整细胞密度为1×106/mL，放置在37℃、5%CO2培养箱中进行培养。4 h后换液，去除未贴壁的细胞，之后每12 h换液1次，3 d后显微镜下观察贴壁细胞的铺满率，若＞80%就用胰酶消化进行传代培养。 MSC传代培养至第5代，镜下观察MSC纯度达95%。EAE诱导后的第15天，使用胰酶消化重悬MSC，调整MSC悬液的浓度，以每只1×106/400 μL的量经尾静脉注射至MSC治疗组小鼠体内。同时EAE组小鼠经尾静脉注射400 μL PBS作为对照。 1.5 脊髓组织病理切片分析

MSC移植后第15天，随机选取EAE 组和MSC治疗组小鼠各3只。用20 g/L戊巴比妥钠0.1 mL麻醉小鼠，用40 g/L多聚甲醛进行心脏灌注，解剖取出小鼠的脊髓。置于4%多聚甲醛中固定24 h后，送至郑州大学第一附属医院病理科进行切片及H-E染色。 1.6 ELISA检测血浆细胞因子的含量

MSC移植后第15天，各组小鼠取5只进行尾静脉取血，按照ELISA试剂盒说明书的要求检测血浆中细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白介素4(IL-4)和转化生长因子β (TGF-β)的含量。 1.7 流式细胞术分析Treg和MSC在受体小鼠体内的变化

MSC移植后第2天和第10天，分别颈椎脱臼处死小鼠3只，取出脑和脊髓，使用Ficoll分离液提取单个核细胞，采用流式细胞术检测GFP+细胞的比例。MSC移植后第15天，处死小鼠并获取脾脏细胞悬液，计数脾脏细胞数1.5×106，标记抗小鼠流式抗体CD4-FITC、Foxp3-Flu647，用FlowJo 软件分析两组小鼠脾脏CD4+Foxp3+ T细胞(Treg)的比例变化。 1.8 统计学处理

采用SPSS17.0统计软件进行数据分析，采用GraphPad Prism 5作为作图工具和辅助统计分析工具。计量资料数据用x±s表示，不同组间各指标的比较采用单因素方差分析和t检验，检验水准(α)为0.05。 2 结 果 2.1 MSC移植后对EAE小鼠的治疗效果

EAE诱导后，对EAE组和MSC治疗组小鼠进行临床评分，可见MSC治疗组小鼠的临床评分在MSC移植后的第2天就开始明显降低 (P<0.05)，之后开始缓慢降低(图 1A)。

图 1 间充质干细胞(MSC)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的疗效 Fig 1 Effect of mesenchymal stem cells (MSC) for treating experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) A: The clinical score of the two groups (*P<0.05 vs MSC treated group,n=8,x±s); B: The spinal pathology at 15 d after MSC transplantation (H-E staining,original magnification: ×50,×100 [inclusion])

在MSC移植后第15天，两组小鼠的脊髓组织病理切片结果显示：EAE组小鼠脊髓组织有大量的T细胞浸润，MSC治疗组T细胞浸润情况明显改善(图 1B)。 2.2 MSC移植后对外周血中细胞因子的影响

ELISA结果显示,EAE组小鼠炎症细胞因子TNF-α和IFN-γ的含量高于正常小鼠(P<0.05)；抗炎因子IL-4和TGF-β的表达则明显低于正常小鼠(P<0.05); 与EAE组小鼠相比，MSC治疗组小鼠炎症细胞因子TNF-α和IFN-γ的表达降低(P<0.05)，而抗炎因子IL-4和TGF-β的表达升高(P<0.05)。见图 2。

图 2 ELISA检测间充质干细胞(MSC)移植后15 d实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠外周血中细胞因子的含量 Fig 2 Cytokine contents in peripheral blood of experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE) mice at 15 d after mesenchymal stem cells (MSC) transplantation by ELISA) *P<0.05 vs normal group; △P<0.05 vs EAE group. n=5,x±s
2.3 MSC移植后Treg细胞的比例变化

对小鼠脾脏细胞进行流式细胞术分析，结果显示,与正常小鼠[(11.2±0.4)%]相比，MSC治疗组小鼠脾脏细胞中CD4+Foxp3+ Treg细胞的比例[(19.08±0.33)%]升高(P<0.05)，而EAE组CD4+Foxp3+ Treg的比例[(6.32±0.19)%]稍有下降但差异无统计学意义(P>0.05)。见图 3。

图 3 流式细胞术分析脾脏细胞中CD4+Foxp3+ Treg细胞的比例 Fig 3 Ratio of CD4+Foxp3+ Treg cells in splenic cells as determined by Flow cytometry MSC: Mesenchymal stem cells treated group; EAE: Experimental autoimmune encephalomyelitis group
2.4 MSC移植后MSC在受体小鼠脊髓中的变化

MSC移植2 d后小鼠脊髓单个核细胞中GFP+细胞的比例为(1.82±0.08)%，而10 d后发现GFP+ MSC细胞基本消失(图 4)。

图 4 流式细胞术分析间充质干细胞(MSC)移植2 d和10 d后C57BL/6小鼠脊髓中GFP+细胞的比例 Fig 4 Ratio of GFP+ cells at 2 d and 10 d after mesenchymal stem cell (MSC) transplantation
3 讨 论

MS是一种以中枢神经系统(central nervous system,CNS)脱髓鞘为特征、CD4+T细胞介导的自身免疫性疾病[7, 8]。目前临床上对MS还没有一种有效的治疗方法，主要原因是在对患者进行髓鞘再生和修复的过程中，不能够有效地抑制患者体内自体反应性T细胞的产生[9]。所以研究在治疗MS过程中免疫调节的作用就显得尤为重要。MSC移植是一种潜在的治疗MS患者髓鞘再生和修复的有效手段。有研究发现来源于成人组织的MSC可通过抑制T淋巴细胞浸润CNS，有效地促使神经髓鞘细胞再生，并调节患者的神经炎症和损伤[10]。MSC可通过依赖CCL-2的途径抑制CD4 Th17细胞的生成而发挥对EAE的治疗作用[11]。有学者在研究原始细胞向Th1和Th17细胞分化的过程中，发现MSC通过抑制促炎性T细胞的生成和促使调节性细胞表型的表达，给细胞提供一个免疫反应受抑的生长环境[12]。人类脂肪组织来源的MSC可通过分泌IL-10来抑制APC细胞的功能，缓解CNS的自身免疫性疾病[13]。另外，近几年MSC的神经再生和神经营养作用机制也被学者不断阐述[14]。

本研究通过建立EAE 模型，并在EAE 小鼠发病高峰期进行GFP+ MSC移植，观察EAE 组小鼠和MSC治疗组小鼠的发病情况。数据显示在MSC治疗后第2天小鼠的临床症状明显减轻，之后仍旧以平缓的趋势改善。这些现象与前期报道[15] 一致。MSC移植后第15天，MSC治疗组小鼠血浆中促炎因子TNF-α和IFN-γ的含量明显降低，而抗炎因子IL-4和TGF-β的含量升高(P<0.05)。原始T细胞的分化受到细胞因子的影响，TNF-α和IFN-γ可以促使原始T细胞分化为Th1和Th17等致病细胞；IL-4可促使原始T细胞分化为Th2；TGF-β是促使向Treg细胞分化的主要细胞因子[16, 17]。通过流式细胞术分析发现，EAE组小鼠脾脏细胞中Treg细胞在CD4+ T细胞中的比例由正常小鼠的(11.2±0.37)%下降至(6.32±0.19)%；而MSC治疗组小鼠脾脏细胞中Treg的比例升高至(19.08±0.33)%。但是关于TGF-β升高是引起Treg细胞升高的原因还是结果，仍需进一步探讨。另外，本研究还发现，在MSC移植后第2天，小鼠CNS中仍存在GFP+细胞，但是10 d后，GFP+细胞基本消失，初步推测MSC在小鼠体内会随着时间的推移逐渐被吞噬掉，详细机制需要进一步研究。但是，我们继续观察至MSC移植后15 d，发现MSC治疗组小鼠的疾病症状仍旧在缓慢改善。对于这一现象，我们认为可作如下解释：MSC可以促使小鼠分泌细胞因子，而这些细胞因子本身就有抗炎作用，另外也可以促使原始细胞向免疫抑制细胞即Treg分化，从而发挥免疫抑制和调节作用；同时MSC的神经营养作用使小鼠受损神经再生和恢复，所以，MSC细胞在体内被吞噬消失后一定时间内，在部分恢复的血脑屏障的保护下致病细胞Th1/Th17不能大量进入CNS。 4 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。

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