近年来，以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)为靶点的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)分子靶向治疗成为晚期非小细胞肺癌(NSCLC)治疗的一种新选择，然而不同患者对靶向药物的治疗反应差别很大，临床研究证明EGFR基因19、21外显子突变阳性的患者有效率在75%左右，可推荐一线靶向治疗^[1]。但晚期NSCLC患者很难获得手术后标本，难以用基因测序法检测基因突变。同时肺癌原发灶与转移灶的异质性也是影响靶向治疗效果的又一因素，目前研究异质性多为转移灶与原发灶的对比研究^[2]，对于支气管肺内转移灶与淋巴结转移灶外显子分布规律的研究未见报道。鉴于EGFR突变多出现于非吸烟者、女性、亚洲人和腺癌患者^[3]，本研究以这类晚期肺癌患者为研究对象，采用内镜下活检获取标本，以扩增阻滞突变系统(ARMS)法检测获得EGFR突变情况以指导临床靶向治疗，并进一步研究EGFR基因突变外显子在转移灶间的分布规律。 1 资料和方法 1.1 一般资料

收集2011年1月1日至2013年12月31日临沂市人民医院经支气管镜检查并经病理确诊的女性原发肺腺癌患者56例，年龄(61.57±9.77)岁，均为非吸烟患者。入选标准：TNM分期ⅢB~Ⅳ期，预期寿命大于3个月，功能状态(PS)评分0~1分；此前未接受过放疗、化疗、手术治疗及EGFR靶向小分子或抗体的治疗；收集的检测标本均为石蜡包埋标本。临床表现为咳嗽、咯血、胸闷、消瘦，胸部CT检查发现肺内占位，支气管狭窄或可见管腔阻塞，胸腔积液或肺门、纵隔淋巴结肿大(直径大于10 mm)，所有患者均行支气管镜检查术，术前完善相关检查，检测血压、心电图(ECG)、血常规、凝血酶原时间(PT)，术前禁饮食6 h。排除标准：(1)严重心脏病患者；(2)呼吸衰竭患者；(3)严重潜在出血患者；(4)拒绝内镜检查患者。 1.2 标本获取

术前行64排螺旋CT检查并用100 mL碘普罗胺300增强扫描，对淋巴结直径大于10 mm 者进行淋巴结穿刺。支气管镜检查发现管腔内支气管壁受侵犯时行内镜下活检，活检钳为一次性活检钳(MTN-BF-18/10-A,南京微创医学科技有限公司)，活检取标本3~5块以上；肺门及纵隔淋巴结肿大患者经支气管针吸活检(transbronchial needle aspiration，TBNA),针吸活检针为一次性WANG氏针(MW319，上海诺帮生物科技有限公司)，针吸活检取约1 cm组织条3条以上。均送病理科检测，经甲醛溶液固定后石蜡包埋行病理切片检测，确诊后患者再检测EGFR 19、21外显子突变情况。 1.3 ARMS-PCR法检测EGFR基因突变

每例活检组织石蜡包埋标本常规切片10 μm厚,取5～6片,置于1.5 mL离心管,分别用二甲苯、无水乙醇进行常规处理后沉淀、烘干。加入200 μL缓冲液和25 μL蛋白酶K震荡混匀，55℃水浴消化过夜,直到样品完全裂解。溶解提出的DNA，振荡混匀，-20℃冰箱保存备用。依照EGFR基因突变检测试剂盒说明书(购自厦门艾德生物医药科技有限公司)，向15 μL待测DNA、阳性质控品、超纯水中分别加入1.5 μL Taq酶，在涡旋器上混匀,然后离心，将混匀的DNA、阳性质控品、超纯水依次取5 μL加入PCR八联管反应条，离心后使用Statagene MX3000P实时荧光定量PCR仪进行扩增及DNA突变检测(引物购自厦门艾德生物医药科技有限公司)。反应条件：第1阶段，95℃ 5 min； 第2阶段，95℃ 25 s、64℃ 20 s、72℃ 20 s，15个循环；第3阶段，93℃ 25 s、60℃ 35 s、72℃ 20 s，26个循环。信号收集：第3阶段60℃时收集FAM和HEX信号,执行实时PCR,保存文件。结果判定：待检测管的FAM信号扩增曲线的Ct值<26,则样品为阳性,若样品的FAM信号扩增曲线的Ct值≥26,则样品为阴性。 1.4 临床疗效评估

根据实体瘤治疗疗效评价标准(response evaluation criteria in solid tumors，RECIST) 进行疗效评价，分为完全缓解(complete response,CR)、部分缓解(partial response,PR)、疾病稳定(stable disease,SD) 和疾病进展(progressive disease,PD)。无进展生存期：疾病进展与否参照RECIST，定义为患者开始治疗至出现疾病进展或末次随访的时间。 1.5 统计学处理

采用SPSS 16.0软件包进行数据分析，组间比较采用χ²检验。采用KaPlan-Meier法进行生存分析,利用Log-rank检验比较组间的无进展生存期差异。检验水准(α)为0.05。

2 结 果 2.1 临床特征及转移特点

肺腺癌患者56例，均为女性，均行支气管镜检查，术前均行胸部CT平扫加强化检查，内镜下支气管内单纯组织活检确诊患者20例，其中合并有胸腔积液的患者9例；单纯淋巴结穿刺活检(TBNA) 28例，其中1例合并胸腔积液；支气管腔内浸润组织及纵隔、肺门淋巴结均活检者8例，无合并胸腔积液者。转移特点(胸部CT特征、支气管镜下表现)和取检方式见表 1。共收集确诊肺腺癌患者病理切片标本64例，其中支气管腔内活检组织病理切片标本28例，淋巴结病理切片标本36例。

表 1(Table 1)

表 1 转移特点与内镜下取检方式 Tab 1 Metastatic characteristics and biopsy methods under endoscope Metastatic characteristics n Biopsy Endobronchial infiltration 20 BF Enlarged mediastinal lymph node 28 TBNA Endobronchial infiltration and enlarged mediastinal lymph node 8 BF,TBNA BF：Biopsy forceps; TBNA: Transbronchial needle aspiration

表 1 转移特点与内镜下取检方式 Tab 1 Metastatic characteristics and biopsy methods under endoscope

分别检测支气管腔内转移标本、淋巴结转移标本EGFR基因19、21外显子突变，发现支气管腔内转移组19外显子突变9例(32.14%，9/28)，21外显子突变3例(10.71%，3/28)；淋巴结转移组19外显子突变4例(11.11%，4/36)，21外显子突变12例(33.33%，12/36)。两组外显子突变阳性率比较见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 两组EGFR基因外显子突变情况 Tab 2 Exons mutation of EGFR gene in the two groups Group N 19 exon 21 exon Mutation Normal Mutation Normal Endobronchial metastasis 28 9(32.14) 19(67.86) 3(10.71) 25(89.29) Lymph node metastasis 36 4(11.11) 32(88.89) 12(33.33) 24(66.67) P value 0.038 0.000 EGFR: Epidermal growth factor receptor

表 2 两组EGFR基因外显子突变情况 Tab 2 Exons mutation of EGFR gene in the two groups

28例支气管腔内转移标本、淋巴结转移标本19、21外显子突变阳性患者中，1例患者因年龄偏大、体质差拒绝靶向治疗或化疗，2例患者优先选择化疗，25例患者一线给予口服吉非替尼250 mg/d长期服用(其中1例因明显的胃肠道反应退出)。共24例纳入临床疗效评估，其中支气管腔内转移患者10例(19外显子突变8例，21外显子突变2例)，临床疗效CR 1例(10%),PR 3例(30%),SD 5例(50%),PD 1例(10%)，疾病控制率90%(9/10)，中位无进展生存期14.8个月；淋巴结转移患者14例(19外显子突变3例，21外显子突变11例)，临床疗效CR 0例,PR 4例(28.57%),SD 7例(50%),PD 3例(21.43%)，疾病控制率78.57%(11/14)，中位无进展生存期9.2个月。两组疾病控制率差异无统计学意义(P＞0.05)，中位生存期差异有统计学意义(χ²=4.134，P=0.042)。 3 讨 论

晚期NSCLC患者的传统治疗方法是使用含铂二联化疗，但治疗效果已进入平台期，患者受益的维持时间较短，总生存期仅延长2~4个月^[4]，因此针对EGFR的分子靶向治疗成为NSCLC治疗的新途径。临床常用的靶向药物为TKIs，如吉非替尼和厄洛替尼等，但对未经EGFR基因检测的患者靶向治疗有效率仅为10%左右^[5]，EGFR基因突变检测是提高TKIs治疗有效率的重要途径之一。

由于NSCLC患者首次临床诊断时约70%已不可手术切除治疗，在诊断之初约有一半的患者已出现转移^[6]，所以晚期患者很难获取手术后原发灶及转移灶的标本。但晚期肺腺癌易出现淋巴管或支气管肺内转移，常见肺门及纵隔淋巴结肿大；在管腔局部可见沿黏膜转移侵犯管壁或进入管腔，因此晚期腺癌患者内镜检查容易取得支气管内活检组织或淋巴结标本。本研究标本为内镜下活检标本，在明确病理诊断后采取敏感的ARMS-PCR法^[7]检测EGFR基因突变情况，最低要求肿瘤细胞含量在 1% 甚至更低，以初步筛选适合TKI治疗的患者。检测结果提示支气管内转移标本以19外显子突变为主(32.14%)，淋巴结转移标本以21外显子突变为主(33.33%)。此两种外显子突变患者对TKIs治疗反应也有一定的差异，19外显子突变的患者治疗效果好于21外显子突变的患者^[8]，有相同的突变基因但临床特征不同的患者治疗效果也有一定的差异^[9]，另外还有一部分19、21外显子突变患者服用TKIs治疗后仍会进展，考虑与肿瘤的异质性有关^[2]，是导致TKI治疗失败的原因之一。

在亚洲人群中，肺腺癌有一定的异质性，但明显低于欧美患者^[10]。肺腺癌的异质性与易转移有明显的相关性，肺腺癌多以外周病灶分布为主，有多种不同形式的转移，常见转移途径有血源性、淋巴管、支气管内转移等。血源性转移可表现为肺内多发结节，靠近胸膜下；淋巴管途径可表现为癌性淋巴管炎，淋巴结肿大；支气管内转移主要表现为自外膜侧浸润，管壁明显受压呈锥状狭窄。支气管镜下对管腔内转移灶或肿大淋巴结采用不同的活检方式有较高的阳性率^[11]，容易进行EGFR基因检测，从而有利于分析不同转移灶与外显子突变的关系。EGFR基因突变与肿瘤的发生及进展关系密切^[12]，肺腺癌分化越差侵袭力和转移性就越强，TNM分期越晚，出现淋巴结转移灶的可能性越高^[13]；Ⅲ~Ⅳ期肺腺癌患者不同病理亚型检测EGFR突变外显子也不相同^{[14, 15]}，并有不同的转移倾向，病理分化越差EGFR基因突变可能性越小^[16]。肺腺癌患者亦可出现原发灶与转移灶基因突变不一致性，若在靶向治疗前不能被评估，患者可能不会在靶向治疗中受益，尤其晚期肺腺癌伴有淋巴结转移的患者更容易出现EGFR基因突变缺失^[17]，导致靶向治疗失败。因此检测转移灶EGFR突变有助于提高TKIs治疗效果^[18],在不同转移灶中检测到突变基因并明确其分布规律具有重要的临床意义。但肺内不同转移途径导致的转移灶突变基因表达机制仍未明确，不同的转移途径是否与基因突变类型有关，哪类突变基因易于出现转移灶内缺失仍需进一步研究。

早期有关EGFR基因突变的研究集中于原发病灶与转移淋巴结的关系及淋巴结存在突变缺失或与原发灶不一致性^[14]，未能重视不同转移方式转移灶间的EGFR突变基因的外显子情况。本研究证实ⅢB~Ⅳ期女性肺腺癌患者同为转移病灶的支气管内活检物与淋巴结穿刺物外显子突变表达情况存在差异性，19外显子突变较易出现于支气管内转移灶，21外显子突变较易出现于淋巴结转移灶。同时收集的患者的临床特点提示支气管镜发现支气管内转移的患者TKIs治疗效果好于淋巴结转移的患者。但本研究例数较少，尚需大样本研究以进一步明确临床特征与转移灶突变外显子的关系，EGFR突变基因多角度检测将更有利于指导临床靶向治疗。

本研究未能包括男性患者EGFR基因突变在转移灶中的分布情况，因此有一定的局限性，同时研究中没有涉及合并症或并发症对治疗的影响，也是不足之处，有待今后收集大样本进一步研究。 4 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。