随着核辐射在军事、医疗和能源等方面的广泛应用，人类受照射的概率大大增加，核辐射潜在风险越来越高。大剂量电离辐射除造成胃肠道^[1]、造血系统^[2]、性腺^[3]等辐射敏感器官损伤之外，还可以导致肾脏损伤及其功能障碍^[4,5]。另外，腹部肿瘤患者在大剂量放疗时极易导致放射性肾炎，其机制主要是电离辐射作用于肾脏细胞尤其是肾小管上皮细胞(HK-2细胞)，通过直、间接作用导致细胞损伤进而产生一系列病理改变，最终致使肾脏功能衰竭^[5,6]。然而，对于放射性肾脏损伤尚无有效治疗手段，重在预防^[7,8]，因此寻找高效、低毒的辐射防护剂对于放射性肾炎的防治具有重大意义。

2007年Ohsawa等^[9]报道，氢气(H₂)具有选择性清除羟自由基(·OH)和过氧化亚硝基阴离子(ONOO^-)的生物活性，显示较强的抗氧化效应。本课题组前期研究发现，富H₂溶液对整体动物及细胞具有较好的辐射防护效果，并能减轻免疫系统、生殖系统、造血系统和心肌组织的辐射损伤^{[10,11,12,13]}。国外学者也报道氢气可减轻放射性肺损伤^[14]，但是关于富H₂溶液对放射性肾脏损伤的防护作用的研究还未见报道。本研究以HK-2细胞为研究对象，观察饱和富H₂溶液对HK-2细胞的辐射防护效果，初步探讨富H₂溶液的辐射防护作用机制，为新型辐射防护剂的研究提供理论和实验基础。

1 材料和方法 1.1 材料

HK-2细胞购自上海拜力生物科技有限公司，Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡试剂盒、丙二醛(MDA)检测试剂盒购自上海碧云天公司，MEM培养基和胎牛血清购自美国PAA公司。2-[6-(4’羟基)苯氧基-3H-占吨醇-3-on-9-yl]-苯甲酸[羟苯基荧光素(HPF)荧光探针]购自日本Daiichi公司。流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司，使用奥林巴斯BX60荧光显微镜进行观察，用第二军医大学辐照中心⁶⁰Co辐射源进行照射。

采用特种装置，先将磷酸盐缓冲液(PBS)内充入纯H₂，在加压仓内高压(0.4 MPa)下放置4 h以上，以便使H₂充分溶解，使其达到饱和状态。利用液体H₂浓度测试电极(Biogas Analyzer Systems-1000,Mitleben,日本)进行浓度测试，检测发现制备的富H₂溶液中H₂达到过饱和浓度(0.814 mmol/L)。

HK-2细胞用含10%胎牛血清的MEM培养液，在37℃、5% CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中培养。将对数生长期的HK-2细胞分为对照组、H₂组、照射组和照射加H₂组。细胞照射前，H₂组和照射加H₂组细胞离心后各加入5 mL的富H₂溶液，对照组和照射组加入等量无H₂的PBS溶液，孵育10 min后，照射组和照射加H₂组分别同时给予6 Gy ⁶⁰Co γ射线照射,照射时间为325 s。细胞照射后继续培养，用于后续实验。

各组细胞照射后，进行计数，将细胞悬液以200个细胞/孔的密度加入至每孔含有2 mL MEM培养液的6孔板中。每天观察细胞的生长情况，当细胞集落生长到一定程度时(肉眼可见克隆时，本实验为第10天)终止培养。甲醇固定10 min，吉姆萨应用液染色20 min，流水洗净，空气干燥后进行克隆计数分析。

采用Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡试剂盒，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。照射后24 h，将细胞制成5×10⁶/mL的细胞悬液，PBS洗2次弃上清，加入50 μL PBS重悬。每50 μL体系加入1.5 μL Annexin Ⅴ-FITC温室避光孵育15 min，再加入2 μL PI，5 min后上机检测^[10]。

收集各组细胞，裂解并高速离心后取适量上清液，应用比色法检测MDA。根据试剂盒说明书计算MDA含量。

各组细胞照射前加入HPF(终浓度为10 μmol)，用6 Gy γ射线照射后,37℃孵育15 min。荧光显微镜下观察并拍照。用IPLabSpectrum图像分析软件(版本4.0，美国Scanalystics公司)对单个细胞中的HPF平均荧光强度进行定量分析。每次实验各剂量组随机选取5个不同的视野，随机检测50个细胞的荧光强度值^[10]。

所得数据以 x ±s 表示，采用SPSS13.0软件进行统计学分析，组间比较采用方差齐性的成组t检验。检验水准(α)为0.05。

2 结 果 2.1 富H₂溶液增加HK-2细胞照射后存活率

照射后第10天计数各组细胞克隆形成率，结果显示：照射加H₂组HK-2细胞克隆形成率明显高于照射组(图 1)，差异具有统计学意义(P<0.05),说明富H₂溶液对HK-2细胞有一定的辐射防护作用。

图 1

Fig 1

图 1 富H2溶液明显提高HK-2细胞照射后克隆形成率 Fig 1 Hydrogen-rich saline notably enhanced the cloning efficiency of irradiated HK-2 cells *P<0.05; n=6,

照射后24 h，检测各组的细胞凋亡水平。结果显示，两照射组的细胞凋亡率高于对照组及H₂组，而照射加H₂组的细胞凋亡率明显低于照射组，具有统计学差异(P<0.01，图 2)，表明富H₂溶液能减轻辐射诱导的细胞凋亡。

图 2

Fig 2

图 2 富H2溶液抑制辐射诱导的HK-2细胞凋亡 Fig 2 Hydrogen-rich saline inhibited irradiation-induced apoptosis of HK-2 cells A: Descriptive outcome；B: Quantitative outcome. **P<0.01; n=6,

MDA可以间接反映辐射对生物脂质的损伤，照射加H₂组HK-2细胞的MDA水平明显低于照射组，差异具有统计学意义(P<0.05，图 3)，说明富H₂溶液降低了辐射诱导的MDA水平，提示其具有抗氧化作用。

图 3

Fig 3

图 3 富H2溶液能减少辐射导致的MDA的产生 Fig 3 Hydrogen-rich saline decreased malondialdehyde (MDA) production induced by irradiation *P<0.05; n=6,

γ射线照射可诱导·OH的产生，而照射期间用富H₂溶液孵育细胞，明显降低了HK-2细胞中辐射诱导的·OH的水平(P<0.05，图 4)。

图 4

Fig 4

图 4 富H2溶液降低HK-2细胞中辐射诱导的·OH水平 Fig 4 Hydrogen-rich saline decreased ·OH level in HK-2 cells induced by irradiation A: Descriptive outcome; B: Quantization outcome. *P<0.05; n=6,

关于富H₂溶液对放射性肾损伤的防护作用的研究方面，本课题之前未见国内外报道。本研究以HK-2细胞为研究对象，观察了饱和富H₂溶液对HK-2细胞的辐射防护效果，并且初步探索了其辐射防护作用机制，具有重要的科学意义。

过去大部分学者一直认为H₂是一种生理性惰性气体,像氮气一样不与体内任何物质发生反应^[15,16]。然而近年来研究发现，H₂可以清除体内的细胞毒性氧自由基^[9]。有关富H₂溶液对小鼠造血干细胞、胃肠道细胞、肺细胞等的辐射防护效应研究结果支持其辐射防护效果^[12,14,17]。同时，人体肠道细菌不断地产生H₂并在血液中循环，说明少量H₂对人体无毒副作用。H₂是易燃气体，具有一定的危险性，将其溶于各种溶剂中再予以使用则解决了这一问题。

电离辐射对机体的损伤主要分为直接损伤和间接损伤，尤以间接损伤占据主导地位，通过水等的辐射产物(如·OH等)引起生物大分子的损伤，辐射损伤中60%~70%是由于·OH所致^[9,18]。因而辐射防护的重点主要是针对间接损伤，即通过清除辐射产生的自由基，提高机体的抗辐射能力，从而保护机体组织和器官免受伤害。电离辐射作用于机体之后，产生诸如超氧阴离子(O₂^-)、过氧化氢(H₂O₂)、·OH及一氧化氮(NO)等活性氧自由基(ROS)或活性氮自由基(RNS)等，从而对生物大分子造成损伤^[11]，这是间接辐射损伤的核心机制。鉴于此，针对电离辐射损伤的发生机制，寻找高效、低毒、使用方便的自由基清除剂，是探索新型辐射防护剂的有效途径，是目前国内外辐射防护领域的重要研究思路之一。

我们通过富H₂溶液对HK-2细胞的防护实验发现，在6 Gy照射时，照射加H₂组于照射后10 d HK-2克隆形成率较照射组有明显升高(P<0.05)。Annexin Ⅴ-FITC/PI双染检测细胞早期凋亡率分析结果也发现，照射加H₂组较照射组HK-2细胞早期凋亡率降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。这些结果表明富H₂溶液可以减轻HK-2细胞的辐射损伤，增加其存活率；而前期研究发现，富H₂溶液对机体其他组织细胞有较为明确的辐射损伤防护效应^{[12,13,14,15,19,20]},提示富H₂溶液对肾脏辐射损伤的改善可能有一定的积极作用。

生物脂质是ROS的主要攻击目标之一，脂质氧化物如MDA、硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARs)等的增多反映出脂质受到氧化损伤^[21]。HK-2细胞受照射后MDA显著增高，但是在照射前给予富H₂溶液处理，细胞内的MDA水平显著降低。说明富H₂溶液可以有效降低辐射诱导的脂质过氧化产物，即减轻生物脂质的氧化反应。细胞膜和大多数细胞器均具有膜结构，其中主要组成部分是脂质，本结果说明富H₂溶液可以有效减轻生物脂质的辐射损伤，从而保证其生物学功能的正常发挥。

HPF是Setsukinai等合成的一种选择性极高的测定·OH的新型荧光探针，它选择性地、剂量依赖式地与·OH发生特异性反应，生成一种强荧光复合物，能够抵抗光诱导的自动氧化反应；而且，HPF不与O₂^-、H₂O₂、单线态氧等其他活性氧发生反应^[22]，这些优点更有利于快速、准确地定量分析细胞内的·OH^[11]。本研究发现，照射组和照射加H₂组经6 Gy剂量照射后，照射加H₂组的HPF荧光强度明显低于照射组，提示富H₂溶液可以降低照射后HK-2细胞内的·OH含量。因此我们认为富H₂溶液通过及时清除辐射引起的自由基与阻断氧化效应，减轻辐射引起的一系列生物学损伤，从而对受照射细胞发挥保护作用。

综上所述，富H₂溶液对HK-2细胞具有较好的辐射防护作用，其作用机制可能与氢气清除自由基以及抗氧化活性有关，提示富H₂溶液有可能成为放射性肾损伤的新型防护剂，具有较大应用前景。

4 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。