肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其中75%～80%为非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer，NSCLC)，5年总生存率约10%～15%^{[ 1 ]}。由于肺癌的早期发现率低，多数NSCLC患者确诊时即为晚期，已失去手术治疗的机会，放化疗成为其主要治疗手段，但放化疗普遍存在的毒副反应通常又令多数患者望而生畏^{[ 2 ]}。随着对肿瘤发病机制及其生物学行为研究的不断深入，针对这些发病机制的信号转导通路小分子抑制剂或单克隆抗体已逐步进入临床，人们越来越多地把焦点聚向以特异性高、不良反应轻为特点的分子靶向治疗。目前临床较常用的肺癌分子靶向治疗有针对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)突变的小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)和西妥昔单抗(Cetuximab)。这些单克隆抗体可以阻断EGFR介导的信号转导，从而抑制肿瘤细胞的生长、抑制肿瘤细胞生命周期的延长、抑制肿瘤侵入周围组织和促进肿瘤细胞的凋亡^{[ 3 ]}。近期发现NSCLC患者中存在除EGFR突变、K-ras突变之外的另一个重要的TKI作用靶点——EML4-ALK融合基因，即棘皮动物微管相关蛋白4(echinoderm microtubule associated protein-like 4，EML4)与间变淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)融合基因。这一融合基因表达阳性的肺癌患者可以受益于ALK抑制剂(如克唑替尼)的治疗。有研究提示，在肿瘤转移患者中EML4-ALK融合基因阳性与EGFR-TKI耐药相关^{[ 4 ]}。

1 EML4-ALK的生物学特性

ALK于1994年首先发现于间变性大细胞淋巴瘤AMS3细胞株中^{[ 5 ]}，是由1 620个氨基酸组成的跨膜蛋白，属于胰岛素受体家族。2007年，Soda等^{[ 6 ]}在1例62岁有吸烟史的男性肺腺癌患者的肿瘤组织中首次发现EML4-ALK融合基因。 EML4-ALK融合基因的重排发生在2号染色体短臂上的2区1带和2区3带，相隔 10 Mb距离，由ALK基因的3′端与EML4基因的5′端倒位融合形成。在肺癌中，ALK最常见的融合基因即为EML4，EML4-ALK融合基因在大约 3％～11％的NSCLC中发生^{[ 7 ]}。到目前为止，研究人员确认至少存在 9种 EML4-ALK融合基因变异体，分析这些融合基因的结构特点发现，ALK部分均为20号外显子编码细胞内酪氨酸激酶结构基因片段，而EML4部分包括不同外显子的片段基因 (2、6、13、14、15、18和 20号外显子)。其中最常见的是E13；A20(variant 1)和E6a/b；A20 (variant 3)，其发生率分别为33％和29％^{[ 8,9 ]}。

2 EML4-ALK融合基因检测方法

目前EML4-ALK融合基因检测常用的方法有免疫组织化学法(IHC)、荧光原位杂交法 (FISH)和反转录聚合酶链反应法(RT-PCR)。RT-PCR最早用于EML4-ALK融合基因的检测，该方法快速灵敏，应用范围广，不但可同时检测多个已知亚型，还可以结合测序技术发现新的亚型，可以对石蜡包埋组织进行测定，其不足之处是扩增带来的假阳性难以避免^{[ 10 ]}。IHC法优势是检测肿瘤特异性抗原表达，而不丢失能鉴别正常组织和病理组织的细胞和组织结构特征，具有快速筛选作用，其不足点是ALK蛋白表达结果可能会是微弱的和局部的^{[ 11 ]}，存在一定主观性，对阳性结果须进一步用 FISH等技术来验证。FISH采用探针特异性标记细胞核中ALK断裂点来检测 ALK重排，分离的荧光信号提示存在 ALK重排。其优点是可以从病理切片或细胞涂片上检测少数细胞的融合变异，假阳性率低。目前与ALK融合基因相关靶向药物的实验是以FISH作为入组的诊断方法^{[ 8 ]}。然而FISH结果也会受到一些因素的影响，如标本的固定、烤片温度、蛋白质消化不当等都会造成信号减弱或无信号，且价格昂贵造成其不适合用于EML4-ALK融合基因的筛查。目前没有检测 EML4-ALK融合基因的金标准，以上方法各有优缺点，有一定的互补性，可结合临床获得的各种生物组织标本选择最合适的检测方法。

3 EML4-ALK阳性患者的临床病理特征

EML4-ALK基因阳性患者与EGFR突变患者有相似的临床特征，该融合基因更多发生于男性、不吸烟或轻度吸烟的肺腺癌患者，然而，在大多数情况下，除了极少数例外^{[ 12,13 ]}，EML4-ALK和EGFR基因突变是相互排斥的，患者如具有EGFR突变临床特征但EGFR突变检测为阴性时，约1/3可能携带EML4-ALK融合基因型。EML4-ALK融合基因多表达于肺腺癌，在腺泡样腺癌、乳头状癌和印戒细胞癌中尤为多见，其他组织学类型如鳞癌、腺鳞癌及黏液表皮样癌中也偶见；在亚洲人群中，以腺泡癌为主^{[ 14 ]}。由此可见 EML4-ALK阳性的NSCLC具有独特的分子病理学特征。最新研究提示EML4-ALK融合基因阳性的NSCLC患者可能临床病程较长，预后较好^{[ 15 ]}，但尚需更多病例的观察与比较才能确认。

4 EML4-ALK基因与TKI耐药性的关系

与大多数分子靶向治疗药物一样，克唑替尼(crizotinib)也出现了原发或继发耐药。有研究发现ALK-TKI耐药也与 EGFR介导的旁路途径相关，联合应用 EGFR与 ALK抑制剂可能有效治疗这类NSCLC患者^{[ 16 ]},但缺少大型的临床对照研究。有研究称肿瘤生物学性状的改变是肿瘤发生耐药或进展的常见机制，关于EGFR的不同表达影响肿瘤原发及转移的信息已经被报道^{[ 17 ]}，但关于ALK融合基因的影响仍需进一步研究。Choi等^{[ 15 ]}报道1例EML4-ALK阳性的NSCLC患者，男性，28岁，无吸烟史，肺腺癌，在经过 5个月的克唑替尼治疗后出现了继发耐药，他们对治疗前后的肿瘤基因进行深层测序发现：耐药的产生主要是由于2种独立的突变，一种是融合基因EML4-ALK第4 374位碱基由A替代G，导致位于ALK基因第1 156位的半胱氨酸替代酪氨酸(C1156Y)；另一种是ALK基因第4 493位碱基由C替代A，导致位于ALK基因第1 196位的亮氨酸替代甲硫氨酸(L1196M)。这2种突变可能影响ALK蛋白的结构，阻止药物与蛋白结合从而降低药物克唑替尼的疗效。L1196M 突变通过改变三磷酸腺苷 (ATP)结合位点，阻碍ALK基因与药物结合，从而产生耐药，表达 L1196M突变的细胞要比表达C1156Y突变者耐药更加明显。L1196M 突变的耐药患者可选择 CH5424802,从而阻断 EML4-ALK L1196M 突变所致的细胞生长,用以治疗克唑替尼耐药^{[ 16 ]}。Katayama等^{[ 17 ]}提出可以用比克唑替尼活性更强的ALK抑制剂如 TAE684及AP26113，或是 HSP90抑制剂对NSCLC患者进行治疗；目前C1156Y 的耐药机制尚不清楚。既往的研究认为EML4-ALK融合基因与EGFR突变不共存，但最近有研究发现二者共存^{[ 18 ]}，二者之间有什么关联呢？二者同时发生突变时的治疗方案和疗效如何？这需医学家和科学家共同努力开发出更加有效和毒性更小的抗NSCLC药物。

5 结 语

肺癌的靶向治疗近几年取得了一定的进展，但是大多数肺癌患者的生存时间仍未明显提高。对于肺癌分子基础的不断研究已经使人们对肺癌发生、 发展过程中调控的信号通路网络有了更深入的认识。目前肺癌分子靶点的研究现状主要有：(1)基因突变：EGFR、K-ras、BRAF、HER2等；(2)基因扩增：c-MET、HER2、PDGFRα、FGFR1等；(3)基因融合：EML4-ALK、ROS1、KIF5B-RET等。除此之外，还存在其他未知的或者了解得并不透彻的机制，只有深入充分地了解肺癌的发生、发展及其耐药机制，才能根据不同的肺癌分子改变开发出具有针对性的治疗药物，并有效地应用于特定的患者群体，发展并完善肺癌的个性化治疗。另外还有众多相关靶点如VEGF、IGF-IR、mTOR等同样与NSCLC密切相关。EML4-ALK融合基因检测诊断的方法目前尚无公认的金标准，这些都有待于我们进一步深入研究。

6 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。