第二军医大学  2014, Vol. 35 Issue (8): 884-891   PDF    
引用本文
张林, 富显果, 林宇翔, 兰风华, 王志红. 肾上腺脑白质营养不良蛋白慢病毒载体的构建和表达[J]. 第二军医大学学报, 2014, 35(8): 884-891  
ZHANG Lin, FU Xian-guo, LIN Yu-xiang, LAN Feng-hua, WANG Zhi-hong. Construction and expression of lentiviral vector containing adrenoleukodystrophy gene[J]. Academic Journal of Second Military Medical University, 2014, 35(8): 884-891 (in Chinese with English abstract)  
肾上腺脑白质营养不良蛋白慢病毒载体的构建和表达
张林, 富显果, 林宇翔, 兰风华, 王志红    
厦门大学附属东方医院(南京军区福州总医院)实验科, 福州 350025
收稿日期:2013-12-9     接受日期: 2014-6-3.
基金项目：国家自然科学基金青年基金（31200932），福建省自然科学基金青年创新项目（2012J05158）.
作者简介：张 林，硕士. 现工作于三峡大学人民医院（宜昌市第一人民医院）检验科. E-mail：linleesa@foxmail.com
通信作者(Corresponding author)：王志红 xiaonvwang@163.com
摘要：目的 构建并表达野生型及突变型肾上腺脑白质营养不良蛋白（adrenoleukodystrophy protein，ALDP）的慢病毒载体，探讨ABCD1基因突变对ALDP结构和功能的影响。方法 选择ABCD1基因的H283R和P534R两个突变，首先采用生物信息学方法，进行突变致病性及突变体结构稳定性预测；再利用分子克隆技术，将ABCD1基因克隆到pLEX-MCS慢病毒载体，构建野生型慢病毒载体：pLEX-ABCD1，定点诱变构建2个突变型重组载体：pLEX-ABCD1-H283R和pLEX-ABCD1-P534R，并与其他包装载体共转染293T细胞包装病毒。收集病毒并感染宿主细胞，RT-PCR检测慢病毒感染细胞中野生型与突变型ABCD1 mRNA表达，免疫荧光及蛋白质免疫印迹法分析野生型与突变型ALDP亚细胞定位及表达。结果 生物信息学预测显示H283R和P534R为ALD致病性突变；RT-PCR结果显示慢病毒感染细胞中野生型与突变型ABCD1 mRNA均过表达；免疫荧光及蛋白质免疫印迹结果表明，H283R和P534R突变可能导致ALDP突变体表达量下降，但未观察到ALDP定位改变。结论 成功构建ABCD1基因慢病毒表达载体，并评估了H283R和P534R突变对ALDP表达及亚细胞定位的影响，为深入研究ALD发病机制提供了实验依据。
关键词： ABCD1基因     肾上腺脑白质营养不良蛋白     计算生物学     慢病毒属    
Construction and expression of lentiviral vector containing adrenoleukodystrophy gene
ZHANG Lin, FU Xian-guo, LIN Yu-xiang, LAN Feng-hua, WANG Zhi-hong    
Department of Experimental Medicine, Affiliated Dongfang Hospital, Xiamen University(Fuzhou General Hospital, PLA Nanjing Military Area Command), Fuzhou 350025, Fujian, China
Abstract: Objective To construct a lentiviral vector carrying the wild-type and mutant adrenoleukodystrophy gene(ABCD1) and to investigate the effects of ABCD1 mutation on the structure and function of adrenoleukodystrophy protein(ALDP). Methods Different computational algorithms were used to predict the pathogenicity and the structural stability of ALDP mutants: H283R and P534R. Lentiviral vectors carrying wild type and mutants ABCD1 gene were constructed with pLEX-MCS, namely, pLEX-ABCD1, pLEX-ABCD1-H283R and pLEX-ABCD1-P534R. The recombinant plasmids and two packaging vectors were co-transfected into 293T cells to obtain virus, and the latter was used to infect host cells. The expression of the wild type and mutant ABCD1 mRNA in lentivirus infected cells was detected by RT-PCR. The subcellular localization and expression of the wild type and mutant ALDP were detected by immunofluorescence and Western blotting analysis. Results Bioinformatic prediction results showed that both mutations in this study were at conserved codons, suggesting a pathogenic nature. Overexpression of the wild type and mutant ABCD1 mRNA was detected by RT-PCR in lentivirus infected cells. Immunofluorescence study and Western blotting analysis showed overexpression of the wild type ALDP and lower expression of the mutant ALDP, with no subcellular mislocalization of the mutant ALDP detected. Conclusion We have successfully constructed a recombinant lentiviral vector carrying the ABCD1 gene and assessed the effects of the ABCD1 mutations on the expression and localization of ALDP, providing evidence for understanding the pathogenic mechanism of ALD.
Key words: ABCD1 gene     adrenoleukodystrophy protein     computational biology     lentivirus    

肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy,ALD)是一种最常见的过氧化物酶体病，呈X连锁遗传。该疾病基因——ABCD1基因定位于Xq28，编码的蛋白质称为肾上腺脑白质营养不良蛋白(adrenoleukodystrophy protein,ALDP)。ABCD1基因突变引起ALDP结构改变或功能缺陷，使患者体内极长链饱和脂肪酸(very long chain fatty acids,VLCFAs)不能进入过氧化物酶体进行β-氧化，从而在不同组织和体液中蓄积，引起神经系统脱髓鞘和肾上腺皮质功能减退等病理改变[ 1,2 ]。本研究通过构建野生型及突变型ABCD1基因的重组慢病毒，并检测ALDP在慢病毒感染宿主细胞中的表达及亚细胞定位，为探讨ABCD1基因突变对ALDP结构和功能的影响以及寻求基因治疗策略奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料

慢病毒载体质粒pLEX-MCS、包装质粒pMD2.G、psPAX2由福州总医院泌尿外科实验室王水良博士赠送；大肠杆菌DH5α、XL1-Blue和293A及293T细胞为本实验室保存；限制性核酸内切酶(NotⅠ、MluⅠ、DpnⅠ)购自NEB公司；聚乙烯亚胺(PEI)购自上海源叶生物科技有限公司；质粒抽提试剂盒购自Omega公司；DNA凝胶回收试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；小鼠抗人ALDP单克隆抗体购自Chemicon公司；兔抗人过氧化氢酶多克隆抗体购自Santa Cruz公司；FITC标记山羊抗小鼠IgG、TRITC标记山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。引物合成、测序均由上海生工生物工程技术有限公司完成。

1.2 突变序列的生物信息学分析

采用ClustalW2进行ALDP物种间同源基因多序列比对；采用PhD-SNP[ 3 ]、PolyPhen[ 4 ]、SIFT[ 5 ]等不同算法预测ALDP氨基酸改变与疾病的关系；采用Eris[ 6 ]、I-Mutant[ 7 ]、PoPMuSiC[ 8 ]等不同算法预测ALDP氨基酸改变对蛋白质结构稳定性的影响。 1.3 PCR获取目的基因片段

使用正常人ABCD1 cDNA为模板，设计一对引物，其引物序列为：上游(P201)：5′-ATT T GC GGC CGC ATG CCG GTG CTC TCC AGG CCC CGG-3′，划线处为NotⅠ(GC↓GGCCGC)酶切识别位点；下游(P202)：5′-CG A CGC GT T CAG GTG GAG GCA CCC TGG AGG CCA CC-3′，划线处为MluⅠ(A↓CGCGT)酶切识别位点。PCR条件：95℃预变性2 min；98℃20 s，72℃2 min 30 s，共30个循环；72℃延伸5 min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。 1.4 野生型重组质粒pLEX-ABCD1的构建

NotⅠ、MluⅠ双酶切载体质粒pLEX-MCS及目的基因PCR产物，琼脂糖凝胶电泳回收纯化目的片段。T4 DNA连接酶作用下将双酶切后的ABCD1基因片段与载体质粒16℃连接过夜。CaCl2法转化感受态DH5α菌，涂布含氨苄青霉素的LB选择平板，37℃孵箱过夜。次日随机挑取阳性菌落继续扩增，小量抽提质粒。抽提的质粒一部分经NotⅠ、MluⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测；一部分送上海生工生物工程技术有限公司进行测序鉴定。 1.5 突变型重组质粒的构建

合成定点诱变引物，序列： H283R上游5′-AAG GGG GAG TAC ATG C G C TCG CGT GTG GTG GCC-3′，下游5′-GGC CAC CAC ACG CGA G C G CAT GTA CTC CCC CTT-3′;P534R上游5′-GGT GTG CTC TAC AAG C G C CCA CCC CAG CGC ATG-3′，下游5′-CAT GCG CTG GGG TGG G C G CTT GTA GAG CAC ACC-3′，划线处为诱变的碱基。以已经测序证实ABCD1基因编码区序列完全正确的重组质粒为模板，加入诱变引物，PCR条件：95℃预变性2 min；98℃20 s，70℃20 s，72℃11 min,共20个循环；72℃延伸7 min。扩增重组质粒全长，分别命名为pLEX-ABCD1-H283R和pLEX-ABCD1-P534R。用DnpⅠ内切酶除去野生型的重组质粒模板。重组突变载体转化使用XL1-Blue感受态细胞，突变型重组质粒的鉴定方法同野生型重组质粒。 1.6 重组慢病毒包装及病毒液收集

将pLEX-ABCD1、pLEX-ABCD1-H283R、PLEX-ABCD1-P534R和pLEX-MCS质粒分别与pMD2.G、psPAX2质粒混合，PEI法转染293T细胞。转染48、72和96 h后分别收获含病毒的上清：将培养液移至无菌离心管中，1 500 r/min离心5 min，沉淀细胞碎片，再用孔径为0.45 μm的一次性细胞滤器过滤去除所有的细胞及碎片，收集慢病毒上清液。 1.7 病毒感染宿主细胞及RT-PCR检测

ABCD1 mRNA表达病毒感染293A细胞48 h，实验共分5组:pLEX-ABCD1野生型组、pLEX-ABCD1-H283R突变型组、pLEX-ABCD1-P534R突变型组、pLEX-MCS空载体组及空白未感染组。将病毒液加入DMEM高糖培养液中，制备的混合液直接加入含293A细胞的培养板中。用TRIzol法提取未感染和慢病毒感染细胞的总RNA，反转录成cDNA。ABCD1 RT-PCR引物序列：上游5′-ACT GGC CCT GTC GTT CCG-3′；下游：5′-GTT GCG GGC AAT AGT GAA G-3′；内参照GAPDH引物序列：上游5′-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT -3′，下游5′-TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG-3′。按照TaKaRa公司试剂盒说明进行实时荧光定量PCR，采用2－ΔΔCt方法计算基因相对表达。 1.8 免疫荧光及蛋白质免疫印迹检测目的蛋白表达

免疫荧光观察ALDP亚细胞定位：病毒感染48 h的细胞通过洗涤、固定、通透、封闭后，加入兔抗人过氧化氢酶多克隆抗体(1∶200)和小鼠抗人ALDP单克隆抗体(1∶2 000)，室温反应3 h，洗涤后再加入羊抗兔IgG-TRITC(1∶500)和羊抗鼠IgG-FITC(1∶100)二抗，37℃避光孵育1 h，激光共聚焦显微镜观察目的蛋白表达。

蛋白质免疫印迹检测ALDP的表达：用含1% PMFS的蛋白裂解液提取5组病毒感染细胞的总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒(碧云天p0012)测定蛋白浓度。从不同样品中取出等量蛋白与5×SDS蛋白上样缓冲液混合，并于100℃变性30 min后，各取20 μL进行10% SDS-PAGE。将蛋白转移至PVDF膜上，封闭后加入抗β-actin抗体(1∶1 000)、小鼠抗ALDP单克隆抗体(1∶2 000)与相应的膜共同孵育，洗膜。加入二抗，显色、曝光、显影定影。 1.9 统计学处理

应用SPSS 15 统计软件进行分析，计量资料以±s表示，多样本均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。检验水准(α)为0.05。 2 结 果 2.1 突变序列的生物信息学分析

选择单细胞生物到多细胞生物、低等脊椎动物，再到高等哺乳动物中的几种进化代表性生物，包括酵母、蠕虫、果蝇、斑马鱼、狗、牛、褐鼠、小鼠、人，将ALDP序列进行不同物种间蛋白序列比对，结果发现第283位及第534位(图 1)氨基酸残基在进化上绝对保守。通过PhD-SNP、PolyPhen、SIFT国际认可的3种不同算法预测ALDP氨基酸改变与疾病的关系，结果均提示H283R、P534R为致病性突变(表 1)。采用Eris、I-Mutant和PoPMuSiC国际认可的3种不同算法预测ALDP氨基酸残基改变对蛋白质结构稳定性的影响,Eris和I-Mutant两种算法结果提示H283R突变导致蛋白质结构稳定性降低；I-Mutant和PoPMuSiC两种算法结果提示P534R突变导致蛋白质结构稳定性降低(表 2)。综合以上结果，根据“陪审团”原则，认为突变H283R和P534R会降低ALDP结构的稳定性。

表 1 ALDP突变序列致病性预测 Tab 1 Pathogenicity prediction of adrenoleukodystrophy protein (ALDP) mutants

表 2 ALDP突变体结构稳定性预测 Tab 2 Stability prediction of adrenoleukodystrophy protein (ALDP) mutants

图 1 不同物种间ALDP序列比对 Fig 1 Ortholog alignment of adrenoleukodystrophy protein (ALDP) in different species
2.2 野生型重组载体的构建及鉴定

ABCD1基因PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在2 000~2 500 bp之间出现一条特异性区带，与预期大小(2 258 bp)相符(图 2)。重组质粒经NotⅠ和MluⅠ双酶切后，产生两条带，一条位于10 000~15 000 bp之间，与空载体酶切后片段大小(10 657 bp)相符，另一条位于2 500 bp附近，与目的片段大小(2 258 bp)相符，提示重组质粒含有目的基因ABCD1基因编码区全长，空质粒则未见此条带(图 3)。登录GenBank下载人ABCD1基因cDNA(Z21876)序列，与pLEX-ABCD1测序结果进行比对，可知插入片段读框和方向正确，且酶切位点正确，提示野生型重组载体构建成功。

图 2 ABCD1 cDNA的PCR产物电泳图 Fig 2 PCR identification result of ABCD1 cDNA M：DNA marker；1：PCR product of ABCD1 gene

图 3 野生型重组质粒的NotⅠ/MluⅠ酶切鉴定 Fig 3 Restrictive digestion of pLEX-ABCD1 with NotⅠ and MluⅠ M：DNA marker；1,2：pLEX-MCS before and after digestion,resepectively；3,4：pLEX-ABCD1 before and after digestion,resepectively；5：PCR product of ABCD1
2.3 突变型重组质粒的鉴定

人工诱变的两个PCR产物电泳后，各出现一条特异性区带，位于10 000～15 000 bp之间，与预期的目的片段大小(12 909 bp)相符(图 4)。突变型质粒分别命名为pLEX-ABCD1-H283R和pLEX-ABCD1-P534R。测序结果与人ABCD1基因cDNA序列经DNAMEN软件比对，可知插入片段方向和读框正确，H283R(CAC>CGC)和P534R(CCC>CGC)诱变成功，且从ABCD1基因起始密码子到终止密码子之间未见其他突变(图 5)。

图 4 人工诱导突变体的PCR产物电泳图 Fig 4 PCR identification result of induced mutants M：DNA marker；1：pLEX-ABCD1-H283R；2：pLEX-ABCD1-P534R

图 5 突变型重组质粒部分测序结果 Fig 5 Sequencing result of the mutated recombinant plasmids A：pLEX-ABCD1-H283R(CAC>CGC)； B：pLEX-ABCD1-P534R(CCC>CGC).The position of mutated codon is underlined and the arrows indicate the mutated bases
2.4 RT-PCR检测ABCD1 mRNA表达

慢病毒感染293A细胞48 h后提取总RNA，经反转录成cDNA后，RT-PCR检测ABCD1 mRNA表达。如图 6所示，野生型(pLEX-ABCD1)及突变型(pLEX-ABCD1-H283R、pLEX-ABCD1-P534R)重组慢病毒感染组的ABCD1 mRNA表达水平高于空载体感染组(pLEX-MCS)和未感染组，表明转录水平野生型及突变型ABCD1过表达成功。

图 6 RT-PCR检测慢病毒感染293A细胞ABCD1 mRNA表达 Fig 6 RT-PCR analysis of ABCD1 mRNA expression in lentivirus infected 293A cells *P<0.05 vs other 3 groups. n=3,±s
2.5 免疫荧光双标记分析

激光共聚焦显微镜观察病毒感染后293A细胞中ALDP表达情况及其在细胞中的定位，其中ALDP为绿色荧光标记，过氧化氢酶为红色荧光标记。结果发现，ABCD1野生型重组慢病毒感染的细胞中绿色荧光最强(图 7A)，提示野生型ALDP过表达；两组突变型重组慢病毒感染的细胞中绿色荧光明显减弱(图 7B、7C)；空载体组与未感染组亦有细胞内源性ALDP表达(图 7D、7E)。定位观察发现，各组细胞中的ALDP绿色荧 光均呈点状分布在胞质中，与过氧化氢酶红色荧光位置基本重合，可重叠呈黄色荧光(图 8)。

图 7 免疫荧光法检测ALDP在慢病毒感染293A细胞中的表达 Fig 7 Immunofluorescent analysis of ALDP expression in lentivirus infected 293A cells ALDP: Adrenoleukodystrophy protein. A：pLEX-ABCD1；B：pLEX-ABCD1-H283R；C：pLEX-ABCD1-P534R；D：pLEX-MCS；E：293A. Original magnification: ×200

图 8 蛋白质免疫荧光法检测ALDP在慢病毒感染293A细胞中的表达与亚细胞定位 Fig 8 Immunofluorescent analysis of expression and subcellular localization of ALDP in lentivirus infected 293A cells ALDP: Adrenoleukodystrophy protein. Original magnification: ×400
2.6 蛋白质免疫印迹分析

如图 9所示，野生型或突变型重组慢病毒感染293A细胞后进行蛋白质免疫印迹分析，结果可见：野生型ABCD1过表达慢病毒组的印迹条带最明显，说明构建的野生型ABCD1慢病毒载体可高效表达ALDP，而突变型(pLEX-ABCD1-H283R、pLEX-ABCD1-P534R)重组慢病毒感染组ALDP表达量明显低于野生型组；空载体感染组(pLEX-MCS)及未感染组亦有细胞内源性ALDP表达，且条带亮度与突变型组无明显差异。

图 9 蛋白质免疫印迹法分析ALDP在慢病毒感染293A细胞中的表达 Fig 9 Western blotting analysis of ALDP expression in lentivirus infected 293A cells ALDP: Adrenoleukodystrohy protein. 1：pLEX-ABCD1；2：pLEX-ABCD1-H283R；3：pLEX-ABCD1-P534R；4：pLEX-MCS；5：Non-infected
3 讨 论

人ALDP属于ATP结合盒(ABC)转运蛋白D亚类1号成员(ATP-binding cassette sub-family D member 1,ABCD1)，是一种过氧化物酶体膜蛋白。ALDP具备两个核心结构域：1个位于N端的跨膜结构域(transmembrane domain,TMD)，包含配体结合位点；1个位于C端的核苷酸结合结构域(nucleotide binding domain,NBD)，通过结合和水解ATP为转运VLCFAs提供能量。ALDP首先在游离的多聚核糖体上合成后运送到过氧化物酶体，然后在过氧化物酶体膜上组装成二聚体，负责将胞质中VLCFAs或其衍生物转运到过氧化物酶体内，并在其中进行β-氧化。TMD参与ALDP的定位[ 9 ]，还对稳定ALDP同源二聚体具有重要的作用[ 10 ]，并含有底物结合位点[ 11 ]，该区域的突变可能会影响ALDP定位、二聚体的稳定性或底物的结合与转运；NBD的ATP结合区在VLCFAs的转运过程中起着重要作用，该结构域具有ATP酶活性，通过结合和水解ATP为转运提供能量，NBD保守氨基酸的突变可能引起ATP酶活性的降低或丧失[ 12,13 ]。

根据数据库(www.x-ald.nl)及文献报道，ABCD1基因突变对ALDP的影响主要表现为：70% 以上的ABCD1基因突变导致患者细胞内的ALDP被蛋白酶体降解而无法检测到；另有部分突变尽管不影响ALDP表达量，但ALDP突变体却无法结合或水解ATP[ 13 ]； 部分ALDP突变体无法正确定位至过氧化物酶体膜上[ 9 ]；还有部分ALDP突变体可以到达过氧化物酶体膜上，但不能与配体结合，或无法实现二聚体化[ 14,15 ]，从而无法发挥其正常的转运功能。

本研究选择课题组发现的国际首报新突变H283R与P534R，H283R位于TMD跨膜α螺旋4和5连结区，P534R位于NBD保守基序Walker A和Walker B的连接区。通过对ALDP物种间的同源基因序列进行多重序列比对，发现预测的两个突变氨基酸均呈高度保守，由此推测突变影响ALDP结构及功能的可能性大。根据PhD-SNP、PolyPhen、SIFT等突变致病性预测的计算结果，推测H283R和P534R为ALD致病性突变。由Eris、I-Mutant和PoPMuSiC等不同算法的结果可知，突变H283R和P534R可能会降低ALDP结构的稳定性，导致蛋白质的正常结构被破坏、蛋白质功能活性降低。

本研究利用分子克隆技术，将野生型ABCD1基因的编码区全长插入到载体pLEX-MCS上，成功构建了ALDP的真核重组载体：pLEX-ABCD1，并选择分别位于ALDP的TMD和NBD的突变：H283R和P534R，通过人工诱导突变获得了这2个突变的真核重组载体：pLEX-ABCD1-H283R和pLEX-ABCD1-P534R。将构建好的质粒连同包装系统的两个质粒共转染293T细胞以包装病毒，病毒液再感染宿主细胞，RT-PCR检测ABCD1 mRNA表达：野生型及突变型感染组ABCD1 mRNA表达均明显高于空载体组及未感染组，提示在转录水平，野生型及突变型慢病毒载体ABCD1过表达成功。免疫荧光及蛋白质免疫印迹结果均显示，野生型ABCD1慢病毒载体可高效过表达ALDP，而两突变型组ALDP的表达量明显低于野生型组，与空载体组及未感染组细胞中内源性ALDP的表达量无明显差异。由此可见，突变型慢病毒载体在ABCD1基因的转录水平和翻译水平的结果不同，即在转录水平ABCD1基因过表达，但在翻译水平并未发现ALDP过表达，其表达量仅相当于细胞内源性ALDP水平。我们初步推测，H283R和P534R突变对ABCD1基因转录影响较小，但可能影响转录后的蛋白质合成，主要表现为相应的ALDP突变体不稳定，易被蛋白酶体水解，从而难以甚至无法检测到，因此突变组检测到的ALDP可能主要是细胞内源性ALDP。进一步的ALDP亚细胞定位结果发现，将过氧化氢酶作为定位标志，野生型及两突变型细胞中的ALDP与过氧化氢酶荧光表达位置重合，提示共定位于过氧化物酶体，由此可以推测这两个突变并未导致ALDP定位改变。

ALDP突变体的功能学研究是探讨X-ALD发病机制的重要部分，本研究为进一步研究ABCD1基因突变对ALDP的影响奠定了实验基础，也将为利用慢病毒载体进行基因治疗提供实验依据。本课题组仍在不断优化实验步骤，希望得到更高滴度的病毒，同时也将继续补充与完善相关实验，如增加ABCD1基因突变研究的数量及类型(本课题组已发现10个国际首报错义突变)，并进一步拓展ALDP功能学研究，如测定ALDP突变体的ATP酶活性、找到蛋白酶体水解ALDP突变体的直接证据等。

4 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。

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