肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy,ALD)是一种最常见的过氧化物酶体病，呈X连锁遗传。该疾病基因——ABCD1基因定位于Xq28，编码的蛋白质称为肾上腺脑白质营养不良蛋白(adrenoleukodystrophy protein,ALDP)。ABCD1基因突变引起ALDP结构改变或功能缺陷，使患者体内极长链饱和脂肪酸(very long chain fatty acids,VLCFAs)不能进入过氧化物酶体进行β-氧化，从而在不同组织和体液中蓄积，引起神经系统脱髓鞘和肾上腺皮质功能减退等病理改变^{[ 1,2 ]}。本研究通过构建野生型及突变型ABCD1基因的重组慢病毒，并检测ALDP在慢病毒感染宿主细胞中的表达及亚细胞定位，为探讨ABCD1基因突变对ALDP结构和功能的影响以及寻求基因治疗策略奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料

慢病毒载体质粒pLEX-MCS、包装质粒pMD2.G、psPAX2由福州总医院泌尿外科实验室王水良博士赠送；大肠杆菌DH5α、XL1-Blue和293A及293T细胞为本实验室保存；限制性核酸内切酶(NotⅠ、MluⅠ、DpnⅠ)购自NEB公司；聚乙烯亚胺(PEI)购自上海源叶生物科技有限公司；质粒抽提试剂盒购自Omega公司；DNA凝胶回收试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；小鼠抗人ALDP单克隆抗体购自Chemicon公司；兔抗人过氧化氢酶多克隆抗体购自Santa Cruz公司；FITC标记山羊抗小鼠IgG、TRITC标记山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。引物合成、测序均由上海生工生物工程技术有限公司完成。

1.2 突变序列的生物信息学分析

采用ClustalW2进行ALDP物种间同源基因多序列比对；采用PhD-SNP^{[ 3 ]}、PolyPhen^{[ 4 ]}、SIFT^{[ 5 ]}等不同算法预测ALDP氨基酸改变与疾病的关系；采用Eris^{[ 6 ]}、I-Mutant^{[ 7 ]}、PoPMuSiC^{[ 8 ]}等不同算法预测ALDP氨基酸改变对蛋白质结构稳定性的影响。 1.3 PCR获取目的基因片段

使用正常人ABCD1 cDNA为模板，设计一对引物，其引物序列为：上游(P201)：5′-ATT T GC GGC CGC ATG CCG GTG CTC TCC AGG CCC CGG-3′，划线处为NotⅠ(GC↓GGCCGC)酶切识别位点；下游(P202)：5′-CG A CGC GT T CAG GTG GAG GCA CCC TGG AGG CCA CC-3′，划线处为MluⅠ(A↓CGCGT)酶切识别位点。PCR条件：95℃预变性2 min；98℃20 s，72℃2 min 30 s，共30个循环；72℃延伸5 min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。 1.4 野生型重组质粒pLEX-ABCD1的构建

NotⅠ、MluⅠ双酶切载体质粒pLEX-MCS及目的基因PCR产物，琼脂糖凝胶电泳回收纯化目的片段。T4 DNA连接酶作用下将双酶切后的ABCD1基因片段与载体质粒16℃连接过夜。CaCl₂法转化感受态DH5α菌，涂布含氨苄青霉素的LB选择平板，37℃孵箱过夜。次日随机挑取阳性菌落继续扩增，小量抽提质粒。抽提的质粒一部分经NotⅠ、MluⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测；一部分送上海生工生物工程技术有限公司进行测序鉴定。 1.5 突变型重组质粒的构建

合成定点诱变引物，序列： H283R上游5′-AAG GGG GAG TAC ATG C G C TCG CGT GTG GTG GCC-3′，下游5′-GGC CAC CAC ACG CGA G C G CAT GTA CTC CCC CTT-3′;P534R上游5′-GGT GTG CTC TAC AAG C G C CCA CCC CAG CGC ATG-3′，下游5′-CAT GCG CTG GGG TGG G C G CTT GTA GAG CAC ACC-3′，划线处为诱变的碱基。以已经测序证实ABCD1基因编码区序列完全正确的重组质粒为模板，加入诱变引物，PCR条件：95℃预变性2 min；98℃20 s，70℃20 s，72℃11 min,共20个循环；72℃延伸7 min。扩增重组质粒全长，分别命名为pLEX-ABCD1-H283R和pLEX-ABCD1-P534R。用DnpⅠ内切酶除去野生型的重组质粒模板。重组突变载体转化使用XL1-Blue感受态细胞，突变型重组质粒的鉴定方法同野生型重组质粒。 1.6 重组慢病毒包装及病毒液收集

将pLEX-ABCD1、pLEX-ABCD1-H283R、PLEX-ABCD1-P534R和pLEX-MCS质粒分别与pMD2.G、psPAX2质粒混合，PEI法转染293T细胞。转染48、72和96 h后分别收获含病毒的上清：将培养液移至无菌离心管中，1 500 r/min离心5 min，沉淀细胞碎片，再用孔径为0.45 μm的一次性细胞滤器过滤去除所有的细胞及碎片，收集慢病毒上清液。 1.7 病毒感染宿主细胞及RT-PCR检测

ABCD1 mRNA表达病毒感染293A细胞48 h，实验共分5组:pLEX-ABCD1野生型组、pLEX-ABCD1-H283R突变型组、pLEX-ABCD1-P534R突变型组、pLEX-MCS空载体组及空白未感染组。将病毒液加入DMEM高糖培养液中，制备的混合液直接加入含293A细胞的培养板中。用TRIzol法提取未感染和慢病毒感染细胞的总RNA，反转录成cDNA。ABCD1 RT-PCR引物序列：上游5′-ACT GGC CCT GTC GTT CCG-3′；下游：5′-GTT GCG GGC AAT AGT GAA G-3′；内参照GAPDH引物序列：上游5′-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT -3′，下游5′-TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG-3′。按照TaKaRa公司试剂盒说明进行实时荧光定量PCR，采用2^－ΔΔCt方法计算基因相对表达。 1.8 免疫荧光及蛋白质免疫印迹检测目的蛋白表达

免疫荧光观察ALDP亚细胞定位：病毒感染48 h的细胞通过洗涤、固定、通透、封闭后，加入兔抗人过氧化氢酶多克隆抗体(1∶200)和小鼠抗人ALDP单克隆抗体(1∶2 000)，室温反应3 h，洗涤后再加入羊抗兔IgG-TRITC(1∶500)和羊抗鼠IgG-FITC(1∶100)二抗，37℃避光孵育1 h，激光共聚焦显微镜观察目的蛋白表达。

蛋白质免疫印迹检测ALDP的表达：用含1% PMFS的蛋白裂解液提取5组病毒感染细胞的总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒(碧云天p0012)测定蛋白浓度。从不同样品中取出等量蛋白与5×SDS蛋白上样缓冲液混合，并于100℃变性30 min后，各取20 μL进行10% SDS-PAGE。将蛋白转移至PVDF膜上，封闭后加入抗β-actin抗体(1∶1 000)、小鼠抗ALDP单克隆抗体(1∶2 000)与相应的膜共同孵育，洗膜。加入二抗，显色、曝光、显影定影。 1.9 统计学处理

应用SPSS 15 统计软件进行分析，计量资料以±s表示，多样本均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。检验水准(α)为0.05。 2 结 果 2.1 突变序列的生物信息学分析

选择单细胞生物到多细胞生物、低等脊椎动物，再到高等哺乳动物中的几种进化代表性生物，包括酵母、蠕虫、果蝇、斑马鱼、狗、牛、褐鼠、小鼠、人，将ALDP序列进行不同物种间蛋白序列比对，结果发现第283位及第534位(图 1)氨基酸残基在进化上绝对保守。通过PhD-SNP、PolyPhen、SIFT国际认可的3种不同算法预测ALDP氨基酸改变与疾病的关系，结果均提示H283R、P534R为致病性突变(表 1)。采用Eris、I-Mutant和PoPMuSiC国际认可的3种不同算法预测ALDP氨基酸残基改变对蛋白质结构稳定性的影响,Eris和I-Mutant两种算法结果提示H283R突变导致蛋白质结构稳定性降低；I-Mutant和PoPMuSiC两种算法结果提示P534R突变导致蛋白质结构稳定性降低(表 2)。综合以上结果，根据“陪审团”原则，认为突变H283R和P534R会降低ALDP结构的稳定性。

表 1(Table 1)

表 1 ALDP突变序列致病性预测 Tab 1 Pathogenicity prediction of adrenoleukodystrophy protein (ALDP) mutants nsSNP PhD-SNP PolyPhen SIFT Prediction Reliability index Prediction Prediction Score H283R Disease 6 Probably damaging Affect function 0.00 P534R Disease 6 Probably damaging Affect function 0.00 nsSNP: Non-synonymous coding single nucleotide polymorphism

表 1 ALDP突变序列致病性预测 Tab 1 Pathogenicity prediction of adrenoleukodystrophy protein (ALDP) mutants

表 2(Table 2)

表 2 ALDP突变体结构稳定性预测 Tab 2 Stability prediction of adrenoleukodystrophy protein (ALDP) mutants nsSNP Eris I-Mutant PoPMuSiC Status ΔΔG (kJ·mol-1) Status ΔΔG (kJ·mol-1) Status ΔΔG (kJ·mol-1) H283R Destabilizing 4.35 Decrease －1.09 Stabilizing －5.02 P534R Stabilizing －7.03 Decrease －4.64 Destabilizing 1.88 nsSNP: Non-synonymous coding single nucleotide polymorphism; ΔΔG: Gibbs free energy

表 2 ALDP突变体结构稳定性预测 Tab 2 Stability prediction of adrenoleukodystrophy protein (ALDP) mutants

图 1 不同物种间ALDP序列比对 Fig 1 Ortholog alignment of adrenoleukodystrophy protein (ALDP) in different species

ABCD1基因PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在2 000~2 500 bp之间出现一条特异性区带，与预期大小(2 258 bp)相符(图 2)。重组质粒经NotⅠ和MluⅠ双酶切后，产生两条带，一条位于10 000~15 000 bp之间，与空载体酶切后片段大小(10 657 bp)相符，另一条位于2 500 bp附近，与目的片段大小(2 258 bp)相符，提示重组质粒含有目的基因ABCD1基因编码区全长，空质粒则未见此条带(图 3)。登录GenBank下载人ABCD1基因cDNA(Z21876)序列，与pLEX-ABCD1测序结果进行比对，可知插入片段读框和方向正确，且酶切位点正确，提示野生型重组载体构建成功。

图 2 ABCD1 cDNA的PCR产物电泳图 Fig 2 PCR identification result of ABCD1 cDNA M：DNA marker；1：PCR product of ABCD1 gene

图 3 野生型重组质粒的NotⅠ/MluⅠ酶切鉴定 Fig 3 Restrictive digestion of pLEX-ABCD1 with NotⅠ and MluⅠ M：DNA marker；1,2：pLEX-MCS before and after digestion,resepectively；3,4：pLEX-ABCD1 before and after digestion,resepectively；5：PCR product of ABCD1

人工诱变的两个PCR产物电泳后，各出现一条特异性区带，位于10 000～15 000 bp之间，与预期的目的片段大小(12 909 bp)相符(图 4)。突变型质粒分别命名为pLEX-ABCD1-H283R和pLEX-ABCD1-P534R。测序结果与人ABCD1基因cDNA序列经DNAMEN软件比对，可知插入片段方向和读框正确，H283R(CAC>CGC)和P534R(CCC>CGC)诱变成功，且从ABCD1基因起始密码子到终止密码子之间未见其他突变(图 5)。

图 4 人工诱导突变体的PCR产物电泳图 Fig 4 PCR identification result of induced mutants M：DNA marker；1：pLEX-ABCD1-H283R；2：pLEX-ABCD1-P534R

图 5 突变型重组质粒部分测序结果 Fig 5 Sequencing result of the mutated recombinant plasmids A：pLEX-ABCD1-H283R(CAC>CGC)； B：pLEX-ABCD1-P534R(CCC>CGC).The position of mutated codon is underlined and the arrows indicate the mutated bases

慢病毒感染293A细胞48 h后提取总RNA，经反转录成cDNA后，RT-PCR检测ABCD1 mRNA表达。如图 6所示，野生型(pLEX-ABCD1)及突变型(pLEX-ABCD1-H283R、pLEX-ABCD1-P534R)重组慢病毒感染组的ABCD1 mRNA表达水平高于空载体感染组(pLEX-MCS)和未感染组，表明转录水平野生型及突变型ABCD1过表达成功。

图 6 RT-PCR检测慢病毒感染293A细胞ABCD1 mRNA表达 Fig 6 RT-PCR analysis of ABCD1 mRNA expression in lentivirus infected 293A cells *P<0.05 vs other 3 groups. n=3,±s

激光共聚焦显微镜观察病毒感染后293A细胞中ALDP表达情况及其在细胞中的定位，其中ALDP为绿色荧光标记，过氧化氢酶为红色荧光标记。结果发现，ABCD1野生型重组慢病毒感染的细胞中绿色荧光最强(图 7A)，提示野生型ALDP过表达；两组突变型重组慢病毒感染的细胞中绿色荧光明显减弱(图 7B、7C)；空载体组与未感染组亦有细胞内源性ALDP表达(图 7D、7E)。定位观察发现，各组细胞中的ALDP绿色荧 光均呈点状分布在胞质中，与过氧化氢酶红色荧光位置基本重合，可重叠呈黄色荧光(图 8)。

图 7 免疫荧光法检测ALDP在慢病毒感染293A细胞中的表达 Fig 7 Immunofluorescent analysis of ALDP expression in lentivirus infected 293A cells ALDP: Adrenoleukodystrophy protein. A：pLEX-ABCD1；B：pLEX-ABCD1-H283R；C：pLEX-ABCD1-P534R；D：pLEX-MCS；E：293A. Original magnification: ×200

图 8 蛋白质免疫荧光法检测ALDP在慢病毒感染293A细胞中的表达与亚细胞定位 Fig 8 Immunofluorescent analysis of expression and subcellular localization of ALDP in lentivirus infected 293A cells ALDP: Adrenoleukodystrophy protein. Original magnification: ×400

如图 9所示，野生型或突变型重组慢病毒感染293A细胞后进行蛋白质免疫印迹分析，结果可见：野生型ABCD1过表达慢病毒组的印迹条带最明显，说明构建的野生型ABCD1慢病毒载体可高效表达ALDP，而突变型(pLEX-ABCD1-H283R、pLEX-ABCD1-P534R)重组慢病毒感染组ALDP表达量明显低于野生型组；空载体感染组(pLEX-MCS)及未感染组亦有细胞内源性ALDP表达，且条带亮度与突变型组无明显差异。

图 9 蛋白质免疫印迹法分析ALDP在慢病毒感染293A细胞中的表达 Fig 9 Western blotting analysis of ALDP expression in lentivirus infected 293A cells ALDP: Adrenoleukodystrohy protein. 1：pLEX-ABCD1；2：pLEX-ABCD1-H283R；3：pLEX-ABCD1-P534R；4：pLEX-MCS；5：Non-infected

人ALDP属于ATP结合盒(ABC)转运蛋白D亚类1号成员(ATP-binding cassette sub-family D member 1,ABCD1)，是一种过氧化物酶体膜蛋白。ALDP具备两个核心结构域：1个位于N端的跨膜结构域(transmembrane domain,TMD)，包含配体结合位点；1个位于C端的核苷酸结合结构域(nucleotide binding domain,NBD)，通过结合和水解ATP为转运VLCFAs提供能量。ALDP首先在游离的多聚核糖体上合成后运送到过氧化物酶体，然后在过氧化物酶体膜上组装成二聚体，负责将胞质中VLCFAs或其衍生物转运到过氧化物酶体内，并在其中进行β-氧化。TMD参与ALDP的定位^{[ 9 ]}，还对稳定ALDP同源二聚体具有重要的作用^{[ 10 ]}，并含有底物结合位点^{[ 11 ]}，该区域的突变可能会影响ALDP定位、二聚体的稳定性或底物的结合与转运；NBD的ATP结合区在VLCFAs的转运过程中起着重要作用，该结构域具有ATP酶活性，通过结合和水解ATP为转运提供能量，NBD保守氨基酸的突变可能引起ATP酶活性的降低或丧失^{[ 12,13 ]}。

根据数据库(www.x-ald.nl)及文献报道，ABCD1基因突变对ALDP的影响主要表现为：70% 以上的ABCD1基因突变导致患者细胞内的ALDP被蛋白酶体降解而无法检测到；另有部分突变尽管不影响ALDP表达量，但ALDP突变体却无法结合或水解ATP^{[ 13 ]}； 部分ALDP突变体无法正确定位至过氧化物酶体膜上^{[ 9 ]}；还有部分ALDP突变体可以到达过氧化物酶体膜上，但不能与配体结合，或无法实现二聚体化^{[ 14,15 ]}，从而无法发挥其正常的转运功能。

本研究选择课题组发现的国际首报新突变H283R与P534R，H283R位于TMD跨膜α螺旋4和5连结区，P534R位于NBD保守基序Walker A和Walker B的连接区。通过对ALDP物种间的同源基因序列进行多重序列比对，发现预测的两个突变氨基酸均呈高度保守，由此推测突变影响ALDP结构及功能的可能性大。根据PhD-SNP、PolyPhen、SIFT等突变致病性预测的计算结果，推测H283R和P534R为ALD致病性突变。由Eris、I-Mutant和PoPMuSiC等不同算法的结果可知，突变H283R和P534R可能会降低ALDP结构的稳定性，导致蛋白质的正常结构被破坏、蛋白质功能活性降低。

本研究利用分子克隆技术，将野生型ABCD1基因的编码区全长插入到载体pLEX-MCS上，成功构建了ALDP的真核重组载体：pLEX-ABCD1，并选择分别位于ALDP的TMD和NBD的突变：H283R和P534R，通过人工诱导突变获得了这2个突变的真核重组载体：pLEX-ABCD1-H283R和pLEX-ABCD1-P534R。将构建好的质粒连同包装系统的两个质粒共转染293T细胞以包装病毒，病毒液再感染宿主细胞，RT-PCR检测ABCD1 mRNA表达：野生型及突变型感染组ABCD1 mRNA表达均明显高于空载体组及未感染组，提示在转录水平，野生型及突变型慢病毒载体ABCD1过表达成功。免疫荧光及蛋白质免疫印迹结果均显示，野生型ABCD1慢病毒载体可高效过表达ALDP，而两突变型组ALDP的表达量明显低于野生型组，与空载体组及未感染组细胞中内源性ALDP的表达量无明显差异。由此可见，突变型慢病毒载体在ABCD1基因的转录水平和翻译水平的结果不同，即在转录水平ABCD1基因过表达，但在翻译水平并未发现ALDP过表达，其表达量仅相当于细胞内源性ALDP水平。我们初步推测，H283R和P534R突变对ABCD1基因转录影响较小，但可能影响转录后的蛋白质合成，主要表现为相应的ALDP突变体不稳定，易被蛋白酶体水解，从而难以甚至无法检测到，因此突变组检测到的ALDP可能主要是细胞内源性ALDP。进一步的ALDP亚细胞定位结果发现，将过氧化氢酶作为定位标志，野生型及两突变型细胞中的ALDP与过氧化氢酶荧光表达位置重合，提示共定位于过氧化物酶体，由此可以推测这两个突变并未导致ALDP定位改变。

ALDP突变体的功能学研究是探讨X-ALD发病机制的重要部分，本研究为进一步研究ABCD1基因突变对ALDP的影响奠定了实验基础，也将为利用慢病毒载体进行基因治疗提供实验依据。本课题组仍在不断优化实验步骤，希望得到更高滴度的病毒，同时也将继续补充与完善相关实验，如增加ABCD1基因突变研究的数量及类型(本课题组已发现10个国际首报错义突变)，并进一步拓展ALDP功能学研究，如测定ALDP突变体的ATP酶活性、找到蛋白酶体水解ALDP突变体的直接证据等。

4 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。