第二军医大学  2014, Vol. 35 Issue (6): 603-609   PDF    
引用本文
吉强, 顾星, 周军, 殷月鹏, 陈冬梅, 陈思佳, 董郭平, 高春芳. 原发性肝癌患者甲胎蛋白基因多态性与其在外周血中表达水平的相关性[J]. 第二军医大学学报, 2014, 35(6): 603-609  
JI Qiang, GU Xing, ZHOU Jun, YIN Yue-peng, CHEN Dong-mei, CHEN Si-jia, DONG Guo-ping, GAO Chun-fang. Relationship between α-fetoprotein polymorphisms and peripheral α-fetoprotein level in hepatocellular carcinoma patients[J]. Academic Journal of Second Military Medical Universitya, 2014, 35(6): 603-609 (in Chinese with English abstract)  
原发性肝癌患者甲胎蛋白基因多态性与其在外周血中表达水平的相关性
吉强, 顾星, 周军, 殷月鹏, 陈冬梅, 陈思佳, 董郭平, 高春芳    
第二军医大学东方肝胆外科医院实验诊断科, 上海 200438
收稿日期:2014-4-29     接受日期: 2014-5-23.
基金项目：国家科技重大专项项目（2012ZX10002-016）.
作者简介：吉 强，硕士，主管技师.E-mail：jiqiang999@126.com
通信作者(Corresponding author)：高春芳, Tel:021-81875131, E-mail:gaocf1115@163.com
摘要：目的 探讨原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）基因多态性与外周血AFP水平的相关性。 方法 采用聚合酶链反应和连接酶检测反应法（PCR-LDR）检测我院收治的335例HCC患者AFP基因多个位点多态性并检测AFP血清水平，运用SPSS 13.0软件对结果进行统计学分析。 结果 AFP基因-205 C>G位点GG基因型分布在AFP水平≥20和<20 ng/mL两组间差异有统计学意义（GG vs CC：χ2=4.389，P=0.036），G等位基因分布在AFP水平≥400和<400 ng/mL两组间差异有统计学意义（G vs C：χ2=4.410，P=0.036）。AFP基因intron1 A>T、intron7 A>G、3’UTR A>G和intron2 A>G基因多态性与AFP基因表达水平无密切相关性。 结论 在中国汉族人群HCC患者中，AFP基因-205 C>G位点C等位基因及CC基因型携带者外周血AFP水平明显升高。
关键词： 甲胎蛋白类     单核苷酸多态性     肝细胞癌     乙型肝炎    
Relationship between α-fetoprotein polymorphisms and peripheral α-fetoprotein level in hepatocellular carcinoma patients
JI Qiang, GU Xing, ZHOU Jun, YIN Yue-peng, CHEN Dong-mei, CHEN Si-jia, DONG Guo-ping, GAO Chun-fang    
Department of Laboratory Medicine, Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200438, China
Abstract: Objective To study the relationship between α-fetoprotein (AFP) polymorphisms and peripheral AFP level in hepatocellular carcinoma (HCC) patients. Methods Using polymerase chain reaction-ligation detection reaction (PCR-LDR) technique, we determined the polymorphisms of AFP of 335 HCC patients; the serum levels of AFP were also determined. SPSS 13.0 software was used for statistical analysis. Results The GG genotype frequency of -205 C>G of AFP gene was significantly different between patients with AFP values ≥20 and <20 ng/mL (GG vs CC: χ2= 4.389, P=0.036). The frequency of G allele was also found significantly different between patients with AFP values ≥400 and <400 ng/mL (G vs C: χ2=4.410, P=0.036). No relationship was found between AFP expression and other polymorphisms, including intron1 A>T, intron7 A>G, 3'UTR A>G and intron2 A>G, in AFP gene. Conclusion In HCC patients among Chinese Han population, the C allele and CC genotype of -205 C>G polymorphism site in AFP gene is associated with higher AFP values.
Key words: alpha-different fetoproteins     single nucleotide polymorphism     hepatocellular carcinoma     hepatitis B    

甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)是一种胚胎性肿瘤相关蛋白，自发现至今已有50余年的历史[1]，到目前仍作为肿瘤尤其是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)临床诊断、治疗及预后判断的重要分子标记物[2, 3, 4]。近年来，与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相关肝病的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)研究受到广泛关注，某些特定的SNP可以通过改变基因的功能和表达影响个体对一些疾病的易感性，具体可能在多种途径发挥作用[5]，但有关AFP基因的SNP与HBV相关肝病易感性的研究相对较少。由于AFP在外周血的表达水平与HCC有重要关联，本研究着重分析AFP基因多态性与HCC患者外周血AFP水平的相关性。

1 材料和方法 1.1 研究对象

选取2008年12月至2012年12月在第二军医大学东方肝胆外科医院接受治疗的因HBV感染引发的原发性HCC患者，入选标准:患者的HBV相关HCC诊断基于血清HBV标记物检测和肝组织病理学诊断确诊，均排除其他肝炎病毒感染和酒精、药物等其他原因引起的原发性HCC的可能。共335例，其中男性301例，女性34例；年龄21~78岁，平均(49.7±9.8)岁；Child-Pugh A级326例，B级9例；TNM分期Ⅰ期165例，Ⅱ期59例，Ⅲ期109例，Ⅳ期2例；其中298例(89.0%)合并有不同程度肝硬化。入选患者符合肝癌人群的一般分布特征。选取176例健康体检者作为对照，其中男性140例，女性36例，年龄25~74岁，平均年龄(52.81±8.07)岁。两组研究对象样本量足够(Power>0.8)，其实验室特征见表 1。

表 1 肝癌患者和健康对照实验室指标比较Tab 1 Comparison of clinical data between hepatocellular carcinoma (HCC) and control groups
1.2 AFP基因多态性分析

抽取研究对象全血5 mL，以EDTA抗凝，采用DNA全血抽提试剂盒(Qiagen公司)提取基因组DNA。应用连接酶检测反应(ligation detection eaction，LDR)分型方法[6]检测AFP基因-205 C>G(rs6834059)、intron1 A>T(rs3796678)、intron7 A>G (rs2298839)、3′UTR A>G (rs10020432)和intron2 A>G (rs4640638)[7]基因型。以全血提取物为模板进行PCR反应，引物序列见表 2，特异性检测探针序列见表 3，由上海复星医学科技发展有限公司设计合成。反应体系(20 μL):模板(全血提取基因组DNA)50 ng，Taq DNA聚合酶1 U，1×缓冲液2 μL，2 mmol/L dNTP 2 μL，50 pmol/μL引物0.4 μL，3 mmol/L MgCl2 0.6 μL。反应条件:95℃变性15 min；94℃ 30 s、59℃ 90 s、72℃ 1 min，35个循环；最后72℃ 延伸10 min。LDR反应体系(10 μL):模板(PCR产物)2 μL，Taq DNA连接酶2 U，1×缓冲液1 μL，12.5 pmol/μL各识别探针1 μL。反应条件:95℃ 2 min；94℃ 15 s、50℃ 25 s，30个循环。PCR-LDR产物使用ABI PRISM 377 DNA Sequencer进行检测,用Genemapper软件进行数据分析，由上海复星医学科技发展有限公司提供技术支持。

1.3 血清AFP水平检测方法及分组方法

血清AFP检测采用德国罗氏诊断有限公司MODULAR ANALYTICS E170电化学发光法及配套AFP定量测定试剂盒检测。根据文献资料[8, 9, 10]将血清AFP水平按<20、≥20，<200、≥200，<400、≥400 ng/mL进行分层分析。

1.4 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，多组间样本均数的比较采用方差分析，两组均数的比较采用独立样本t检验，基因频率采用基因计数法计算，组间基因型及等位基因频率的比较及OR值计算采用χ2检验及风险评估。检验水准(α)为0.05。

表 2 引物序列Tab 2 Primer sequences

表 3 探针序列Tab 3 Probe sequences
2 结 果 2.1 AFP基因5个位点各基因型及等位基因分布总体情况

被测人群基因位点各基因型及等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，各基因型及等位基因频率在两组间分布差异无统计学意义。AFP基因5个位点各基因型及等位基因分布总体情况见表 4。

2.2 AFP基因5个位点基因型及等位基因在AFP不同水平的分布 AFP基因-205 C>G位点基因型及等位基因在不同AFP水平人群中的分布见表 5，以正常健康人AFP基因-205 C>G位点常见CC基因型和C等位基因型作为参照，在AFP水平≥20和<20 ng/mL分组中，GG基因型分布在两组间差异有统计学意义(GG vs CC:χ2 = 4.389，P=0.036)，其他均无统计学意义；在AFP水平≥200和<200 ng/mL分组中，GG基因型及G等位基因分布在两组间差异均无统计学意义；在AFP水平≥400和<400 ng/mL分组中，G等位基因分布在两组间差异有统计学意义(G vs C:χ2=4.410，P=0.036)，其他均无统计学意义。其他4个位点intron7 A>G(rs2298839)、 intron1 A>T(rs3796678)、3′UTR A>G(rs10020432)和intron2 A>G(rs4640638) 基因型及等位基因在不同AFP水平人群中的分布见表 6，这4个位点基因型及等位基因在AFP不同水平(<20、≥20；<200、≥200；<400、≥400 ng/mL)分布均无统计学意义。
表 4 AFP基因5个位点基因型及等位基因分布情况Tab 4 Genotype and allele frequencies of 5 AFP gene sites in hepatocellular carcinoma (HCC) and control groups
表 5 不同AFP水平的患者AFP基因-205 C>G位点基因型及等位基因分布Tab 5 Genotype and allele frequencies of AFP gene -205 C>G site in hepatocellular carcinoma (HCC) patients with different serum AFP levels
3 讨 论

AFP是HCC发生发展过程中特异表达的蛋白，有研究表明其具有复杂的生物学功能[11]。AFP是目前临床唯一广泛使用的HCC诊断血清肿瘤标记物，AFP用于HCC高危人群的普查和筛查，使部分患者的术后生存期和预后有了提高[12]。由于AFP基因表达水平与HCC有着重要关联，AFP的SNP与HCC易感性相关研究也成为热点。目前研究多集中在AFP基因表达启动调控区域。Toyota等[13]使用RFLP标记DNA技术发现AFP在25个日本患者c-DNA克隆中存在多态性。Igarashi等[14]从4例患者配对HCC组织、癌旁组织、肝纤维化组织及外周血白细胞研究中发现，近AFP基因启动子区域的两个位点多态性与HCC中AFP基因再次表达无关，但是同时也提示AFP基因存在基因多态性现象。随着新的检测方法出现和SNP概念的明确，Chen等[15]在对AFP基因SNP进行分析时，发现其启动子区域 -330、-401和-692三个位点多态性造成AFP基因血清表达水平的显著改变，并且-692位点的基因多态性与HCC易感性具有相关性。而Suriapranata等[7]研究了印度尼西亚人群中AFP基因上47个SNPs后，发现有6个SNPs与HCC及肝纤维化相关，其中1个(rs6834059)位于基因启动子区域、4个(rs3796678、 rs3796677、rs3796676和rs28532518)位于第一内含子区域，1个(rs4640638)位于第二内含子区域。rs6834059的GG基因型与HCC和肝纤维化的低发生率有相关性(P=0.002 5，P=0.002 6)，而rs3796678的AA基因型，rs3796677、rs3796676和rs28532518的TT基因型，rs4646038的GA基因型与HCC有相关性(P=0.000 5，P=0.000 1，P=0.000 5，P=0.000 2，P=0.012 2)。此外，Suriapranata等[7]还发现rs6834059基因多态性在HCC和肝纤维化病例组都存在GG基因型携带者AFP血清水平低于CC和CG基因型携带者(GG vs CC:P=0.028，P=0.082和GG vs CG:P=0.011，P=0.017)，这也同该基因型与疾病相关性结果相吻合,且进一步研究发现两个位于第七内含子和3′UTR区域的SNPs(rs2298839和rs10020432)与肝纤维化易感性相关，从而提示AFP基因遗传变异与印度尼西亚人群HCC和肝纤维化具有相关性。

表 6 不同AFP水平的患者AFP基因intron7 A>G、intron1 A>T、3′UTR A>G (rs10020432)和intron2 A>G (rs4640638)基因型及等位基因的分布Tab 6 Genotypes and allele frequencies of AFP intron7 A>G,intron1 A>T,3′UTR A>G and intron2 A>G site in hepatocellular carcinoma (HCC) patients with different serum AFP levels

根据文献报道的AFP基因多态性[7]，我们针对中国汉族人群患者选取了-205 C>G、intron1 A>T、intron7 A>G、3′UTR A>G和intron2 A>G 5个位点检测其基因型。我们将所选AFP基因5个位点基因多态性按AFP水平分层分析，发现-205 C>G位点基因型分布在AFP水平阴性(<20 ng/mL)和阳性(≥20 ng/mL)两个分组间差异有统计学意义(GG vs CC:P=0.036)；另外该位点风险基因型分布在AFP水平低水平(<400 ng/mL )和高水平(≥400 ng/mL)两个分组中差异有统计学意义(GG+GC vs CC:P=0.046)，并且该位点携带G等位基因在AFP水平低水平(<400 ng/mL)和高水平(≥400 ng/mL)两个分组分布差异有统计学意义(G vs C:χ2=4.410，P=0.036)。AFP基因-205 C>G位点多态性与AFP血清水平相关性研究结果同Suriapranata等[7]研究结果一致。虽然该位点GG基因型及G等位基因在AFP ≥200 ng/mL与AFP<200 ng/mL两个水平间差异均无统计学意义(GG vs CC:χ2=3.208，P=0.073；G vs C:χ2=3.848，P=0.05)，但是从数据中可看出有此趋势并接近有统计学意义。同时我们根据样本的临床及病理资料参照TNM标准进行分层分析，未发现以上位点基因多态性与HCC的进展具有相关性(资料未显示)。我们的研究表明，AFP基因-205 C>G位点多态性与HCC患者AFP血清水平存在相关性，HCC患者中携带AFP基因-205 C>G位点GG型的较CC型的AFP血清水平显著降低。我们通过JASPAR软件在线预测-205 C>G位点所在序列与转录因子的结合能力，结果发现该位点涉及MafF和MafK因子的结合位点(资料未显示)。这两者都是Maf蛋白家族成员的小Maf蛋白，可以和其他转录因子(如 junlos)形成二聚体来发挥调控作用,激活特定基因的表达[16, 17]。当该位点为G等位基因时，未得到能与任何转录因子结合序列匹配的预测结果，因此我们推测由于-205位点的C>G变异，使得涉及序列失去或降低与Maf因子的结合能力，从而消减了其转录激活作用，使得AFP基因表达量降低。AFP一直作为肿瘤尤其是HCC的重要分子标记物用于临床诊断、治疗及预后判断，但是AFP仅在80%左右成人HCC患者血清中升高，也就是说还有20%左右的HCC患者AFP水平低于cut-off值或升高不明显。有文献报道部分HCC患者直到晚期AFP水平仍呈现阴性[18]。这部分AFP水平低于cut-off值或升高不明显的HCC患者是否由携带AFP基因-205 C>G位点为GG型所引起？这也启发我们在今后的研究中将进行AFP水平阴性或升高不明显的HCC患者与AFP基因-205 C>G位点多态性相关性研究和该位点功能学研究，进一步探讨其内在作用机制。本研究中我们未发现AFP基因其他位点多态性与AFP水平的关系中有统计学意义,未来研究中我们将采取扩大样本等方式继续进行研究分析，并结合随访、疗效等各种信息，充分阐述AFP基因多态性在HCC发生、发展中的作用及对疾病预后的价值。

4 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。

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