第二军医大学  2014, Vol. 35 Issue (6): 610-615   PDF    
引用本文
周新华, 王敏, 姬颜辉, 蒋毅, 刘庆. miRNA-140在早期骨关节炎软骨细胞中的表达规律及功能[J]. 第二军医大学学报, 2014, 35(6): 610-615  
ZHOU Xin-hua, WANG Min, JI Yan-hui, JIANG Yi, LIU Qing. Expression of miRNA-140 in chondrocytes of patients with early osteoarthritis and its function[J]. Academic Journal of Second Military Medical University, 2014, 35(6): 610-615 (in Chinese with English abstract)  
miRNA-140在早期骨关节炎软骨细胞中的表达规律及功能
周新华1, 王敏2, 姬颜辉2, 蒋毅1, 刘庆1    
1. 北京积水潭医院, 北京大学第四临床医学院矫形科, 北京 100035;
2. 第三军医大学新桥医院骨科, 重庆 400037
收稿日期:2013-11-12     接受日期: 2014-5-19.
作者简介：周新华，博士，副主任医师.E-mail：bjzhouxinhua@sina.com
通信作者(Corresponding author)：王敏,Tel:023-68774308,E-mail：bjzhouxinhua@sina.com
摘要：目的 观察早期骨关节炎（osteoarthritis，OA）软骨细胞中miRNA-140的表达规律以及转染ds-miRNA-140对软骨细胞功能的影响。 方法 建立兔OA模型，获得正常软骨细胞（A组）和4周（B组）、8周（C组）OA软骨细胞，应用实时定量PCR和蛋白质印迹法检测各组miRNA-140相对表达量以及Ⅱ型胶原蛋白（Col2a1）和金属蛋白酶13（MMP-13）的表达情况。各组软骨细胞转染ds-miRNA-140后，观察细胞Col2a1、MMP-13的表达情况。 结果 B组、C组软骨细胞miRNA-140的表达和A组相比分别下降到63%和57%（P<0.01），而B组和C组软骨细胞miRNA-140的表达差异无统计学意义（P>0.05）；B、C两组细胞Col2a1 mRNA的表达和A组相比分别减少了52%和63%（P<0.01），B、C两组软骨细胞MMP-13 mRNA的表达和A组相比分别升高了3.01倍和4.15倍（P<0.01）。转染ds-miRNA-140后，B、C两组细胞Col2a1 mRNA的表达分别增加了60%和127%（P<0.01），B、C两组MMP-13 mRNA的表达在转染后是转染前的54.53%和42.61%（P<0.01）。Col2a1和MMP-13蛋白表达水平变化趋势与mRNA一致。 结论 OA早期关节软骨miRNA-140的表达显著减少；转染ds-miRNA-140可增加软骨细胞Col2a1表达，同时降低MMP-13的表达。
关键词： 骨关节炎     miRNA-140     软骨细胞     胶原Ⅱ型     基质金属蛋白酶13    
Expression of miRNA-140 in chondrocytes of patients with early osteoarthritis and its function
ZHOU Xin-hua1, WANG Min2, JI Yan-hui2, JIANG Yi1, LIU Qing1    
1. Department of Orthopaedics, Beijing Jishuitan Hospital, The Fourth Clinical College of Peking University, Beijing 100035, China;
2. Department of Orthopaedics, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China
Abstract: Objective To observe miRNA-140 expression in chondrocytes of patients with early osteoarthritis (OA)and the effect of transfecting double-stranded miR-140 (ds-miRNA-140) on chondrocyte function. Methods Normal and OA chondrocytes (4 weeks and 8 weeks) were collected from rabbit model of early OA (A, B and C group, respectively). Quantitative polymerase chain reaction was used to examine miRNA-140 expression and Western blotting analysis was used to examine Col2a1 and MMP-13 protein expression in each group. Col2a1 and MMP-13 protein expression was also observed in chondrocytes transfected with ds-miR-140. Results Compared with group A, miR-140 expressions in group B and C were reduced to 63% and 57%, respectively (P<0.01); the expression was not significantly different between the group B and C(P>0.05). Compared with group A, Col2a1 mRNA expressions in group B and C were reduced by 52% and 63%, respectively (P<0.01); while MMP-13 mRNA expressions were up-regulated by 3.01 and 4.15 folds, respectively (P<0.01). Transfection with ds-miR-140 increased Col2a1 mRNA by 60% and 127% in group B and C, respectively(P<0.01), and the expressions of MMP-13 mRNA in group B and C were reduced to 54.53% and 42.61%, respectively(P<0.01). The changes of Col2a1 and MMP-13 protein expression were the same as that of mPNA. Conclusion miR-140 expression is reduced in early OA cartilage, and transfection with ds-miR-140 may increase Col2a1 expression and reduce MMP-13 expression.
Key words: osteoarthritis     miRNA-140     chondrocytes     collagen tyep Ⅱ     matrix metalloproteinase 13    

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是多因素所致的软骨退行性病变，疼痛和畸形严重影响了患者的生活质量，目前原因仍不清楚。在骨骼系统，miRNA在蛋白翻译水平精细调控软骨细胞的分化，深刻影响软骨的生长发育[1, 2]。目前研究发现miRNA-140在晚期OA软骨细胞中表达显著降低[2]，但其在早期OA中的表达以及作用尚不清楚。本研究拟观察早期OA软骨细胞miRNA-140的表达规律以及转染外源性双链miRNA-140(ds-miRNA-140)对软骨细胞功能的影响。
1 材料和方法 1.1 动物模型

成年新西兰大白兔20只，雌雄比为1∶1，购自重庆市渝达实验兔场,许可证号: SCXK(渝)2007-0009。 参照Pickarski等[3]的前交叉韧带切断术(anterior cruciate ligament transection，ACLT)方法，制作成年兔OA模型:动物麻醉后右膝关节周围用电动剃刀剪毛，碘伏消毒，做髌骨内侧小切口，将髌骨外翻并屈曲膝关节，显露出前交叉韧带，用眼科剪将其切断，冲洗关节，闭合关节囊和皮肤，肌注抗生素1次。动物自由活动，分笼饲养。以兔右膝关节为实验侧，左膝为正常对照侧，设定模型建立后4周右膝为B组(n=10)，8周右膝为C组(n=10)，左膝自身对照为A组(n=10)。 1.2 细胞培养

兔处死后无菌条件下切开关节收集关节软骨，收集的软骨组织切成1～2 mm3大小的碎片，室温下分别用0.2%胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型胶原酶消化30 min和2 h，将获得的细胞在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液中培养。原代细胞单层培养。 1.3 软骨细胞转染ds-miR-140

采用ds-miR-140序列模拟内源性miR-140。先合成2条RNA寡核苷酸序列5′-CAG UGG UUU UAC CCU AUG GUA G-3′和 5′-ACC ACA GGG UAG AAC CAC GGA C-3′，退火后获得ds-miR-140(由上海吉玛生物公司合成)。按照Lipofectamine 2000(Invitrogen)操作手册进行细胞转染，每次实验使用相同浓度的Silencer Negative Control #1 small interfering RNA (Ambion)转染作为对照。 1.4 实时定量PCR检测miRNA和mRNA的表达

根据TRIzol试剂盒(北京博凌科为生物科技有限公司)说明书提取软骨细胞总RNA。miRNA的检测:取25 ng总RNA，使用茎环结构反转录引物5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACC TAC CA-3′进行反转录反应,然后95℃孵育10 min使反转录酶失活。实时定量PCR在7500 Real-time PCR System (Applied Biosystems,美国)中进行，mi-RNA-140检测的上游引物为5′-GCC TCA GTG GTT TTA CCC TA-3′，下游引物为5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′。

Ⅱ型胶原蛋白(Col2a1)、金属蛋白酶13(MMP-13) mRNA的检测:应用Readyto-Go You-Prime First-Strand Beads (GE Healthcare,英国)试剂盒将总RNA反转录成cDNA。使用TaqMan Gene Expression Assay进行实时定量PCR分析，Col2a1探针为Hs00164004_m1,MMP-13探针为Hs00233992_m1。以U18和GAPDH基因作为内参对照。Col2a1引物序列:5′-TCC TAA GGG TGC CAA TGG TGA-3′ (上游),5′-AGG ACC AAC TTT GCC TTG AGG AC-3′(下游)；MMP-13引物序列:5′-TCC CAG GAA AAT AGC TGA GAA CTT-3′(上游),5′-AAA CCC AAA TGC TTC AAA GAC AG-3′(下游)；GAPDH引物序列:5′-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3′(上游),5′-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3′(下游)；U18引物序列: 5′-GCA GTC CGC ACA CAG TAT CTG ACG ATA GCA-3′ (上游),5′-GCG AGC TCG TCC AAC CGA ATA TA-3′ (下游)。 1.5 蛋白质印迹检测Col2a1和MMP-13蛋白表达

用PBS漂洗软骨细胞，加入适量预冷的细胞裂解液，收集蛋白裂解液至EP管中，超声裂解后，4℃ 2 920×g离心20 min，收集上清。BCA法测定蛋白浓度后，取等量总蛋白(约80 μg)的样品，加入上样缓冲液混匀后100℃变性10 min，上样进行10% SDS-PAGE。电泳结束后使用Bio-Rad Mini湿式转移电泳槽以恒流200 mA转膜2 h至PVDF膜，5%脱脂奶粉(0.1% TBST配制)室温封闭3 h，TBST漂洗3次后加入一抗(Col2a1大鼠抗兔单克隆抗体1∶500，MMP-13大鼠抗兔单克隆抗体1∶500，PIERCE公司)，4℃孵育过夜。TBST漂洗3次后，加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，TBST漂洗3次，ECL显影。以β-actin作为内参对照。 1.6 统计学处理

采用SPSS 13. 0软件进行统计学分析，数据用 x±s表示，组间比较采用t检验，检验水准(α)为0.05。 2 结 果 2.1 OA关节软骨细胞miRNA-140的表达变化

由图 1可见，早期OA关节软骨细胞miRNA-140的表达显著减少，4周(B组)时，下降到正常值(A组)的63%,8周(C组)下降到57%，B、C组和A组比较差异有统计学意义(P<0.01)，B组和C组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图 1各组软骨细胞miRNA-140的表达（定时定量PCR） Figure 1Expressions of miRNA-140 in chondrocytes of each groups as detected by real-time quantitation PCR
2.2 转染ds-miRNA-140对OA关节软骨细胞Col2a1 mRNA和蛋白表达的影响

由图 2可见，B组细胞Col2a1 mRNA的表达量与A组比较降低了52%,C组与A组比较降低了63%，B组、C组和A组比较差异均有统计学意义(P<0.01)，B组和C组之间差异无统计学意义(P>0.05)。A、B、C 3组细胞转染ds-miRNA-140后，A组Col2a1 mRNA的表达未发生明显变化，B组转染后Col2a1 mRNA的表达增加了60%，C组转染后Col2a1 mRNA的表达增加了127%，B、C两组与转染前相比差异均有统计学意义(P<0.01)，而B组与C组转染后Col2a1 mRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05)。

正常关节软骨细胞(A组)Col2a1蛋白表达较多，转染ds-miR-140前后差异不大；OA关节软骨细胞(B、C组)Col2a1蛋白表达减少，但在转染ds-miR-140后表达增加明显(图 3)。

图 2各组软骨细胞col2a1 mRNA的表达（定时定量PCR） Figure 2Expressions of col2a1 mRNA in chondrocytes of each groups as detected by real-time quantitation PCR

图 3各组软骨细胞MMP-13和col2al蛋白的表达（蛋白质印记分析） Figure 3NMP-13 and col2al protein Expressions in chondrocytes of each groups as detected by Western blotting analysis
2.3 转染ds-miRNA-140对OA关节软骨细胞MMP-13 mRNA和蛋白表达的影响

由图 4可见，B组细胞MMP-13 mRNA的表达量和A组比较增加了3.01倍,C组和A组比较增加了4.15倍，B组、C组和A组比较差异均有统计学意义(P<0.01)，B组和C组之间差异无统计学意义(P>0.05)。A、B、C 3组细胞转染ds-miRNA-140后，A组MMP-13 mRNA的表达未发生明显变化，B组转染后MMP-13 mRNA的表达是转染前的54.53%，C组转染后MMP-13 mRNA的表达是转染前的42.61%，B、C两组与转染前相比差异均有统计学意义(P<0.01)，而B组与C组转染后MMP-13 mRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05)。

正常关节软骨细胞(A组)MMP-13蛋白表达量较低，转染ds-miR-140后MMP-13蛋白表达变化不大;B组和C组在转染前MMP-13蛋白表达丰富，尤其C组丰度更大，转染ds-miR-140后B组和C组MMP-13蛋白表达显著降低，接近A组丰度(图 3)。

图 4各组软骨细胞NMP-13 mRNA表达（定时定量PCR） Figure 4Expressions of NMP-13 mRNA in chondrocytes of each groups as detected by real-time quantitation PCR
3 讨 论

OA的发病原因尚不清楚，OA软骨细胞中miRNA的异常变化引起了广泛关注[4, 5, 6, 7]，了解其机制将为更深入地研究OA的发病原因提供新的思路。miRNA-140是胚胎软骨发育期仅在软骨组织中表达的一种miRNA[8, 9, 10, 11, 12, 13, 14]，随着软骨细胞分化发育成熟，细胞内miRNA-140表达也增强，研究表明正常关节软骨细胞中miRNA-140的表达比骨髓基质干细胞(MSCs)高2倍以上[9]。缺乏miRNA-140的小鼠出生后骨骼发育畸形，关节软骨细胞凋亡[9, 12]。而敲除miRNA-140基因，关节软骨则很快发生老年性改变[9]，所以miRNA-140是软骨细胞生长发育和功能维持最重要的miRNA之一。

研究发现晚期OA 软骨细胞内miRNA-140表达显著减少[8, 9, 10, 11]，导致OA中多种降解软骨组织的酶增加，如解整链蛋白金属蛋白酶(ADAMTS5，disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs)高表达[9]，最终软骨组织降解破坏。但早期OA软骨细胞miRNA-140变化情况目前不太清楚。本研究制作早期的OA关节模型，观察8周内关节软骨细胞miRNA-140的变化情况，结果显示在OA 4周时软骨细胞内miRNA-140的表达就明显下降，8周时下降更明显，提示miRNA-140在早期OA软骨细胞内即迅速降低，而且降低幅度较大，这种减少的情况和程度可能一直持续到晚期OA软骨细胞。早期OA软骨细胞中miRNA-140表达下降原因不清楚，有研究表明IL-1β和其他相关细胞因子会显著抑制miR-140的表达[9],推测生物力学、遗传、创伤、感染等因素可能会作用在一个共同的通路上造成早期OA软骨细胞内miRNA-140下降，其机制有待进一步研究。

本研究同时还观察了Col2a1和MMP-13的表达变化。Col2a1表达是软骨细胞功能的重要标志，它的下降预示关节软骨开始发生退变，而这个时候影像学表现可能没有任何改变[8]。本研究观察到OA软骨细胞中Col2a1的mRNA和蛋白表达显著降低，与文献报道晚期OA软骨细胞Col2a1基因和蛋白表达降低的程度[8]接近，显示在OA早期软骨细胞的功能即受到严重损害。MMP-13是重要的软骨基质降解酶，MMP-13的增加能加剧软骨的退变[11]。本研究观察到OA 4周和8周时软骨细胞中MMP-13的表达均显著增加，提示及早干预这种变化有利于预防早期关节炎，防止OA进一步发展，特别是在关节影像学发生改变以前干预，可以避免关节置换手术。

本研究通过转染外源性ds-miRNA-140来提高miRNA-140的表达,发现OA早期软骨细胞Col2a1的基因和蛋白表达在4周时均得到增加，到8周时略有增加，但增加幅度不大；同时MMP-13表达显著下降，8周时几乎降低了一半。研究初步显示ds-miRNA-140在改善早期OA软骨细胞功能方面具有积极作用。

尽管miRNA-140在OA研究中展示了良好的应用前景[15]，但其机制还不清楚。目前在OA软骨细胞中确认的 miR-140靶目标主要有组蛋白脱乙酰酶 (HDAC4)[16]、趋化因子配体12(CXCL12)[17]、胰岛素生长因子结合蛋白5(IGFBP5)[11]、ADAMTS-5和MMP-13[8]、 Smad3(TGFβ信号通路转录子)[11]、天冬酰胺氨肽酶(Dnpep)[12]、Sp1转录子(细胞循环调节激活剂P15INK4b )[18]、血小板源性生长因子A(PDGF-A)[19]等。这些靶目标是软骨细胞表型相关的重要因子。miRNA-140也会影响重要信号通路Bmp2(小鼠)和BMP2(人)[8, 13]，Nakamura等[12]在miRNA-140基因缺失小鼠实验中证实miRNA-140可作用于Dnpep，进而抑制BMP信号通路，保持软骨细胞分化。

MMP-13是软骨细胞最重要的基质降解酶之一，是miRNA-140的直接靶目标，miRNA-140在MMP-13 mRNA的3′端有结合位点，负向调节MMP-13的表达，改善人C28/I2软骨细胞的炎症程度[20]。本研究中转染外源性ds-miRNA-140出现MMP-13表达显著下降可能是miRNA-140直接作用在MMP-13 mRNA的结果，但转染ds-miRNA-140后，Col2a1升高的机制有待研究。Col2a1并不是miRNA-140的直接靶目标，miRNA-140表达受Sox9(transcription factor SRY-box-containing gene 9)调控，Sox9是miRNA-140的主要上游调控子[15, 21]，其家族中的L-Sox5和Sox6辅助调节Sox9[19, 22]。Sox9蛋白与Col2a1的第一个内含子中的特异性序列结合，影响Col2a1表达。Sox9上游的调节因素很多，其中Wnt/β-catenin信号通路和Sox9关系最为密切，是Sox9上游的重要调控开关[18]，该信号通路激活会强烈抑制Sox9表达，所以我们设想研究中转染ds-miRNA-140后Col2a1升高的现象不是miRNA-140直接作用的结果，而是miRNA-140抑制了Wnt/β-catenin信号通路，解除了对Sox9的抑制后Sox9表达增加所致。

脱靶效应是miRNA-140研究中需要考虑的一个重要问题，miRNA-140的靶基因很多，现发现有574个，其中保守靶基因有55个，而非保守基因则高达519个[13]，ds-miRNA-140的脱靶效应mRNA可能会更多[23]。

Miyaki和Nicolas等[8, 13]认为miRNA-140影响骨形态形成蛋白(bone morphogenetis protein,BMP)2信号通路。miRNA-140、miRNA-675受Sox-9、Sox-5、Sox-6的调节，Sox-9是重要的软骨细胞外基质基因，提示miRNA-140与软骨功能关系密切[15, 22]，但miRNA-140具体调控机制目前仍不太清楚，了解其复杂的调控机制是今后重要的研究内容。

除miRNA-140外，其他miRNA在OA软骨细胞中也起重要作用，沉默miRNA-34a基因可以抑制软骨细胞的凋亡[24]。miRNA-23b通过下调蛋白激酶A信号通路而促进MSCs分化为软骨细胞[25]。miRNA-27b 抑制OA软骨细胞MMP-13的表达[5]。 Martinez-Sanchez等[26]发现正常人软骨细胞中miRNA-145的增高抑制软骨细胞外基质基因(Col2a1、蛋白多糖等)以及miRNA-675、miRNA-140的表达，而RUNX2和MMP-13表达增高。 miRNA-22可调节IL-1β、BMP-7和BMP-13等的表达，抑制软骨细胞炎症反应和分解代谢[6, 27]，这些miRNA在软骨细胞中组成复杂的调控网络，而miRNA-140在其中的地位有待研究。

miRNA同时精细调节多种基因的功能强于siRNA，在临床应用中也可能取得更好的效果。miRNA-140揭示了OA病因病理新的领域，明确miRNA-140在OA软骨细胞中的作用和机制，特别是其靶基因,可能为OA治疗提供新的策略与思路。

4 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。 (志谢 本次研究工作得到美国加州大学圣迭戈分校生物工程系及Scripps骨科研究所Peter Chen 教授的大力支持，在此表示感谢！)

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