肾小管上皮细胞失去自身的细胞特性而获得肌成纤维细胞的特性，属于上皮-间质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。EMT在肾脏纤维化的发生和发展中起重要作用，抑制或逆转EMT的发生和发展，已成为控制肾脏纤维化的重要途径之一^[1]。转化生长因子β(TGF-β)通过结合上皮细胞表面的受体，经过Notch、β-catenin等信号途径活化EMT相关转录因子，导致EMT的发生^[2,3]。研究发现多种miRNA参与EMT的调控，可能在EMT的发展进程中发挥重要作用^[4]。证据表明miR-200家族通过下调ZEB基因调控EMT，随着对miRNA参与细胞表型转化中研究的不断深入，逐渐发现miR-200家族在EMT过程中起着关键性的作用^[5,6]。研究报道TGF-β诱导人角质化细胞EMT过程中一些miRNA表达谱发生变化，提示TGF-β可能通过调控miRNA表达参与EMT^[7]。但是目前关于TGF-β调节的miR-200家族表达机制研究鲜有报道。本研究通过在基因转录水平探讨TGF-β和miR-200家族的关系，为miR-200家族转录调控机制研究奠定初步理论基础。
1 材料和方法 1.1 材料及仪器

TRIzol(Invitrogen公司)，miScript Reverse Transcription Kit(Qiagen公司)，SYBR^® Premix Ex Taq^TM Ⅱ、 T₄ DNA连接酶、高保真酶PRIME STAR、限制性内切酶XhoⅠ、NcoⅠ、NheⅠ和HindⅢ(TaKaRa公司)，E.coli DH5α(本实验室保存)，柱式DNA胶回收试剂盒、柱式小量质粒DNA纯化试剂盒(Axygen公司)，基因组DNA提取试剂盒(Omega公司)，pGL3-Basic载体、Dual-Luciferase Reporter1000 Assay System (Promega公司)，脂质体Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)，人胚胎肾(human embryonic kidney,HEK)293细胞系、人肾小管上皮细胞(HK-2,本实验室保存)，胎牛血清(FBS,杭州四季青生物工程材料有限公司)，DMEM培养基、RPMI 1640培养基(Gibco公司)，TGF-β(R&D公司)。Synergy 2 多功能酶标仪(Biotek公司)。 1.2 基因组DNA的提取 按照基因组DNA提取试剂盒说明书的具体步骤提取HK-2细胞基因组DNA。 1.3 引物设计和PCR扩增miR-200b-200a-429基因

依据文献^[16]报道设计miR-200b-200a-429启动子及截短体的引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 miR-200b-200a-429启动子引物 Tab.1 Primer of miR-200b-200a-429 promoter

表 1 产生合成记录所用参数 Table 1 Parameters used to synthesize the seismic record

扩增1 600 bp左右片段引物为:上游-1 574/+120F，下游-1 574/+120R；扩增片段400 bp:上游-321/+120F，下游-1 574/+120R；扩增片段300 bp:上游-321/+120F，下游-158/+19R；扩增片段200 bp:上游-158/+19F，下游-158/+19R；扩增片段100 bp:上游-110/+19F，下游-158/+19R。其酶切位点分别为NheⅠ、BglⅡ。以从HK-2细胞提取的基因组DNA为模板，PCR进行扩增miR-200b-200a-429启动子及其截短体。反应条件:95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 90 s，共25个循环；72℃10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测并回收纯化PCR产物。 1.4 miR-200b-200a-429启动子报告基因载体的构建

将纯化后的PCR产物经NheⅠ、HindⅢ双酶切，回收酶切产物，利用T₄ DNA连接酶将回收产物与双酶切后的pGL3-Basic载体连接，转化至E.coli DH5α扩增，提取质粒后双酶切鉴定，将鉴定正确的质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA测序。 1.5 检测报告基因荧光素酶表达活性

将HK-2和HEK293细胞分别接种到48孔板，培养24 h后待细胞生长至融合度大于80%时进行转染。将重组的荧光素酶报告基因载体pGL3-miR-200-promoter、pGL3-Basic、内参质粒pRL-TK共转染HK-2细胞，每种载体平行做3复孔，报告基因载体每孔100 ng，pRL-TK每孔5 ng，具体步骤见Lipofectamine 2000说明书。24 h后加入工作液浓度为5 ng/mL TGF-β的培养液刺激，以正常培养液培养的细胞作为对照。转染48 h后裂解细胞并收取细胞裂解液，利用 Dual-Luciferasev Reporter 1000 Assay System检测荧光素酶活性值。 1.6 TGF-β刺激HK-2细胞

将用RPMI 1640(10% FBS)培养液培养的HK-2细胞，传代到T25细胞培养瓶中，细胞融合率达到70%时，取指数生长期的细胞弃去培养液，加入工作液浓度为5 ng/mL TGF-β的培养液，以正常培养液培养的细胞作为对照，放入37℃、5% CO₂ 细胞培养箱中培养24 h后提取细胞总RNA。 1.7 实时定量PCR

按照Qiagen公司的试剂盒说明书步骤提取细胞总RNA并进行miRNA的反转录。配制PCR反应液后上荧光实时定量PCR仪(ABI 7500)进行反应。PCR条件:95℃10 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，45个循环。PCR反应体系:SYBRR Premix Ex Taq^TMⅡ(2×)10 μL、miRNA Primer(10 μmol/L)0.4 μL、Universal adaptor PCR Primer 0.4 μL、DNA模板1 μL、ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL、dH₂O(灭菌蒸馏水) 8.8 μL，共计20 μL。

实时定量PCR中所用的引物序列hsa-miR-200a primer引物5′-TAA CAC TGT CTG GTA ACG ATG T-3′；has-miR-200b primer引物5′-TAA TAC TGC CTG GTA ATG ATG A-3′；hsa-miR-429 primer引物5′-TAA TAC TGT CTG GTA AAA CCG T-3′；内参U6 forword 5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′,reverse 5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。 1.8 TFSEARCH软件分析miR-200b-200a-429启动子-110/19区域序列

登录http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html,在线输入miR-200b-200a-429启动子-110/19区域序列，分析启动子-110/19区域序列的转录因子结合位点。 1.9 统计学处理

使用SPSS 15.0统计学软件分析数据。采用t检验或方差分析进行组间比较，检验水准(α)为0.05。 2 结 果 2.1 TGF-β对HK-2细胞miR-200a、miR-200b和miR-429表达的影响

TGF-β(5 ng/mL)刺激HK-2细胞，24 h后收集细胞总RNA，用实时定量PCR检测miR-200a、miR-200b和miR-429表达。结果显示TGF-β作用细胞24 h后下调miR-200a、miR-200b和miR-429的表达，与对照组相比分别下调了51%、62%和42%。 2.2 miR-200b-200a-429启动子报告基因表达载体的构建和鉴定

根据miR-200b-200a-429启动子序列设计截短体引物，利用PCR扩增出1 600、400、300、200、100 bp左右的目的片段(图1)。其中pGL3 -321/+19为2个条带，对2个条带分别测序鉴定，测序结果显示上面条带为目的片段，将测序正确的PCR产物克隆到质粒载体。 2.3 miR-200b-200a-429启动子报告基因荧光素酶活性的检测

将构建好的pGL3-1 574/+120、截短报告基因载体、pGL3-basic(阴性对照)与内参质粒pRL-TK共转染至HEK293和HK-2细胞，48 h后利用双荧光素酶报告系统检测启动子活性，结果显示miR-200b-200a-429启动子载体在HK-2细胞中能够检测出荧光素酶活性，在HEK293细胞中几乎不能检测出荧光素酶活性，两者间差异有统计学意义(P<0.05)。pGL3-1 574/+120载体逐渐截短后，检测显示荧光素酶活性也依次递减(图 2)。

图 1 miR-200b-200a-429启动子及截短体PCR Figure 1 Agarose gel electrophoresis of miR-200b-200a-429 promoter and PCR products of truncated product 1,3: DL2000; 2: pGL3 -1 574/+120; 4: pGL3 -321/+120; 5: pGL3 -321/+19; 6: pGL3 -158/+19; 7: pGL3 -110/+19

pGL3 -1 574/+120、截短报告基因载体、pGL3-basic(阴性对照)与内参质粒pRL-TK共转染至HK-2细胞，24 h后加入TGF-β(5 ng/mL)，刺激24 h后检测启动子荧光素酶活性，结果显示TGF-β能够抑制启动子和各截短体的报告基因活性(P<0.05,图 3)。提示miR-200b-200a-429 启动子区域的-110/+19区间有可能存在被TGF-β调控的作用元件。

图 2 miR-200b-200a-429启动子报告基因及截短体在HK-2和HEK 293细胞中的活性 Figure 2 Luciferase activity of miR-200b-200a-429 promoter reporter gene and truncated product in HK-2 and HEK 293 cells *P<0.05 vs HK-2 cells. n=3,x±s

图 3 TGF-β抑制HK-2细胞miR-200b-200a-429启动子报告基因及截短体的活性 Figure 3 TGF-β inhibited activity of miR-200b-200a-429 promoter reporter gene and truncated product in HK-2 cells *P<0.05 vs negative control. n=3,x±s

TFSEARCH软件分析miR-200b-200a-429启动子-110/+19区域序列，发现该启动子区域存在Smad、c-Myc、c-Myb、Sp1等重要转录因子的结合位点。 3 讨 论

miRNA是内源性小分子非编码单链RNA，它通过与靶mRNA 3′末端非编码区 (3′untranslational region，3′-UTR)序列特异性的互补配对发挥抑制或降解靶mRNA的作用。研究表明miRNAs参与细胞的增殖和凋亡、胚胎发育、组织器官的形成和多种疾病的发生等生理病理活动重要过程^[8]。同时研究发现miRNAs参与人类的疾病发生，探讨miRNAs与疾病之间的关系成为当前研究的热点^[9]。miRNAs在EMT的进程中起到重要的作用，通过刺激诱导处于上皮向间充质转化的细胞和间充质细胞能够下调miR-200的表达，miR-200丢失与E-钙黏连蛋白下调相关^[10]。miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429是miR-200家族成员，miR-200a、miR-200b和miR-429位于人类基因组1号染色体，miR-200c和miR-141位于人类基因组的12号染色体^[11]。TGF-β在EMT过程中可以下调miR-200家族和miR-205的表达^[12]。我们构建了miR-200b-200a-429的启动子报告基因载体和截短体。结果显示miR-200b-200a-429启动子报告基因载体及其截短体在HK-2细胞中活性明显的升高，说明这一片段具有启动子的活性。而在HEK293细胞中不能检测出miR-200b-200a-429启动子的活性，可能由于HK-2细胞为上皮细胞，miR-200家族在上皮细胞内高表达，而HEK293细胞属于间充质细胞，miR- 200家族在间充质细胞表达水平低^[13]。我们推测在上皮细胞中miR-200启动子区域存在特异表达表达的调控元件。我们发现TGF-β能有抑制miR-200b-200a-429启动子和其截短体的活性，提示启动子-110/+19区间可能存在被TGF-β调控的作用元件。

Smad家族是TGF-β信号转导通路中关键的下游因子，在TGF-β诱导EMT过程中发挥了重要作用^[6]。研究发现miR-200家族与Smad家族相互作用参与EMT的调控，Smad能够将 TGF-β的信号从胞膜受体转导入胞核内，通过调节核内靶基因转录发挥TGF-β的生物学效应^[14]。研究发现通过TGF-β可以使Smad3与miR-200b-200a-429启动子区结合位点结合，活化Smad蛋白，参与调控miR-200家族，最后调控E-钙黏连蛋白的转录抑制因子Zeb1和Zeb2表达^[15]。Smad7分子也参与miR-200家族的调节，其在NRK-52E细胞中过表达能够阻断TGF-β引起的miR-200家族的下调^[6]。因此，TGF-β可能是依赖细胞内的Smad信号途径引起miR-200家族下调。

多种细胞和分子参与了肾脏纤维化过程，各种因素相互作用，机制十分复杂。肾小管上皮细胞EMT及其分子机制的研究为病理-临床联系提供了新的线索。本研究发现在肾小管上皮细胞中，TGF-β能够增强miR-200b-200a-429启动子活性，TGF-β可能通过调控miR-200b-200a-429启动子的活性而调节miR-200家族的表达。本研究为miR-200家族转录调控机制的研究奠定了基础。 4 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。