炎症小体(inflammasome)是一类存在于细胞质中的多蛋白复合物，2002年Martinon等^[1]首次对其进行描述。作为固有免疫系统的感受器，炎症小体能被多种类型的病原体或危险信号所激活，通过多个信号通路诱导细胞因子及炎症介质的释放，引发炎症反应^[2]。炎症小体也在多种疾病如肿瘤、糖尿病、老年痴呆等^[2,3]的形成过程中起重要作用。目前研究最多的NLRP3炎症小体是由Nod样受体家族蛋白3(Nod-like receptor family，pyrin domain-containing 3，NLRP3)和凋亡凝集样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)及caspase-1前体(pro-caspase-1)组成的蛋白复合物^[4]。炎症小体活化后可使pro-caspase-1转化为有活性的caspase-1，后者裂解白介素1β前体(pro-IL-1β)及白介素18前体(pro-IL-18)，形成并分泌有活性的IL-1β和IL-18^[5]，IL-1β和IL-18在适应性免疫应答方面发挥重要作用^[6,7]。

尽管目前国内部分单位也开展了炎症小体的相关研究，但并未见在NLRP3基因敲除小鼠动物模型上的实验研究报道。本课题组为了开展NLRP3炎症小体相关的药理学与毒理学研究，于2013年10月引进了NLRP3基因敲除杂合子小鼠。现将从NLRP3基因敲除杂合子小鼠获得NLRP3基因敲除纯合子小鼠的繁殖及鉴定过程作一报告。 1 材料和方法 1.1 实验动物

NLRP3基因敲除杂合子(NLRP3^+/-)小鼠从北京唯德生物科技有限公司引进，利用TALEN(transcription activator-like effector nucleases)技术获得，品系为C57BL/6，SPF级，共3只(2雄1雌)。野生型(wide type，WT)C57BL/6小鼠由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK(沪) 2008-0016，合格证号：2008001631246，使用许可证号：SYKX(沪) 2012-0003，SPF级条件饲养。 1.2 主要试剂及仪器

鼠尾裂解液(北京康为世纪生物科技有限公司)；EDTA、异丙醇均为分析纯(上海医药集团上海化学试剂公司)；蛋白酶K(protease K)、2× Taq PCR Master Mix、AL2000 DNA Marker、5×TBE、1 mol/L Tris-HCl、10%SDS(北京艾德莱生物科技有限公司)；T7核酸内切酶1(T7 endonuclease 1，T7E1，北京唯德生物科技有限公司)；琼脂糖(美国Amresco公司)；6×Loading buffer(日本TaKaRa BIO株式会社)、溴化乙啶(EB)溶液(上海莱枫生物科技有限公司)。DK-8D型三孔电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司)；UNO-Ⅱ型PCR仪(美国Biometra公司)；Eppendorf 5804R低温离心机(德国Eppendorf AG)；FR-250电泳仪、FR-980A生物电泳图像分析系统(上海复日科技有限公司)。 1.3 基因敲除小鼠的饲养和繁殖

NLRP3基因敲除杂合子小鼠引进后，置于第二军医大学药物安全性评价中心SPF级动物房内饲养和繁殖。饲养温度18~22℃，相对湿度40%~70%，明暗循环12h/d，自由饮食和饮水。小鼠笼盒、玉米芯垫料及饲料、饮用水均经过高温高压消毒灭菌处理。饲养过程中，每天进入SPF动物房观察和记录小鼠的生长情况。每周更换3次小鼠垫料，每天补充饲料和饮用水。繁殖初期1只雄鼠与1只雌鼠进行合笼，小鼠的性成熟期为8周左右，母鼠妊娠期为21 d左右，繁殖出F2代子鼠后，1只雄鼠与2只雌鼠进行合笼。配种小鼠定期给予灭菌葵花籽以补充营养。 1.4 小鼠的基因型鉴定

由于引进的NLRP3基因敲除小鼠均为杂合子，其子代可能出现野生型(NLRP3^+/+)、杂合子(NLRP3^+/-)和纯合子(NLRP3^-/-)3种表型，故需对子代进行基因型鉴定。 1.4.1 小鼠基因组DNA提取

剪取绿豆大小的小鼠耳朵放入1.5 mL EP管中，加入500 μL裂解液，55℃水浴过夜。隔天 12 000×g离心5 min, 转移上清至另一新的1.5 mL EP管中，加入同等体积异丙醇，轻轻混匀，室温静置10 min，12 000×g离心10 min。弃上清，将沉淀溶解于适量TE缓冲液中，即得DNA。 1.4.2 PCR扩增反应及琼脂糖凝胶电泳进行基因型鉴定

引物由北京唯德生物科技有限公司设计，NLRP3基因引物分别是正向: 5′-GTT TTC ATT CCT GCA CTG CCA GTG-3′；反向: 5′-CAA AAA CCC TTC TGT TTA CTC ACT C-3′。PCR扩增:根据2× Taq PCR Master Mix使用说明，按25 μL反应体系进行扩增。分别加入如下反应物：DNA模板 3 μL、前段引物(20 μmol/L)1 μL、后段引物(20 μmol/L)1 μL、2× Taq PCR Master Mix(0.1 U/μL)12.5 μL，加ddH₂O补足至25 μL。其中，DNA模板中有一组为对照组，即野生型小鼠DNA，其余为实验组，即F1代杂合子交配繁殖的F2代子鼠DNA。PCR反应循环设置如下:94℃预变性3 min；94℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1~2 kb/min，循环40次；72℃ 5 min终止反应。 将上步反应得到的实验组和对照组PCR扩增产物按照如下反应体系进行退火处理。1号管加实验组PCR产物5 μL；2号管加实验组PCR产物2.5 μL，对照组PCR产物2.5 μL；3号管加对照组PCR产物5 μL；4号管加对照组PCR产物5 μL；再分别向1、2、3、4号管中各加入1.1 μL T7E1 1×buffer、4.4 μL ddH₂O。放入95℃水浴锅5 min,自然冷却至室温；再向1、2、3管中分别加入0.5 μL T7E1酶，37℃反应30 min。取T7E1酶切后各管产物8 μL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。根据以下3种情况判断小鼠为野生型、杂合子亦或是纯合子：(1)纯合子小鼠：样品小鼠的PCR产物自我杂交，经T7E1酶切，只有一种带型(和野生型带差不多)；而样品小鼠的PCR产物与野生型鼠的PCR产物杂交，出现两种带型(突变体带和野生型带)。(2)杂合子小鼠：样品小鼠自我杂交，经T7E1酶切，出现两种带型(突变体带和野生型带)；而样品小鼠的PCR产物与野生型鼠的PCR产物杂交，也出现两种带型(突变体带和野生型带)。(3)野生型小鼠：样品小鼠自我杂交，经T7E1酶切，只有一条带；而样品小鼠的PCR产物与野生型鼠PCR产物杂交也出现一条带。 2 结 果 2.1 小鼠的繁殖和生长情况

杂合子母鼠共生育8只F2代小鼠， 生长发育见图1，与野生型C57BL/6 小鼠相比未见明显异常。

图1

Fig. 1

图1 F2代1周龄小鼠(A)和5周龄小鼠(B)

F2代8只小鼠中1、3、4、6、7、8号为雄鼠，2、5号为雌鼠。其各自基因型鉴定结果见图2。

图2

Fig. 2

图2 F2代小鼠基因型鉴定结果 M：AL-2000 DNA标记物； 1-1, 2-1, 3-1, 4-1, 5-1, 6-1, 7-1, 8-1：F2代N号小鼠DNA自我杂交组(N：动物编号)； 1-2, 2-2, 3-2, 4-2, 5-2, 6-2, 7-2, 8-2：F2代N号小鼠和野生型小鼠DNA杂交组(N：动物编号)； W+：野生型小鼠DNA自我杂交组(加T7E1酶)； W－：野生型小鼠DNA自我杂交组(不加T7E1酶)

根据NLRP3 PCR引物和发生突变的位置，经T7E1酶切后会出现不同的DNA带型：野生型条带为366 bp，突变体条带为2条，分别为226 bp和140 bp。经T7E1酶切后，根据前文所述基因型判断方法可知：3号小鼠自我DNA杂交后出现一条带，与野生型小鼠DNA杂交后出现两条带，故为纯合子小鼠；1、4、7、8号小鼠无论是自我DNA杂交组还是与野生型小鼠DNA杂交组，都出现两条带，故为杂合子小鼠；2、5、6号小鼠无论自我DNA杂交组还是与野生型小鼠DNA杂交组，都出现一条带，故为野生型小鼠。 3 讨 论

天然免疫是机体防御病原体的第一道防线，主要通过模式识别受体(pattern recognition receptors， PRRs)来识别病原相关分子模式 (pathogen associated molecular patterns， PAMPs)，第一时间产生免疫应答、快速清除病原体^[8]。其中Nod样受体(Nod-like receptors， NLRs)是模式识别受体中非常重要的一类^[9]。迄今为止已发现人体内含有23种NLR家族蛋白分子，而小鼠体内则已发现35种^[10]。目前已经发现多种内源性刺激因素如病毒、真菌和细菌等多种病原体及其PAMPs均能刺激NLRP3炎性小体的组装、活化，细菌成孔毒素也能诱导NLRP3炎性小体的组装；而胞外危险信号如ATP、单钠尿酸、β-淀粉样蛋白和多种环境损伤同样能引起NLRP3的活化。有研究发现激活的NLRP3炎症小体能够通过引起肝细胞炎症而发挥保护作用，从而促进肝脏恢复稳态；而慢性肝炎时炎症小体长期激活，能够诱导肝脏细胞死亡，代偿性地引起肝细胞增殖和肝脏再生^[11]。在肠炎模型中也发现NLRP3炎症小体的激活对于肠炎具有保护作用；同时发现NLRP3炎症小体还能抑制肠炎相关性肿瘤的发生^[12]。因此，NLRP3炎症小体是机体的保护屏障之一，具有重要的研究意义。

2009年科学家揭示了植物病原菌-黄单胞杆菌(Xanthomonas spp.)中TALE蛋白的氨基酸序列与靶位点DNA序列间逐一对应且能特异性识别并结合的重大发现^[13]，并在此基础上开发了TALENs技术。作为一种崭新的分子生物学技术手段，TALENs技术克服了早前许多基因修饰技术如锌指蛋白(zinc finger protein，ZFP)等不能靶向所有序列、脱靶切割、设计繁复等缺点，能特异性实现对任意靶目标DNA的敲除、敲入或点突变^[14]。其主要原理是利用TALE和ForkⅠ限制性核酸内切酶的催化区域融合为TALEN，保留TALE的DNA靶序列特异识别功能及ForkⅠ的DNA酶活性^[15]，目前已成功在斑马鱼、线虫、大鼠小鼠、果蝇和细胞等物种实现了基因组定点突变^[16]。本教研室引进的NLRP3基因敲除小鼠，系通过TALEN技术剪切目标基因外显子DNA，使DNA发生修复后形成移码突变，从而使控制NLRP3蛋白表达的基因失活，达到实现NLRP3基因敲除的目的。该基因敲除动物模型的构建在国内尚属首次。同时为了更全面地研究NLRP3炎症小体激活对相关疾病病理生理的影响，我们还引进了NLRP3炎症小体相关的其他基因敲除小鼠(ASC^-/-小鼠、Caspase-1^-/-小鼠)，用同样的方法进行饲养、繁殖和基因型鉴定，为科研工作提供了有力保障。

引进的基因敲除小鼠严格遵循SPF级动物标准管理，饲养和繁殖方法参照文献 ^[17]进行。由于本次引进的NLRP3基因敲除小鼠均是杂合子，所以其子代可能出现NLRP3^+/+、NLRP3^+/-、NLRP3^-/- 3种表型，我们采用PCR扩增小鼠基因组DNA、再用T7E1酶切的方法成功进行了基因型鉴定。为了确保T7E1酶质量安全可靠，每块琼脂糖凝胶电泳时，相应增加了一孔不含T7E1酶的对照组，即只加入野生型小鼠DNA扩增产物5 μL，95℃ 5 min冷却到室温后，不加T7E1酶切，直接37℃ 反应30 min。从上述鉴定结果来看，对照组野生型小鼠DNA加入和不加入T7E1酶均为一条带，即366 bp。说明T7E1酶作用显著有效，可以用来鉴定小鼠基因型。杂合子小鼠交配后，可得到部分纯合子(NLRP3^-/-)的子代，用于科研工作，而杂合子(NLRP3^+/-)子代可以保种用。实验过程中，为不影响小鼠正常生长、保证存活率，我们选择出生3周左右即离乳后小鼠，剪取耳部组织进行基因鉴定。目前通过一段时间的饲养、繁殖和鉴定，我们已经获得了较多的NLRP3^-/-小鼠，同时也获得了部分ASC^-/-小鼠、Caspase-1^-/-小鼠。 4 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。