肾细胞癌(简称肾癌)在所有成人恶性肿瘤中约占3%，在泌尿系统恶性肿瘤中致死率最高^[1]，5年生存率为69.4%^[2]。肾癌早期无症状，约20%～30%的患者首次就诊时已经存在转移，进展期肾癌的5年生存率低于10％^[3]。对于转移性或复发性肾癌，尚无有效的治疗方法。肾细胞癌对放射线治疗不敏感，化疗总有效率仅为6‰，免疫治疗总有效率约20％，转移性肾癌5年存活率仅为11％左右^[4]。因此，找到能预测肾癌转移的早期诊断指标意义重大。而目前的研究显示长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)有可能会成为一种潜在的肾癌早期诊断和治疗的新途径^[5]。

近年关于lncRNA的研究逐渐成为热点，lncRNA在真核生物的生命活动调节中发挥十分重要的作用，参与了细胞信号转导^[5]。研究发现许多lncRNAs与疾病的病因密切相关，尤其是在肿瘤疾病中发生错调^[6]。如在白血病中p15的反义链表达^[7]，前列腺癌中DD3(PCA3)的表达^[8]。目前未见有关lncRNA在肾癌领域的相关研究。

RCRF(renal carcinoma related factor)是本研究通过lncRNA表达谱芯片技术筛选出来在肾癌组织中表达差异较明显的lncRNA之一，其位于染色体chr3:156866430~156866717,在高级别肾癌组织中表达上调。通过研究证实RCRF的表达和肾癌临床病理及预后有关，提示其可能是肾癌的一个预后因子。 1 材料和方法 1.1 标本来源

6例肾细胞癌的肿瘤标本用于芯片筛选，其中3例肿瘤组织病理分级为FuhrmanⅠ级，另3例肿瘤组织病理分级为Fuhrman Ⅲ~Ⅳ级。

共收集40例患者的肾细胞癌组织标本及癌旁正常组织标本用于实时定量PCR。患者年龄为37~75岁，平均(59.5±6.8)岁。 男28例、女12例。32例临床分期为pT1~pT2，8例临床分期为pT3~pT4 ；22例病理分级为低级别(FuhrmanⅠ~Ⅱ)，18例病理分级为高级别 (Fuhrman Ⅲ~Ⅳ)。手术后6例出现淋巴结转移，9例出现远处转移。平均随访期限为(19.55±3.4)个月。

以上组织均来源于2011年1月至2013年4月在第二军医大学长海医院泌尿外科行手术治疗且术前未行其他治疗的患者，所有标本均术后病理确诊为肾透明细胞癌。标本采集均经过患者家属同意并签署知情同意书，并经医院伦理委员会审核通过。 1.2 芯片筛选差异表达lncRNA

选择Affymetrix公司Glue Grant Human Transcriptome Array芯片， 设计探针为60 nt的长寡核苷酸，针对每条序列都设计了多条探针，以增加了信号的可靠性。实验由上海其明生物信息公司完成。将高级别肾癌组织lncRNAs表达量与低级别肾癌组织比较：其中2倍以上变化且差异有统计学意义(P<0.05)的lncRNAs，认为是差异表达的lncRNAs。 1.3 反转录及实时定量PCR

总RNA提取于40例患者的肾癌组织及对应癌旁组织，提取试剂选用TRIzol(Invitrogen公司)。采用PrimeScript ⅡFirst Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司) 合成cDNA。以反转录所获 cDNA为模板， SYBR Green Ⅰ(TaKaRa公司)为荧光标记物，进行实时定量PCR测定。U6作为内参。 特异性引物由BioTNT生物技术有限公司合成。RCRF上游引物TGA ACC TCT GCT GCC CAT AC，下游引物GCC ACC TTC AAG AAG TAG CCT AT。 U6 上游引物CTC GCT TTG GCA GCA CA，下游引物AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT。所有步骤重复3次，取平均值计算相对表达量(2^－ΔCt)及表达差异倍数 (2^－ΔΔCt)。 1.4 统计学处理

应用SPSS 17.0进行统计学分析，实验结果以x±s表示。组间差异采取独立样本Student’s t检验或方差分析，生存分析采用Kaplan-Meier法并进行log-rank检验。检验水准(α)为0.05。 2 结 果 2.1 芯片筛选结果

提示与低级别肾癌组织相比，高级别肾癌组织中有320个lncRNAs呈显著异常表达。其中206个lncRNAs表达上调，有114个lncRNAs表达下调。根据差异倍数以及错误发现率(false discovery rate,FDR)，选择差异倍数大且错误发现率小的lncRNAs，最终选定探针编号为TI01730NT(差异倍数：5.39；FDR：0.005 4)的lncRNA进行进一步实验。我们将编号为TI01730NT的lncRNA命名为RCRF。 2.2 RCRF的表达及与临床病理资料关系

结果显示，RCRF的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小及临床分期无关(P>0.05)，而与病理分级、淋巴结转移、远处转移有关(P<0.05，表1)。与癌旁正常组织(0.000 3±0.000 2)相比，肾癌组织(0.001 2±0.000 3)中的RCRF表达上调(P<0.01)。

表1

表 1(Table 1)

表1 RCRF的表达与临床病理特征的关系 x±s 临床指标 例数(n) RCRF相对表达倍数 P值 N 40 3.098±1.803 性别 0.258 男 28 2.885±1.729 女 12 3.597±1.951 年龄(岁) 0.803 ≤60a 23 3.036±1.893 >60 17 3.183±1.728 肿瘤直径 d/cm 0.054 ≤5.0a 23 2.584±1.629 >5.0 17 3.095±1.839 临床分期 0.174 pT1 26 2.793±1.798 pT2 6 3.332±1.828 pT3-pT4 8 4.289±1.508 病理分级 0.017 Ⅰ 8 1.975±1.780 Ⅱ 14 2.624±1.447 Ⅲ-Ⅳ 18 3.896±1.739 淋巴结转移 0.003 无 34 2.758±1.658 有 6 5.028±1.408 远处转移 0.021 无 31 2.749±1.758 有 9 4.303±1.471 a中位值

表1 RCRF的表达与临床病理特征的关系

以出现淋巴转移或远处转移视为终点事件进行无进展生存分析，将样本分为两组，RCRF表达差异倍数≥中位数2.5的为高表达，<2.5的为低表达。根据两组的相对表达绘制Kaplan-Meier生存曲线，并进行log-rank检验，结果显示两组间无进展生存期的差异有统计学意义(图1，P<0.01)。表明肿瘤组织中高表达RCRF的患者更有可能出现转移。

图1

Fig. 1

图1 患者无进展生存分析

研究证实lncRNAs与一些恶性肿瘤比如结肠癌、乳腺癌等有关^[9,10]。本研究首次发现RCRF在肾癌中的异常表达，并对其进行表达谱的探究以及与肾癌患者临床病理指标的统计分析。本研究通过芯片筛选并采用实时定量PCR发现并证实了RCRF与肾癌的关系。对40例患者肿瘤组织标本进行实时定量PCR显示，与癌旁正常肾组织相比，肾细胞癌组织中的RCRF表达上调(P<0.01)，并且RCRF的上调与肾癌患者的一些临床病理资料如病理分级、淋巴结转移、远处转移有关(P<0.05)。另外，RCRF的过表达与低生存率可能有关。这些结果均提示RCRF很可能在肾细胞癌的发生发展中起到关键作用。然而，对于RCRF的研究尚属起步阶段，RCRF对肾癌细胞的作用机制还未完全阐明，可能是影响某种mRNA及其表达的蛋白，并通过某种信号通路发挥促进肿瘤进展的作用。

然而本研究的样本量及随访时间有限，仍然需要更大的样本量及更长的随访时间来证实RCRF与肾癌5年生存率的相关性。 4 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。