蛛网膜下隙出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)后迟发性脑血管痉挛(delayed cerebral vasospasm， DCVS)可导致死残率增加，是导致患者预后不佳的重要原因^[1]，确切机制仍不清楚^[2]。近年来研究发现，SAH后血管平滑肌细胞增殖在DCVS的发生中起了重要作用^[3,4]，我们前期研究发现SAH后基底动脉中NF-κB的表达变化与增殖细胞核抗原(PCNA)的表达具有一致性，可能参与了血管平滑肌细胞的增殖^[5]。吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(ammonium pyrrolidinedithiocorbamate, PDTC)作为NF-κB的特异性抑制剂，能够抑制NF-κB的活化，本研究采用PDTC干预枕大池2次注血模型，观察基底动脉PCNA表达变化并结合血管平滑肌厚度的变化，探讨NF-κB在SAH后脑血管平滑肌增殖中的可能作用。 1 材料和方法 1.1 主要试剂及实验动物

鼠抗PCNA单克隆抗体(美国Abcam公司)，兔抗NF-κB p65多克隆抗体、羊抗兔二抗(北京博奥森生物技术有限公司)，SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德生物公司)，蛋白质印迹试剂盒(碧云天生物技术公司)。雄性新西兰大白兔16只，购于第三军医大学实验动物中心，体质量2.0～2.4 kg。实验动物分组采用完全随机法，SAH组8只，PDTC组8只。 1.2 模型制备及基底动脉取材

将兔经耳缘静脉按照1 mL/kg注入3%戊巴比妥钠麻醉，用23号无菌穿刺针刺入枕大池，释放约1.5 mL脑脊液；抽取等量耳动脉血，非肝素化，1～3 min内缓慢注入枕大池。术后保持头低30°俯卧位30 min。48 h后同法进行2次注血。PDTC组动物自首次注入动脉血后，按照6 mg/kg注入PDTC，每日1次，直至2次注血后第6天。第7天取兔基底动脉标本。麻醉后自剑突下U形剪开胸壁，剪开心包， 自左心室穿入8号穿刺针至升主动脉内，同时剪开右心耳，快速灌注4℃生理盐水，至从右心耳流出液清亮后为止。自枕部咬开颅骨，完整剥离脑组织并避免损伤基底动脉，把整条基底动脉平均分为3段，所有动物均取基底动脉中部1/3，带背部脑干组织作为支撑，置于4%多聚甲醛中浸泡固定，石蜡包埋切片；剥离其余基底动脉放入冻存管，液氮保存，用于蛋白定量分析。 1.3 基底动脉H-E染色

基底动脉用4%多聚甲醛固定3 d后行石蜡包埋并切片，H-E染色， 显微镜取图后行血管平滑肌厚度测量(Leica Appliation Suite软件)。方法为每个血管断面分别以管腔中点为中心取垂直的4个象限，从血管内弹力膜外侧至平滑肌层的最外侧测量取值，然后再以这4个象限测量结果的平均值作为每个标本基底动脉平滑肌厚度。 1.4 免疫组化检测

免疫组化染色按照SABC试剂盒说明进行。切片脱蜡、热修复后分别加入鼠抗PCNA单克隆抗体(1∶100)和抗NF-κB p65多抗(1∶100)，4℃冰箱中过夜。PBS 摇洗后滴加生物素化二抗。37℃孵箱中孵育1 h，加入SABC三抗，DAB显色，苏木精染核，中性树胶封片。每只兔的基底动脉切片断面选取3张，计算每张切片上所有血管平滑肌细胞总数和阳性细胞数，计算阳性细胞数占所有平滑肌细胞数的比例。 1.5 蛋白质印迹检测

用剪刀剪取约50 mg组织，加入1 mL RIPA进行匀浆，然后冰上静置20 min，将匀浆液吸出放到1.5 mL离心管中， 4℃、12 000×g离心10 min，吸取上清液进行蛋白印迹分析。组织总蛋白经凝胶电泳后转移至硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉封闭1 h，加入稀释的NF-κB p65抗体(1∶200)、PCNA抗体(1∶200)和β-actin抗体(1∶2 000)37℃孵育1 h，加二抗IgG，37℃孵育1 h后加入发光剂，测其积分光密度(IOD)值。NF-κB p65、PCNA蛋白表达以其与β-actin的相对IOD比值表示。 1.6 统计学处理

采用SPSS11.5统计软件，计量资料用x±s表示，组间比较采用方差分析。检验水准(α)为0.05。 2 结 果 2.1 基底动脉平滑肌厚度测量

基底动脉血管横切面常规H-E染色(图1)显示： SAH组血管平滑肌层厚度为(37.1±6.7) μm；PDTC干预后，血管平滑肌层厚度(24.4±4.2) μm，平滑肌增厚改善，与SAH组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图1

Fig. 1

图1 SAH组(A)和PDTC组(B)基底动脉平滑肌厚度比较 Fig.1 Comparison of basilar artery smooth muscle thickness between SAH(A) and PDTC(B) groups (H-E staining)SAH: Subarachnoid hemorrhage; PDTC: Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate. Original magnification: ×200

免疫组化结果(图2)显示，SAH组兔基底动脉NF-κB p65表达强烈，主要存在于内皮细胞、平滑肌细胞的胞质和胞核，镜下观察为条状或点片状黄褐色。PCNA表达为细胞核呈棕黄色染色。PDTC干预后，NF-κB p65在兔基动脉平滑肌中表达减弱，PCNA阳性细胞计数亦相应减少，NF-κB p65、PCNA阳性率明显低于SAH组，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图2

Fig. 2

图2 SAH组和PDTC组兔基底动脉PCNA、 NF-κB p65的表达 Fig.2 NF-κB p65 and PCNA positive cells in SAH and PDTC groups by immunohistochemistry stainingA,B: PCNA positive cells by immunohistochemistry staining in SAH(A) and PDTC(B) groups. C,D: NF-κB p65 positive cells by immunohistochemistry staining in SAH(C) and PDTC(D) groups. SAH: Subarachnoid hemorrhage; PDTC: Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate; PCNA: proliferating cell nuclear antigen. Original magnification: ×200.

蛋白质印迹结果(图3)显示：PDTC抑制NF-κB p65活化后，基底动脉的NF-κB蛋白表达显著降低，PCNA蛋白表达亦相应减少，与SAH组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。

图3

Fig. 3

图3 基底动脉NF-κB p65、PCNA蛋白表达 Fig.3 Basilar artery NF-κB p65 and PCNA protein expression detected by Western blotting analysisSAH: Subarachnoid hemorrhage; PDTC: Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate; PCNA: Proliferating cell nuclear antigen

SAH后DCVS发生机制尚不清楚，临床上应用各种药物预防和治疗DCVS均不可能使痉挛的血管完全舒张，DCVS的发生不仅是痉挛动脉的持续收缩，也伴随血管壁的结构性改变^[6]，但引起血管壁重构的具体机制仍未阐明。近期研究发现，DCVS的发生与血管壁细胞的增殖关系密切，细胞的增殖性改变可能是导致血管腔狭窄的重要原因^[7]。2003年Borel等^[8]发现血凝块所在部位的脑血管有平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖，并用血清刺激体外培养的人软脑膜血管7 d，发现血管外膜及平滑肌出现明显增殖性改变，并认为是细胞的增殖和管壁增厚导致了DCVS。我们前期的实验中发现NF-κB在SAH后对平滑肌细胞的异常增殖起着关键性作用^[5]。本研究进一步发现：应用NF-κB抑制剂PDTC能抑制SAH后基底动脉平滑肌细胞增殖，使血管壁平滑肌增厚减轻，管腔狭窄改善。

我们实验结果发现，应用抑制剂PDTC后，基底动脉NF-κB蛋白表达受到抑制，同时H-E染色发现，动脉壁痉挛程度减轻，内皮细胞相对完整，内弹力膜皱褶程度轻，中层平滑肌增厚改善。我们同时用PCNA表达量的变化来评价细胞增殖状态，实验结果提示，PDTC在抑制基底动脉NF-κB激活的同时，显著下调基底动脉平滑肌细胞PCNA蛋白表达，与SAH组相比差异有统计学意义。因此我们认为，PDTC对SAH后脑血管平滑肌细胞增殖性改变起到一定的防治作用，同时也说明，NF-κB的表达增强在SAH后脑血管平滑肌细胞增殖中起到非常重要的作用，通过抑制NF-κB表达能够达到抑制血管平滑肌细胞增殖的目的。

PDTC是一种低分子质量的硫醇螯合物，具有很强的重金属螯合功能和抗氧化功能^[9]。近年来，有文献报道应用PDTC来治疗肺损伤等疾病的实验研究^[10]，也有实验研究证实PDTC能够阻断NF-κB激活的信号通路，通过抑制NF-κB活化和炎性细胞因子的表达来治疗神经系统疾病^[11]。目前认为PDTC的作用机制主要是：(1)通过直接清除活性氧中间产物，螯合金属离子发挥作用；(2)通过阻止NF-κB的抑制性亚单位I κB的降解发挥作用^[12]；(3)通过阻碍NF-κB的p65、p50亚基向细胞核转移，从而发挥其抑制作用^[13]。

本实验结果表明应用PDTC干预后，基底动脉平滑肌细胞NF-κB阳性细胞数及蛋白表达明显减少， PCNA表达也相应下调，由此推测，PDTC通过抑制NF-κB的活化从而减轻脑血管平滑肌增殖反应而改善SAH后脑血管重构，进而减轻DCVS的发生，为SAH后DCVS的防治奠定了基础。 4 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。