2014, Vol. 35
2. 上海中医药大学附属上海市中医医院妇科, 上海 200071
2. Department of Gynecology, Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200071, China
卵巢癌是严重影响女性健康的生殖道恶性肿瘤。高促性腺激素理论认为绝经后高水平的促卵泡激素(follicle stimulating hormone，FSH)是卵巢癌发生的高危因素，因此研究了解FSH作用的分子生物学机制对卵巢癌的治疗具有重要的指导意义。桥粒胶蛋白-3(desmocollin 3,Dsc3)属于钙粘素超家族，是细胞桥粒的重要组成部分[ 1 ]。近年研究表明，Dsc3在某些肿瘤发生发展中起到一定作用[ 2,3,4,5,6 ]，但在卵巢癌中的表达情况尚未见报道。有文献报道Dsc3同家族分子Dsc2的缺失能够促进结肠上皮细胞的体外增殖，并且通过激活表皮生长因子受体(EGFR)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号通路(EGFR/Akt信号通路)促进肿瘤体外生长[ 7 ]。本研究旨在探究Dsc3在卵巢癌中的表达情况，以及Dsc3是否也通过EGFR/Akt信号通路促进FSH调控的卵巢癌细胞增殖活性，进而促进肿瘤的发生发展。
1 材料和方法 1.1 标本来源收集2007—2011年上海市第一人民医院病理科72例患者的石蜡卵巢组织切片标本，其中31例为卵巢恶性上皮性肿瘤，22例为卵巢交界性上皮性肿瘤，另19例为良性上皮性肿瘤，所有病例均有完整的临床病理资料。全部病变组织标本均经2位有经验的病理医师盲法确定病理诊断及分级，所有患者术前均签署了实验研究知情同意书。
1.2 细胞株 上皮性卵巢癌细胞株Hey、HO8910、ES-2、Skov3、Skov3ip，卵巢交界性囊腺瘤细胞株MCV152、卵巢永生化上皮细胞株Moody由上海市第一人民医院妇产科丰有吉教授课题组保存。 1.3 主要试剂及材料正常羊血清购自上海太阳生物技术有限公司; SS LABEL Polymer-HRP购自BioGenex公司;DAB试剂盒购自上海长岛生物科技有限公司; MCDB109/M199培养基、DMEM-F12培养基、胎牛血清购自Hyclone公司；FSH、四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲亚砜(DMSO)均购自Sigma公司；免疫组化试剂盒自Santa Cruz公司;Dsc3多克隆抗体(鼠抗人)、Dsc3单克隆抗体(兔抗人)、EGFR单克隆抗体(兔抗人)、Akt单克隆抗体(兔抗人)分别购自eBioscience、Abcam、Epitomics、R&D公司，pAkt单克隆抗体(兔抗人)、GAPDH单克隆抗体(兔抗人)购自Cell signaling公司；lipofecetamine 2000购自Invitrogen公司；siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成；ECL (electrochemiluminescence，一般用于蛋白质印迹分析)发光剂购自PerkinElmer公司。
1.4 免疫组织化学检测
应用免疫组织化学S-P法染色检测Dsc3蛋白的表达。常规脱蜡，抗原修复采用高温加热法：切片浸入柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中，高压锅煮沸15 min，室温下自然冷却，正常山羊血清封闭,一抗孵育过夜后二抗孵育，显微镜下DAB显色5～10 min，苏木精复染2 min，盐酸乙醇分化后脱水、封片。 Dsc3鼠抗人多克隆抗体按1∶10稀释。实验步骤严格按照免疫组化试剂说明进行操作。每张切片随机计数5个视野，以淡黄色至棕黄色或棕褐色着色的卵巢上皮细胞作为阳性细胞，参照Remmele等[ 8 ]的评分方法，根据阳性细胞染色百分比及着色深浅评分:(1)阳性细胞染色百分比≤30%为 1分，30%～70%为2分，＞70%为3分；(2)无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色至棕褐色为2分。标本最后评分(1)×(2)，按分值将表达水平分为：0分阴性，1～3分弱阳性，4～6分强阳性(1～6分为阳性)。选择典型视野，利用显微照相系统照相。
1.5 细胞培养及处理Moody细胞株用含15%胎牛血清的MCDB109/M199培养液，余6种细胞用含10%胎牛血清、100 U/L青霉素和100 U/L链霉素双抗的DMEM-F12培养液，置于37℃、5%CO2 细胞培养箱中培养。实验用细胞均处于对数生长期。将7种不同病理类型的卵巢组织细胞于同时间，长满培养皿后收集细胞，运用蛋白质印迹分析法检测Dsc3分子的表达；Hey、HO8910细胞在血清饥饿24 h后，经浓度分别为0、20、40、80 IU/L的FSH作用48 h及选用最佳作用浓度的FSH分别作用0、24、48、72 h，收集细胞后，用蛋白质印迹分析法检测Dsc3、EGFR等蛋白分子的表达；通过siRNA干扰法分别干扰Dsc3、EGFR，以及应用PI3K/Akt通路阻断剂LY294002(10 μmol/L;购自美国Selleck公司)预处理细胞1 h后，FSH再处理细胞48 h，收集细胞，运用蛋白质印迹分析、MTT法检测信号通路分子的表达及细胞增殖情况。
1.6 蛋白质印迹分析收集上述处理后的细胞，裂解后收集上清液，BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。将60 μg蛋白上样于10% SDS-PAGE，电泳结束后，将蛋白转印至PVDF膜上，应用稀释的Dsc3(1∶5 000)、EGFR(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)、pAkt(1∶1 000)、GAPDH抗体(1∶1 000)于4℃孵育过夜，经TBST洗涤后，选择合适的二抗孵育1 h，经TBST洗涤后，应用ECL化学发光法检测目的蛋白表达情况。实验重复3次。
1.7 MTT实验检测细胞增殖活性收集Hey、HO-8910细胞，分别接种至96孔板中，每孔加入200 μL铺板使待测细胞密度为1 000～3 000个/孔，边缘孔用无菌1×PBS填充，用含10%胎牛血清的DMEM培养液将各孔的培养液补齐到200 μL，5%CO2、37℃孵育，至细胞贴壁。通过siRNA干扰法分别干扰Dsc3、EGFR，以及应用PI3K/Akt通路阻断剂LY294002(10 μmol/L)预处理细胞1 h后，FSH再处理细胞48 h，收集细胞，每孔200 μL，设6个复孔。每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)，继续放入5%CO2、37℃培养4 h后，小心吸去孔内培养液，每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的光密度(D)值。
1.8 siRNA干扰实验实验分组：siCon组为转染阴性对照序列的实验组,对Dsc3或EGFR无干扰作用；siDsc3或siEGFR组：转染特异性干扰Dsc3或EGFR的siDsc3或siEGFR序列；FSH+siCon组：以FSH处理的siCon组；FSH+siDsc3、FSH+siEGFR：以FSH处理的siDsc3或siEGFR组。种植于6孔板中的Hey细胞和HO8910细胞经无血清的OPTI-MEM培养液饥饿24 h后，当细胞密度达30%～50%时，按lipofectamine 2000使用说明书将配置好的siRNA-脂质体混合物转染细胞。转染12 h后加入40 IU/L FSH处理48 h，提取蛋白，按上述步骤用蛋白质印迹分析法测定Dsc3、EGFR、Akt、pAkt表达；96孔板中相同处理的Hey细胞和HO8910细胞经FSH处理48 h后，应用MTT检测Dsc3、EGFR对细胞增殖的影响。
1.9 统计学处理应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。免疫组化数据分析采用Kruskal-Wallis检验，MTT检测结果的数据分析采用单因素方差分析。检验水准(α)为0.05。
2 结 果 2.1 Dsc3在不同卵巢肿瘤组织和细胞株中的表达Dsc3阳性细胞定位于细胞膜。Dsc3在卵巢癌组织中的阳性表达率为77.4%(24/31)，在交界性卵巢肿瘤中的阳性表达率为81.8%(18/22),均高于在良性卵巢肿瘤中的表达[15.8%(3/19)]，差异均有统计学意义(P<0.05)。Dsc3在卵巢癌中的阳性表达率与交界性卵巢肿瘤比较差异无统计学意义(P>0.05)。代表性的免疫组化染色结果见图 1。
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图 1 免疫组化染色检测Dsc3在不同卵巢肿瘤组织中的表达(SP法) Fig 1 Expression of Dsc3 in different ovarian tissues determined by immunohistochemical staining(SP method) A:Benign ovarian cyst tissues; B:Borderline ovarian tumor tissues; C:Ovarian cancer tissues. Original magnification: ×100 |
用蛋白质印迹分析法检测Dsc3在7种不同卵巢组织细胞株中的蛋白表达情况，结果(图 2)表明Dsc3在卵巢癌细胞株Hey、HO8910、Skov3、Skov3ip以及在卵巢交界性囊腺瘤细胞株MCV152中的表达均高于卵巢永生化上皮细胞株Moody和卵巢癌细胞株ES-2。
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图 2 蛋白质印迹分析检测Dsc3在不同卵巢组织细胞株中的表达 Fig 2 Expression of Dsc3 in different ovarian cell lines detected by Western blotting analysis 1: ES-2; 2: HO8910; 3: Skov3ip; 4: Skov3; 5: MCV152; 6: Hey; 7: Moody |
蛋白质印迹分析结果(图 3)显示，不同浓度的FSH作用于Hey细胞和HO8910细胞48 h后，两种细胞的Dsc3、EGFR表达随FSH浓度的升高而逐渐增加，在一定范围内呈剂量依赖性。Dsc3在FSH浓度为40 IU/L时表达量最高，浓度为80 IU/L时略有下降。
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图 3 蛋白质印迹分析检测不同浓度FSH对Dsc3、EGFR表达的影响 Fig 3 Effect of different concentrations of FSH on Dsc3 and EGFR expression as detected by Western blotting analysis FSH: Follicle stimulating hormone; Dsc3: Desmocollin 3; EGFR: Epidermal growth factor receptor. A: Hey cells; B: HO8910 cells |
蛋白质印迹分析结果(图 4)显示，选择FSH的最佳浓度40 IU/L，分别作用于Hey细胞和HO8910细胞24、48 h后，两种细胞的Dsc3、EGFR的表达随FSH作用时间的延长而逐渐增加，呈时间依赖性,48 h时Dsc3表达最高，72 h时有所下降。
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图 4 蛋白质印迹分析检测不同作用时间的FSH(40 IU/L)对Dsc3、EGFR表达的影响 Fig 4 Dsc3 and EGFR expression in Hey cells and HO8910 cells treated with FSH (40 IU/L) for different periods as detected by Western blotting analysis FSH: Follicle stimulating hormone; Dsc3: Desmocollin 3; EGFR: Epidermal growth factor receptor. A: Hey cells; B: HO8910 cells |
蛋白质印迹分析结果(图 5)显示，干扰Dsc3对Hey细胞和HO8910细胞的EGFR、pAkt在蛋白水平的表达有抑制作用，对Akt作用不明显，且FSH(40 IU/L)对EGFR、pAkt的上调作用被抑制，对Akt作用不明显。
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图 5 蛋白质印迹分析检测干扰Dsc3对FSH(40 IU/L)调控的AKT信号通路蛋白分子表达的影响
Fig 5 RNA interference of Dsc3 regulates PI3K/Akt signaling pathway protein regulated by FSH(40 IU/L) as detected by Western blotting analysis
FSH: Follicle stimulating hormone; Dsc3: Desmocollin 3; EGFR: Epidermal growth factor receptor; Akt: Serine/threonine kinase; pAkt: Phosphorylated Akt. A: Hey cells; B: HO8910 cells. 1: siCon; 2: siDsc3; 3: siCon+FSH; 4: siDsc3+FSH |
蛋白质印迹分析结果(图6)显示，干扰EGFR对Hey细胞和HO8910细胞的pAkt、Dsc3蛋白水平的表达有抑制作用，对Akt作用不明显，FSH(40 IU/L)对pAkt、Dsc3的上调作用被抑制，对Akt作用不明显。
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图 6 蛋白质印迹分析检测干扰EGFR对FSH(40 IU/L)调控的AKT信号通路蛋白分子表达的影响
Fig 6 RNA interference of EGFR regulates PI3K/Akt signaling pathway regulated by FSH(40 IU/L) as detected by Western blotting analysis
FSH: Follicle stimulating hormone; Dsc3: Desmocollin 3; EGFR: Epidermal growth factor receptor; Akt: Serine/threonine kinase; pAkt: Phosphorylated Akt. A: Hey cells; B: HO8910 cells. 1: siCon; 2: siDsc3; 3: siCon+FSH; 4: siEGFR+FSH |
蛋白质印迹分析结果(图 7) 显示，应用PI3K/Akt通路阻断剂LY294002阻断PI3K/Akt通路后，pAkt、Dsc3蛋白表达下调，Akt蛋白表达持平，FSH(40 IU/L)对pAkt、Dsc3的上调作用被抑制，对Akt作用无明显变化。
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图 7 蛋白质印迹分析检测阻断PI3K/Akt通路对FSH (40 IU/L)调控的通路信号分子蛋白表达的影响
Fig 7 Effect of blocking PI3K/Akt signaling pathway on protein of FSH(40 IU/L) signaling pathway as detected by Western blotting analysis
Con: Control; FSH: Follicle stimulating hormone; Dsc3: Desmocollin 3; Akt: Serine/threonine kinase; pAkt: Phosphorylated Akt. A: Hey cells; B: HO8910 cells. 1: Con; 2: Ly 294002; 3: Con+FSH; 4: Ly 294002+FSH |
MTT检测结果(图 8)显示，siDsc3、siEGFR、LY294002分别与siCon比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；siDsc3+FSH、siEGFR+FSH、LY294002+FSH分别与siCon+FSH比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；siCon+FSH与siCon、siDsc3+FSH与siDsc3、siEGFR+FSH与EGFR、LY294002+FSH与LY294002比较，差异亦均有统计学意义(P<0.05)。结果表明分别干扰Dsc3、EGFR，应用PI3K/Akt通路阻断剂LY294002后，对卵巢癌细胞增殖有抑制作用，同时也减弱了FSH对卵巢癌细胞的增殖作用。
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图 8 MTT法检测卵巢癌细胞增殖活性
Fig 8 Ovarian cancer cell proliferation as detected by MTT
Con: Control; FSH: Follicle stimulating hormone; Dsc3: Desmocollin 3; Akt: Serine/threonine kinase; pAkt: Phosphorylated Akt. A: Hey cells; B: HO8910 cells. 1: Con; 2: Ly 294002; 3: Con+FSH; 4: Ly 294002+FSH |
卵巢癌在妇科恶性肿瘤中的病死率高居首位，主要由于卵巢深藏盆腔，难以早期发现病变，缺乏早期预警，以致确诊时多数已属晚期。因此，了解卵巢癌发病的分子基础，寻找早期诊断方法，将有助于针对特定靶点的药物研发和进行有效的治疗。卵巢是FSH的主要靶器官体[ 9 ]，FSH促进正常卵巢细胞和卵巢癌细胞增殖；流行病学研究显示绝经后妇女的卵巢癌发病率明显高于生育期妇女[ 10 ]，围绝经和绝经妇女体内血清高FSH浓度与卵巢癌发生发展密切相关，李连香等[ 11 ]的研究表明，在良性与恶性上皮性卵巢肿瘤患者、良性与交界性上皮性卵巢肿瘤患者的血清和肿瘤组织液之间，FSH浓度均存在显著差异(P<0.05)，且随着恶性程度的增高，FSH浓度也呈增高趋势。 FSH在促进卵巢癌发展 中的作用机制，已有很多文献报道，如盛林等[ 12 ]研究发现，FSH通过蛋白激酶C介导的信号转导途径，可刺激卵巢上皮癌细胞增殖；冯怡雯等[ 13 ]研究表明，FSH通过特异AT序列结合蛋白1调控上皮性卵巢癌ES-2细胞的增殖和侵袭活性等。有关FSH作用机制的研究虽多，但仍未完全阐明。
近年研究表明，Dsc3与某些肿瘤的发生发展可能有一定的相关性[ 14,15 ]。Dsc3的DNA甲基化可导致其在结直肠癌中表达下调[ 2 ]；Dsc3的缺失导致K-Ras原癌基因介导的皮肤肿瘤发生率增高[ 3 ]；Dsc3在低分化的胰腺导管癌[ 5 ]及在近半数未分化的肺大细胞癌[ 6 ]中高表达。然而，Dsc3在卵巢癌中的表达情况较少有报道，故本研究对此进行了探讨。本研究预实验结果表明，Dsc3在卵巢癌及交界性卵巢肿瘤中的阳性表达率均高于良性卵巢肿瘤(P<0.05)。选用卵巢永生化上皮细胞、交界性卵巢肿瘤细胞及卵巢癌细胞共7种进行Dsc3的蛋白质印迹分析发现，Dsc3在卵巢癌细胞株Hey、HO8910、Skov3、Skov3ip以及在卵巢交界性囊腺瘤细胞株MCV152中表达均高于卵巢永生化上皮细胞Moody和卵巢癌细胞株ES-2(P<0.05)。
有文献报道，Dsc3同族分子Dsc2的缺失可通过激活 EGFR/Akt信号通路使结肠上皮细胞体外增殖，并转化为恶性表型[ 7 ]。本课题旨在探究Dsc3在卵巢癌中是否也通过EGFR/Akt信号通路促进FSH调控的卵巢癌细胞增殖活性，进而促进肿瘤发生发展。本研究首先运用蛋白质印迹分析方法检测FSH对Dsc3以及信号通路分子EGFR在蛋白水平的影响。流行病学调查发现，卵巢癌在伴有FSH增高的人群中发病率增高；在正常月经中，排卵前FSH在血中浓度约为5～20 IU/L，而排卵前升高亦不超过30 IU/L，绝经后或卵巢功能衰退患者血FSH浓度可≥40 IU/L[ 16 ]，而Halperin等[ 17 ]发现，卵巢癌患者血清中FSH浓度达(24.74±18.7)IU/L。Zheng等[ 18 ]和宋光辉等[ 19 ]研究了两种卵巢癌细胞株在FSH浓度<160 IU/L范围内的细胞增殖情况，发现均在FSH浓度为40 IU/L时最强；其后，随FSH浓度增加各细胞株增殖并不进一步增加。因此，本研究选取20、40、80 IU/L为FSH对卵巢癌细胞的作用浓度。在胡琢瑛等[ 20 ]的研究中，不同浓度的FSH作用于卵巢癌细胞株24、48、72 h后，通过MTT比色法显示，细胞增殖活性均较对照组升高，但仅40 IU/L浓度的FSH作用48 h时差异有统计学意义。因此本实验选24、48、72 h作为FSH作用的时间点。本研究结果表明FSH对Dsc3、EGFR的表达有上调作用，并呈一定的剂量-时间依赖性，选取FSH对Dsc3表达影响的较佳浓度40 IU/L与较佳时间48 h进行后续实验。本研究又通过分别干扰Dsc3和EGFR，研究这两个分子是否对信号通路分子产生影响，结果表明干扰Dsc3后对EGFR、pAkt在蛋白水平的表达有抑制作用，对Akt无明显作用，FSH对EGFR、pAkt的上调作用被抑制，对Akt作用不明显；干扰EGFR后对pAkt、Dsc3在蛋白水平的表达有抑制作用，对Akt无明显作用，FSH对pAkt的上调作用被抑制，对Akt作用不明显。同样，将干扰实验应用到MTT检测细胞增殖情况，结果表明分别干扰Dsc3和EGFR后，对卵巢癌细胞增殖有抑制，并且FSH作用后能明显促进细胞增殖(P<0.05)。之后进一步实验证明通过PI3K/Akt通路是否能影响细胞增殖，故应用该信号通路阻断剂LY294002处理细胞，蛋白质印迹分析结果表明阻断该通路后pAkt、Dsc3表达下调，Akt无明显变化，FSH对pAkt、Dsc3的上调作用被抑制，对Akt无明显影响，MTT实验进一步证实阻断该通路后，卵巢癌细胞的增殖相比对照受抑制，FSH作用后增殖活性较对照明显升高(P<0.05)，从而说明PI3K/Akt信号通路确实介导了卵巢癌细胞的增殖。
综上所述，本研究结果表明Dsc3确实介导了FSH通过EGFR/Akt通路并调控的卵巢癌细胞增殖活性，进而促进卵巢癌的发展。但是，Dsc3是否会影响卵巢癌或者其他肿瘤细胞的侵袭、凋亡、增殖等，本实验并未进行研究并且目前尚少有研究及报道，另外该家族的蛋白在肿瘤细胞发生发展中所起的作用，文献记载也不多，这是我们今后可以考虑的研究方向。通过我们的进一步研究，如果能证实Dsc3对肿瘤细胞的调控的机制，将更有效的指导临床应用。
4 利益冲突
所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。
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