鼻咽癌是我国南方地区常见的头颈部恶性肿瘤之一[1],不易早期发现,治疗效果也不甚理想[2,3]。基因易感性、潜在EB病毒感染以及过度摄入亚硝胺食品是鼻咽癌发病的高危因素[4 ,5 ,6]。DNA损伤及修复机制在多种癌症的发生发展中起重要作用[7],而DNA修复基因的单核苷酸多态性(SNP)是癌症易感性的重要原因和分子基础[8,9 ,10]。人类X射线交错互补修复基因1( X-ray repair cross-complementing gene,XRCC1)是DNA碱基切除修复系统的重要组成部分[11]。在XRCC1中共发现3个SNP位点 ( Arg194Trp、Arg280His 和Arg399Gln)[12],其中194、399位点的基因多态性可能与多种肿瘤的发病相关[13 ,14],且399位点的多态性可能与鼻咽癌的发病有关[15],但各项研究的结果并不一致,推测可能与研究对象的人种不同因而基因频率也有所差异有关。目前尚无关于中国江浙沪地区人群中XRCC1基因多态性与鼻咽癌易感性关系的报道。本研究采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术对XRCC1 194、399位点基因多态性进行检测和分析,探讨我国江浙沪地区汉族人群中XRCC1与鼻咽癌易感性的关系。 1 材料和方法 1.1 研究对象
2012年1月至2013年9月就诊于第二军医大学长征医院耳鼻咽喉科的鼻咽癌患者共87例,其中男性52例,女性35例。发病年龄37~76岁,平均(58.5±19.7)岁。患者均为汉族,长期居住在江浙沪地区。病理诊断全部为鳞状细胞癌,其中低分化50例,中、高分化37例。按照国际抗癌协会(NCCN)2010年头颈部肿瘤TNM分类标准,87例患者中T1N0M0 29例(T1a 15例,T1b 14例),T2N0M0 26例,T2N1M0 19例,T3N1M0 11例,T3N2M0 2例。对照组为自愿参加的健康体检人员,均为汉族,长期居住在江浙沪地区,共94例,其中男性58例,女性36例,年龄35~70岁,平均为(55.6±20.2)岁。鼻咽癌组与对照组的年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05),两组具有可比性。 1.2 DNA提取及纯化
每一实验对象抽取外周静脉血4 mL。采用酚/氯仿抽提、无水乙醇沉淀法分别提取鼻咽癌患者、对照者外周血DNA。采用玻璃奶沉淀法纯化DNA。 1.3 引物设计
根据XRCC1基因多态性位点相对应的基因序列,利用Primer 5.0软件设计PCR扩增引物。引物由长征医院药物基因组学实验室合成。基因扩增引物序列Arg194Trp: 上游5′-GCC CCG TCC CAG GTA AGC-3′, 下游5′-AGC CCC AAG ACC CTT TCA-3′; Arg399Gln: 上游5′-TTG TGC TTT CTC TGT GTC CA-3′, 下游5′-TCC TCC AGC CTT TTC TGA TA-3′。 1.4 PCR反应体系及反应条件
PCR 扩增体系: ddH2O 20 μL,10×PCR(内含Mg2 + ) 缓冲液2.5 μL; 10 mmol /L dNTP 1 μL,Taq酶0.5 μL( 5U/ μL) ,上、下游引物各0.5 μL ( 20 μmol /L) ,DNA 模板1 μL( 500 ng) 。PCR扩增程序: 94.2℃预变性3 min, 94. 5℃变性40 s→退火40 s,温度为60℃→72℃延伸40 s,共39个循环,最后在72℃条件下延伸5 min。 1.5 DNA序列分析
以10个基因组DNA样本为模板,通过PCR扩增,获得XRCC1基因 Arg194Trp、Arg399Gln位点的序列大小分别为466、497 bp,经琼脂糖凝胶电泳检测,结果符合预期。目的条带清晰单一。阳性克隆重新培养,抽提质粒,ABI 3700型DNA测序仪进行焦磷酸DNA测序,测序引物为T7、 SP6。测序结果采用DNAStar软件分析,并与GenBank进行BLAST比较。 1.6 统计学处理
采用SPSS 13.3软件进行统计学分析。采用Mann-Whitney检验比较鼻咽癌组与对照组之间的年龄分布差异,采用χ2检验比较性别分布的差异。用HWE软件检测Hardy-Weinberg平衡,判断研究对象是否具有人群代表性。各组间基因型频率和等位基因频率比较采用χ2检验(Pearson Chi-Square)或Fisher’s确切概率法。以非条件logistic回归计算相对危险度比值比(OR)及95%可信区间(CI),分析各种基因型与鼻咽癌发生的相关性。检验水准(α)为0.05。 2 结 果 2.1 XRCC1 Arg194Trp基因型分布及与鼻咽癌的关系
由表 1可见,鼻咽癌组中Arg、Trp等位基因频率分别为67.8%、32.2%,对照组中Arg、Trp等位基因频率分别为62.8%、37.2%,两组都以Arg/Trp基因型为主。分布频率不符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.03,χ2检验)。鼻咽癌组3种基因型频率与对照组相比差异无统计学意义(P=0.40)。对各种基因型在鼻咽癌组和对照组中的分布进行比较,发现携带Trp/Trp基因型者与携带Arg/Arg基因型者比较,鼻咽癌的发生风险有所降低但差异无统计学意义(OR=0.41,95% CI:0.08~1.65, P=0.21)。Arg/Trp基因型与Arg/Arg基因型相比,鼻咽癌的发生风险无明显差异 (OR=0.82, 95% CI:0.44~1.52,P=0.52)。
![]() | 表 1 鼻咽癌组和对照组XRCC1基因型与鼻咽癌患病风险之间的联系 |
由表 1可见,鼻咽癌组中Arg、Gln等位基因频率分别为81.0%、19.0%,对照组中Arg、Gln等位基因频率分别为84.0%、16.0%,两组都以Arg/Arg基因型为主。分布频率符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.96,χ2检验)。鼻咽癌组3种基因型频率与对照组相比差异无统计学意义 (P=0.73)。对各种基因型在鼻咽癌组和对照组中的分布进行比较,携带Arg/Gln基因型以及Gln/Gln基因型与携带Arg/Arg基因型相比,鼻咽癌的发生风险差异无统计学意义 (OR=1.20,95%CI:0.63~2.30,P=0.58; OR=1.69,95%CI: 0.25~14.97,P=0.59)。 3 讨 论
鼻咽癌发病具有明显的地域性和种族性,我国南方地区属于世界范围内的高发地区[1]。因此,在研究XRCC1基因多态性与鼻咽癌发病的相关性时,将不同地域及种族人群作为独立因素加以分析,更具有实际意义。有研究显示,相较于194、399位点,XRCC1 Arg280His的多态性与DNA修复能力和癌症发病关系较小[14],且由于280位点基因多态性发生频率较低,所以在本实验中,本研究只对XRCC1的194和399位点进行了研究。
本研究结果显示,我国江浙沪地区汉族人群中XRCC1基因的Arg194Trp、Arg399Gln多态性分布与中国广东地区及亚洲其他地区人群相近,而与美国、欧洲和印度人群有明显差异[16,17]。399位点Arg/Arg基因型频率在亚洲人群较高,为50%~70%,欧美人群较低,为40%~50%; Gln/Gln基因型多见于欧美人群,为9%~13%,亚洲人群为 5%~8%[16 ,17,18,19]。由此可见,Arg194Trp、Arg399Gln位点的基因多态性存在种族和地区差异。
本研究结果显示,我国江浙沪地区汉族人群中XRCC1基因194位点中3种基因型Arg/Arg、Arg/Trp、Trp/Trp以及399位点中3种基因型Arg/Arg、Arg/Gln、Gln/Gln在鼻咽癌组和对照组中分布基本类似,其分布的差异无统计学意义。本研究结果还显示,XRCC1基因Arg194Trp、Arg399Gln位点多态性与鼻咽癌易感性无明显相关性,这与既往报道的鼻咽癌及其他系统癌症的相关性研究的结果[16 ,17,18]并不完全一致,然而对比各种基因型在鼻咽癌组和对照组中的分布,我们发 现,194位点中携带Trp/Trp基因型者鼻咽癌的发生风险与携带Arg/Arg基因型相比有所降低(OR=0.41,95% CI:0.08~1.65, P=0.21),虽然其差异没有统计学意义,但结合相关文献中194位点的Trp等位基因可能对DNA损伤有保护作用的结论[16, 20],我们推测194位点的Trp等位基因或许能降低鼻咽癌发病风险。此外,Huang等[16]根据多项研究进行meta分析,发现399位点的Gln等位基因可能增加鼻咽癌的发病风险,这一点在本研究中未得到证实。
由于不同种族不同地域之间的基因频率可能存在差异,而本研究的研究人群均为汉族人,且集中在江浙沪地区,因此,这些因素可能是导致本研究结果与其他研究结果不一致的原因之一。另外,样本量小、非随机抽样、未知的混杂因素和修饰因素等也可能影响研究结果。癌症的发病是多因素、多途径共同作用的结果。不同致癌物可能引起不同类型的DNA损伤,基因的相互作用也可能在癌症的发生发展中起到作用。因此,XRCC1基因多态性对于鼻咽癌发病的影响,需要进一步做多中心、大样本的临床研究进行验证,也需要细胞学等基础研究进行进一步论证。 4 利益冲突
所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。
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