第二军医大学  2014, Vol. 35 Issue (4): 443-446   PDF    
引用本文
吕虎, 徐娟娟, 陈辉, 许华, 孙继虎, 蔡志扬, 熊源长. 活性氧对背根神经节P2X3受体介导的痛信号功能的影响[J]. 第二军医大学学报, 2014, 35(4): 443-446  
LÜ Hu, XU Juan-juan, CHEN Hui, XU Hua, SUN Ji-hu, CAI Zhi-yang, XIONG Yuan-chang. Effect of reactive oxygen species on dorsal root ganglion P2X3 receptor-induced pain signal[J]. Academic Journal of Second Military Medical University, 2014, 35(4): 443-446 (in Chinese with English abstract)  
活性氧对背根神经节P2X3受体介导的痛信号功能的影响
吕虎1, 徐娟娟1, 陈辉1, 许华1, 孙继虎2, 蔡志扬3, 熊源长1    
1. 第二军医大学长海医院麻醉科, 上海 200433;
2. 第二军医大学基础部生理学教研室, 上海 200433;
3. 武警8710部队医院麻醉科, 莆田 351133
收稿日期:2013-10-7     接受日期: 2013-12-24.
基金项目：国家自然科学基金（81070894）.
作者简介：吕虎，住院医师.E-mail：lvhu086@gmail.com；徐娟娟，硕士生.E-mail：xujuanjuan2011@163.com
通信作者(Corresponding author)：Tel: 021-31161838 E-mail:ychxiong@sina.com
摘要：目的 探讨活性氧（reactive oxygen species，ROS）对P2X3受体介导的神经病理性疼痛作用的影响。方法 用成年雌性SD大鼠建立背根神经节慢性压迫（CCD）神经病理性疼痛模型，建模成功后随机分为4组（每组10只），经腹腔分别注射生理盐水（NS）、PBN 100 mg/kg、PBN 30 mg/kg、PBN 10 mg/kg，给药30 min后，经足底注射P2X3受体特异性激动剂α，β-meATP 50 nmol，体积为50 μL，持续观察注射后15 min内的自发缩足次数和主动悬足时间，并整合计算每2 min内的综合悬足时间（PLTPM）。结果 PBN能够剂量依赖性抑制由α，β-meATP引发的自发性痛行为，与NS组比较，PBN 100 mg/kg组在前6 min内能明显抑制自发性疼痛，差异具有统计学意义（P<0.05），而PBN 30 mg/kg组大鼠仅在2至4 min时间单位表现出差异有统计学意义（P<0.05）。结论 氧自由基清除剂可以有效缓解由CCD模型引发的神经病理性疼痛及P2X3受体激动剂诱发的自发痛，ROS可能作为信号分子参与了P2X3受体介导的痛觉信息的传递。
关键词： 活性氧     P2X3受体     背根神经节慢性压迫     神经病理性疼痛     自由基清除剂    
Effect of reactive oxygen species on dorsal root ganglion P2X3 receptor-induced pain signal
LÜ Hu1, XU Juan-juan1, CHEN Hui1, XU Hua1, SUN Ji-hu2, CAI Zhi-yang3, XIONG Yuan-chang1    
1. Department of Anesthesiology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China;
2. Department of Physiology, College of Basic Medical Sciences, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China;
3. Department of Anesthesiology, Hospital of No. 8710 Troop of Chinese People's Armed Police Forces, Putian 351133, Fujian, China
Abstract: Objective To investigate the effect of reactive oxygen species(ROS) on P2X3 receptor-mediated neuropathic pain. Methods Neuropathic pain model was induced in female Sprague Dawley rats by chronic compression of dorsal root ganglia (CCD), and the CCD rats were randomly divided into 4 groups (each group containing 10 rats): Saline group (NS group); PBN 100 mg/kg treatment group; PBN 30 mg/kg treatment group; and PBN 10 mg/kg treatment group. The specific agonist of P2X3 receptor, α, β-meATP (50 nmol in 50 μL), was subcutaneously injected into the plantar surface of the right hind paws of each rat 30 min after PBN or NS injection. The spontaneous paw flinching times and withdrawing time were observed for 15 min after injection and the paw lift time per minute (PLTPM) in every 2 minutes was calculated. Results Pre-treatment with PBN inhibited α, β-meATP-induced spontaneous pain in a dose-dependent manner. Compared with the NS group, PBN 100 mg/kg group significantly inhibited flinching response during the first 6 min (P<0.05), while the rats in PBN 30 mg/kg group only had significantly attenuated flinching response during the second to the fourth minute compared with NS group(P<0.05). Conclusion Oxygen free radical scavenger can effectively alleviate the neuropathic pain caused by CCD and P2X3 receptor agonist-induced spontaneous pain. ROS may act as a messenger in P2X3 receptor-mediated pain signaling transmission.
Key words: reactive oxygen species     P2X3 receptor     chronic compression of dorsal root ganglia     neuropathic pain     free radical scavengers    

慢性腰背痛是一种临床上常见的疾病,椎间盘突出是常见病因之一,但至今尚无明确机制解释这种神经病理性疼痛的形成和发展。椎间盘突出诱发外周背根神经节及邻近神经根敏感性增强,促使机体发生外周敏化。P2X3受体选择性表达于背根神经节和三叉神经节的中小直径感觉神经元之上,与痛觉信号的传递密切相关,在神经病理性疼痛时表达上调[1]。近年来研究表明,活性氧(reactive oxygen species,ROS)在神经病理性疼痛中发挥重要作用,参与活化多种疼痛相关受体[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11],而应用非特异性的氧自由基清除剂苯亚甲基叔丁基氮氧化物(PBN)可产生镇痛作用 [12,13]。本研究将ROS与P2X3受体功能相联系,观察ROS是否参与P2X3受体介导的痛信号传递。 1 材料和方法 1.1 实验动物

健康雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠,平均体质量(130±10) g,由第二军医大学实验动物中心提供,并在安静、温暖(20℃)、避强光的环境下饲养,自由饮水、摄食。 1.2 主要试剂及仪器 PBN(货号B7263,Sigma公司,美国),P2X3受体特异性激动剂α, β-meATP(货号M6517,Sigma公司,美国),Von Frey纤维丝(Stoelting公司,美国)。 1.3 建立背根神经节慢性压迫(CCD)模型及实验分组

1%戊巴比妥钠(5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠后,沿L4～L6脊椎右缘切开皮肤,钝性分离肌肉并暴露右侧L4、L5椎间孔,用弯成直角的4#针头试行探入椎间孔后退出。再将2根长4 mm、直径0.63 mm的“L”形不锈钢柱沿针道各插入右侧L4及L5椎间孔,以形成对L4、L5背根神经节及邻近神经根的固定压迫。分层缝合肌肉及皮肤,大鼠恢复知觉后送回动物房饲养。用Von Frey 纤维丝测试大鼠术后1～7 d的机械痛缩足阈值(paw withdrawal mechanical threshold, PWMT)[1],若PWMT下降超过20 mN,表明建模成功。若达不到此标准,则剔除此只大鼠。将建模成功的大鼠随机分为4组(每组10只): 生理盐水(NS)组、PBN 100 mg/kg组、PBN 30 mg/kg组、PBN 10 mg/kg组。 1.4 自发痛行为学测试

将建模后第7天的大鼠单个放在有机玻璃盒中,适应环境20 min。按照5 mL/kg体积标准经腹腔给予各组相应剂量后0.5 h,在大鼠背根神经节压迫侧足底注射α, β-meATP 50 μL(浓度1 nmol/μL)。注射后立即将大鼠放回原先所在的盒子中继续观察,记录大鼠脚掌每分钟悬在空中的总时间(单次悬空时间大于2 s)及自发性缩足次数。计算每2 min的综合悬足时间(paw lift time per minute, PLTPM),计算公式为: 主动悬足时间+1/3自发缩足次数,作为评价α, β-meATP引起自发痛行为强度的主要指标。 1.5 统计学处理

所得计量数据用 ±s表示,使用SigmaStat 3.5统计软件包进行分析,组间比较、各不同时点间比较采用重复测量的方差分析,两两比较采用Dunnett t检验。检验水准(α)为0.05。 2 结 果

CCD大鼠在足底注射α, β-meATP后,PLTPM显示缩足反应的最高点出现在注射后第一个2 min,在注射后10 min时反应几乎消失;注射后第一个2 min,NS组大鼠PLTPM峰值明显高于PBN 100 mg/kg组(P<0.05),同时2倍高于PBN 30 mg/kg组(P<0.05),与PBN 10 mg/kg组差异无统计学意义(P>0.05);在注射后第二个和第三个2 min时间段,PBN 100 mg/kg组与NS组相比,差异仍然具有统计学意义(P<0.05),见图 1。 3 讨 论

临床上很多患者的腰背痛是由于突出的椎间盘压迫到脊神经根而引起的。利用不锈钢钢丝穿过椎间孔来固定压迫背根神经节(即CCD模型),模仿临床椎间盘突出患者的发病机制,可引起躯体感觉神经元兴奋性升高、自发性动作电位生成增多,导致痛觉过敏、自发痛或机械性痛觉异常。

图 1 腹腔注射PBN对α, β-meATP诱发痛行为的影响 PBN: 苯亚甲基叔丁基氮氧化物; PLTPM: 综合悬足时间. *P<0.05与NS组比较. n=10, ±s

近年来研究表明，ROS在神经病理性疼痛中发挥重要作用。脊神经结扎、辣椒素注射、吗啡耐受 [2]和化疗药物[3,4]引起的机械性痛觉异常等多种动物疼痛模型中，ROS生成量明显增多，与热痛觉过敏程度一致，而抗氧化剂如PBN、TEMPOL、DMPO以及维生素E等，均能缓解机械性痛觉过敏程度。病理状态下ROS生成量增加，不可逆地损害神经元细胞膜,造成脂质过磷酸化,改变细胞兴奋性[5]，最后诱发疼痛相关受体活性增强，促使伤害性刺激的传入，促使机体产生痛觉过敏。例如，ROS触发宽动力范围神经元释放兴奋性递质谷氨酸，继而激活离子型谷氨酸受体N-甲基-D-天冬氨酸 (N-methyl-D-aspartate，NMDA)，ROS也可以直接通过PKA和PKC途径激活NMDA受体[6,7]；增加瞬时受体电位香草酸受体1(TRPV1受体)活性[8]，或调控TRPV1受体释放多种致炎因子[9,10]；除此之外氧化应激产物还可刺激瞬间受体电位离子通道类A成员1受体(TRPA1)提高神经元兴奋性[11]。

PBN是一种非特异性ROS清除剂，文献报道经鞘内、侧脑室注射通过抑制中枢敏化环节[12]，经腹腔注射抑制外周敏化达到镇痛效果[13]，这一系列作用减弱了痛觉的中枢敏感化和外周伤害性刺激的传递扩散，使原发痛及继发痛在一定程度上得以缓解。本研究中CCD手术后第7天已达模型稳定期，腹腔注射PBN不会对实验大鼠产生镇静作用，与既往文献报道一致[6,14]。前期研究中我们曾选用100 mg/kg和30 mg/kg两种剂量来探索PBN的镇痛效果，观察压迫侧后足PWMT在给药后24 h各时间点的变化，证实100 mg/kg PBN注射后大鼠压迫侧后足PWMT明显升高，结合低剂量组数据表明，PBN在给药后0.5 h镇痛效果最佳，作用时间至少为2 h[15]。在大鼠患侧足底皮下注射50 nmol的外源性α, β-meATP能够引起假手术组和CCD组大鼠PLTPM值均出现增加，但CCD组显著高于假手术组，并且其PLTPM的峰值大约是假手术组的两倍。因此本实验将足底注射的α, β-meATP固定为50 nmol，足底注射α, β-meATP前0.5 h通过腹腔给予不同剂量PBN进行预干预，在体行为学发现高剂量PBN (100 mg/kg)能明显抑制由外周足底注射P2X3受体特异性激动剂α, β-meATP诱发出的自发痛程度。

P2X3受体是嘌呤能受体家族一员，属于配体门控非选择性阳离子通道受体，选择性表达在伤害性信息传递相关的初级传入感觉神经元的胞体、中枢端和外周端，被ATP等激活后产生去极化动作电位引起疼痛，参与多种急慢性疼痛的发生机制，我们前期研究证实在CCD模型大鼠背根神经节神经元上P2X3受体数量表达上调、功能增强[1]，而胞体中P2X3受体上调可导致其两端的神经突触表面上的P2X3受体表达的增加，结果造成外周神经末梢P2X3受体表达增加，从而增强机体对外源性α, β-meATP引起的痛反应，目前国内外的实验结果表明PGE2、NGF、SP和谷氨酸都能增强P2X3受体激动剂激发的内向电流，上调P2X3受体功能[16]。但关于ROS是否参与P2X3受体的痛信号过程，目前尚无文献报道。

本研究结果显示，在背根神经节受到慢性压迫的大鼠，足底给予P2X3受体激动剂α, β-meATP可诱发出显著的自发性疼痛，提示可能存在P2X3受体介导的痛信号增强,而提前全身应用ROS清除剂PBN，可剂量依赖性地减弱这一痛信号。因此推测ROS可能作为信号分子参与了P2X3受体介导的痛觉信息的传递。但本研究仅为动物在体实验，下一步我们将在细胞学层面上深入探讨ROS与P2X3痛信号通路之间的关系。 4 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。

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