肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是我国泌尿系统肿瘤中发病率仅次于膀胱癌的常见恶性肿瘤。近年来，RCC发病率持续增长^[1]，男性发病率高于女性，男性50岁、女性55岁以后RCC发病率迅速增加。虽然RCC整体生存情况较好，5年生存率可达70%^[2]，但即便RCC患者行根治术后，仍有25%～30%的患者预后不良、发生远处转移。RCC是少见的对放疗和化疗均不敏感的实体瘤，对以白细胞介素-2和干扰素为基础的免疫治疗应答率只有20%左右。因此实施系统靶向治疗是治疗晚期RCC患者的主要手段。RCC是高度异质性的肿瘤，根据达尔文进化论的基本观点“遗传变异、自然选择、适者生存”，癌细胞在进化发育过程中也存在优胜劣汰的过程：在肿瘤微环境的压力下，具有不同能力的突变癌细胞亚克隆被选择出来,由此维持着整个实体瘤的生存、持续扩张、浸润甚至远处播散。这种异质性不仅体现在不同RCC个体诊断、治疗、预后间的差异性上，而且体现在每个RCC个体实体瘤内部亚克隆表型的差异上。以肿瘤的进化发育理论为基础，探讨RCC个体间及个体内的肿瘤异质性，是阐明RCC恶性进展机制的关键步骤，是切实开展个体化治疗的必经之路。 1 RCC患者个体间异质性规律

RCC患者个体间的异质性规律，即RCC的进化发育，贯穿于RCC发生发展、转移、转归的各个阶段。 1.1 RCC发生的分子机制

RCC是起源于肾皮质的高度异质性肿瘤^[3]，主要病理类型有肾透明细胞癌(ccRCC，75％～80％)、乳头状RCC(10％～15％)等。ccRCC中50%的患者发生VHL基因突变，近些年来大规模外显子测序技术陆续发现了新的中国人RCC发生相关基因，如PBRM1^[4] 和BAP1^[5]等。乳头状RCC主要与c-Met癌基因突变有关,当MET基因过度激活可使细胞增殖分化调节紊乱，诱发血管形成和增加细胞运动性，从而促进肿瘤的形成和生长。除了经典的VHL-HIF信号通路变化,主要参与ccRCC发病的还包括Notch^[6]、核因子B(NF-B)^[7]、MAPK^[8]、PI3K/Akt^[9]等通路的异常活化。在我们的研究中，首次确定了谷胱甘肽S-转移酶μ3(GSTM3)、CYR61、SLC15A1、AV722783为新的ccRCC肿瘤抑制基因^[10]。DNA 启动子甲基化造成的基因沉默与RCC发生密切相关，我们在ccRCC中检测到GSTM3启动子区CpG岛甲基化会降低该基因的表达，并已初步筛选出ccRCC中GSTM3基因启动子区CpG岛甲基化位点^[11]。我们还发现ccRCC组织中存在2种新型的转录因子19(TCF19)的替换剪接异构体(TCF19-1、TCF19-3)。通过实时荧光定量PCR检测证实这2种异构体在癌和癌旁组织中均表达,但TCF19-1在原发癌组织中表达率高于癌旁组织，而TCF19-3在癌旁组织中的表达率与原发癌组织相似，提示TCF19-1的表达可能与ccRCC的发生有关^[12]。应用免疫组化分析等方法，我们首次发现PTPRD基因在ccRCC起源的部位即正常肾组织近曲小管肾上皮细胞中表达，而在ccRCC肿瘤组织中显著下降^[13]。由此提示PTPRD基因是ccRCC发生的抑癌基因，是潜在的ccRCC治疗靶点。上述的这些研究丰富了我们对RCC发病分子机制的认识。此外，我们通过病例-对照研究发现，体质指数BMI(≥25 kg/m²)、高血压病史和肾结石病史是ccRCC的主要危险因素；而饮用绿茶(≥500 mL/d)则是ccRCC的保护因素^[14]。据此建立稳定的RCC高危人群队列，如45岁以上的高血压患者、尿结石患者等，进行长期的跟踪随访并采取必要的干预措施，可使高危人群预防RCC发生获得明显改善。

在遗传易感性方面，我们的研究首次发现在白种人中与肿瘤易感性相关基因CYP1A1m4的遗传多态性位点(rs1799814)在中国人中并不存在；同时CYP1A1(rs4646903、rs1048943)、NAT2(rs1799929、rs1799930、rs1799931)及GSTP1(rs1695)在ccRCC组和健康对照组中的多态性分布的差异性没有统计学意义，提示这些代谢酶基因遗传多态性对中国人RCC危险因素的贡献率较低^[14]，而一组位于EPAS1、PTPRD等基因的ccRCC遗传多态性位点(rs1867785、rs7105934、rs4765623、rs7579899、rs2279776)在判定个体ccRCC易感性方面具有重要参考价值^[15]。通过表达谱芯片发现的抑癌基因GSTM3在癌旁正常组织、原位癌组织、转移癌组织中的表达依次降低^[10]，其低表达机制可能与位于其启动子区域的rs1332018位点的等位基因C有关。病例-对照研究显示，rs1332018基因型AC+CC与RCC发生风险相关且有统计学意义,COX回归分析也证明rs1332018基因型AC+CC是影响RCC患者术后的独立危险因素^[16] ，由此提示rs1332018基因型是贯穿RCC发生发展预后的关键事件，在RCC的进化发育中起到了关键作用。 1.2 RCC的早期诊断

早期筛查是实施肿瘤二级预防的主要手段，是争取早期诊断、早期治疗、防止或减缓疾病发展的主要措施。由于RCC的起病较为隐匿，没有明显的癌前期病变，患者诊断时已处于疾病的临床期。此时癌细胞累积的突变较多，在环境压力下已通过进化筛选出较为恶性的克隆，因此难以明确RCC的早期分子事件，这也是RCC至今仍无特异性的早期诊断分子靶标的原因之一。一方面，通过建立稳定的RCC高危人群队列，长期跟踪观察人群中RCC的发生、发展、预后等情况，对于挖掘特异性的RCC早期诊断标志物可能更加有效，这对于研究验证RCC进化发育的关键分子事件也是必不可少的。另一方面，目前国际上针对部分肿瘤没有特异性的诊断标志物的情况，采用富含关键基因的基因表达谱进行预测，可能比单个基因的预测效果要好，灵敏度及特异度均有所提高^[17]。 1.3 RCC转移、预后的异质性规律

在转移灶中，新的肿瘤微环境给转移灶肿瘤带来新的选择压力，同时又伴随着转移这个过程本身赋予转移肿瘤细胞的选择压力，这为转移灶和原发灶基因型的不同找到了合理的解释。自1994年以来，我们教研室先后建立系列中国人ccRCC细胞系,包括早期汉族人ccRCC细胞株、人高转移性ccRCC细胞株、低转移性ccRCC细胞株^[7]和肾肉瘤样癌细胞株，及RCC原位移植动物模型。高转移性ccRCC细胞株的NF-κB通路的激活水平明显较低转移性ccRCC细胞株高，提示NF-κB通路引起的炎症反应不仅参与了RCC的发生，而且参与了RCC的恶性进展。以上研究获得了中国人系列RCC细胞株和建立的RCC转移模型，为研究中国人RCC发生和转移的分子机制、探索我国RCC发生和转移分子标志和治疗靶标奠定了物质基础和技术储备。

我们应用cDNA microarray方法筛查不同转移潜能原代培养ccRCC细胞之间差异表达基因，结合一系列数据挖掘的方法，最终发现一组潜在的与RCC转移相关的新基因FSTL1、AV722783、GSTM3、SLC15A1、DDX17、ORC2L和PKMYT1等。以非转移性ccRCC组织表达谱为对照，转移性ccRCC组织中上调表达的基因有PKMYT1和ORC2L等，下调表达的基因有FSTL1、GSTM3、SLC15A1和AV722783等。我们在原位癌与癌旁组织的差异表达分析中，也获得类似的表达趋势。因此这些基因可能与ccRCC发生、发展密切相关，是RCC进化发育的关键分子事件^[10]。

影响RCC预后的最主要因素是病理分期，但同一分期患者间的预后仍存在较大的差异，因此需要建立完善的预后预测模型。通过研究基因进化的差异可引入新的分子标志，进一步提高预测模型的预测效能。我们在筛查RCC中染色体3p、9p、14q的微卫星不稳定(MSI)及杂合性缺失(LOH)中发现，D9S168位点的MSI及LOH与RCC患者预后不良有关。D9S168的微卫星改变普遍存在于高分期肿瘤中，存在D9S168微卫星改变的患者预后较差，其中D9S168位点LOH患者的预后更差，COX回归分析结果证实D9S168是与肿瘤死亡相关的独立危险因素^[12]。其机制可能是由于D9S168位于抑癌基因PTPRD内，它的多态性影响了PTPRD的表达，进而显著影响患者预后^[13]。 1.4 RCC的免疫治疗

由于RCC对化疗和放疗均不敏感，对于晚期RCC患者，免疫治疗方法被寄予了希望，如细胞因子白介素-2和干扰素α是目前临床上治疗RCC的主要生物免疫制剂。此外还有自体细胞免疫疗法，该方法是从患者体内提取部分免疫细胞，体外进行培养、诱导、激活，再把这些抗肿瘤细胞回输到患者体内杀灭肿瘤细胞。尽管免疫疗法暂时对一部分RCC患者有治疗效果，但部分RCC细胞克隆已经进化到具备逃避免疫监测的能力，最终导致免疫治疗失败。RCC细胞这种逃避免疫疗法的过程，实质上反映了肿瘤细胞进化发育的过程是：只有适应来自肿瘤微环境免疫压力的亚克隆才能不被淘汰，这些亚克隆增殖扩张最终导致患者对免疫疗法的逃逸免疫。在Seliger的综述中从三个方面归纳解释了免疫逃逸的机制：(1)改变肿瘤细胞自身，从而使得肿瘤细胞不被免疫系统识别，例如下调肿瘤细胞表面的主要组织相容性复合物Ⅰ类抗原 (MHCⅠ),使得细胞毒性T细胞不能识别肿瘤，从而减轻免疫细胞对肿瘤的杀伤作用。(2)改变肿瘤微环境，例如改变环境中的细胞因子种类和数量，可促进肿瘤细胞的免疫逃逸和继续生长。(3)破坏肿瘤微环境中的免疫细胞的功能，降低周围环境的免疫压力^[18]。肿瘤细胞还可以诱导能够抑制免疫反应的细胞如Tregs的增殖。与正常人群相比，RCC患者外周血中Treg较高^[18]。为了探索免疫治疗抗肿瘤机制，我们采用Whiteside方法从临床ccRCC组织中成功分离到浸润性淋巴细胞(TIL) ，体外联合白介素-2培养，结果表明白介素-2激活的TIL具有杀伤肿瘤活性，且对自体肿瘤细胞的杀伤活性更强^{[19, 20]}。以白介素-2为基础的免疫治疗对ccRCC的杀伤活性主要由T淋巴细胞介导。TIL在肿瘤原位长期受ccRCC相关抗原致敏，是活化型TIL对ccRCC造成特异性杀伤能力的重要原因之一。TIL抗肿瘤能力与自分泌免疫调节细胞因子能力相关且有统计学意义。TIL分泌免疫调节细胞因子是活化型TIL的标志之一。白介素-2和干扰素β只有在肿瘤-免疫微环境中才明显提高TIL抗肿瘤活性。 2 RCC个体内异质性规律

近期，英国伦敦癌症研究所的Gerlinger博士及其研究小组，采用多点外显子深度测序的方法探索RCC患者的基因架构及肿瘤进化轨迹^{[21, 22]}，结果发现，随着分析的活检组织数目的增加，肿瘤内异质性的程度也随之增强。同一RCC患者体内，不同区域(原发灶组织，转移灶组织)、不同时间点(化疗前、化疗后)肿瘤的突变谱均显著不同。以上结果充分证实了实体瘤内部高度异质性，同时也说明肿瘤在环境压力下不断进化。

由于许多突变在同一患者不同区域的肿瘤组织样本中并不普遍存在，即在同一患者体内不同区域的肿瘤组织其突变情况是不同的，提示在进行靶向治疗时，需要进行多位点采样分析。该小组绘制的分枝状肿瘤进化模式图强调了针对那些普遍存在系统树主干上的变异进行靶向治疗的重要性,例如VHL、PBRM1和SETD2这些与RCC发生发展重要相关的体细胞基因即位于染色体3p上，靶向针对进化树主干上的关键变异事件有可能降低个体间治疗效果的差异，从而提高RCC临床治疗效果的普遍性。由此可见，将癌症进化的观念引入到RCC的靶向治疗上，有可能将靶向治疗推向一个新的高度，即直接遵循肿瘤的进化适应轨迹，从而设计干扰以减慢或负向调控癌症进化，最终预防或延缓癌症患者的死亡，达到使致死的癌症转变为慢性疾病的目的。 3 结 语

由于基因的不稳定性赋予肿瘤干细胞的遗传变异，为肿瘤细胞选择免疫逃逸提供了基础，因此，尽管在癌症治疗方面已经取得了较大的进展，但如何有效地控制或消除一些晚期或已转移的恶性肿瘤，仍是人类面临的一大挑战。阐明癌症多样化克隆的动态变化和选择的分子机制是理解肿瘤进展和治疗反应异同的关键，在指导癌症靶向治疗和个体化治疗、降低病死率方面具有实际意义。 4 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。