乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是世界范围内的重大健康课题，全球约30%的人口有当前或既往感染的血清学迹象，约3/4的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者由慢性乙肝引起^[1]。尽管在我国免疫接种的规范化普及使得HBV感染发病率有所下降，但是由既往感染引起慢性乙肝的患者人数仍然巨大。根据2006年我国HBV感染流行病学调查资料，大陆地区有约9 400万慢性HBV感染者，其中68.3%为基因型C(长江以北地区占77.1%)^[2]。而在台湾地区流行的HBV感染者中80%为基因型B，且30~75 岁期间的单纯 HBV感染人群中男、女HCC累计发病率分别为27.38%和7.99%^[3]。由于C型HBV比B型具有更强的致癌能力^[4]，因此可推测未来50年内在我国大陆地区，超过30%的男性和10%的女性HBV慢性感染者将发生HCC。缓解以上沉重疾病压力的关键措施是针对高危风险因素进行早期干预。活动性肝炎、高病毒载量以及HBV突变不仅是HBV感染者罹患HCC的危险因素，也是HCC患者手术治疗预后不良的危险因素^[5]。因此，通过抗病毒治疗，尽早消除炎症状态并彻底清除病毒不仅是肝炎治疗的重点和难点，也是防止或延缓肝炎发展为肝硬化和HCC的重要措施。

虽然大量临床研究证明抗HBV治疗可以降低HCC发病率并改善预后^{[6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13]}，却仍有对随机临床对照试验的荟萃分析得到了抗病毒治疗对HCC预防效果有限的结论^[14]。通过对HBV在肝炎-肝硬化-肝癌演变过程中变异规律的总结^{[15, 16, 17, 18, 19]}，同时依据癌症逆向进化和APOBECs核酸编辑酶促突变的科学现象，我们提出了癌症进化发育学的理论^[20]。这个理论认为，由先天遗传因素和后天环境因素如病毒感染的交互作用导致的免疫平衡失调维持了慢性非可控性炎症，后者促进癌症发生和发展并贯穿以“变异-选择-适应”为特征的癌症进化发育过程的始终。癌症进化发育学说不但有助于揭示HBV慢性感染的致癌机制，而且对通过控制HBV来阻遏癌症进化和发育进程、特异性预防HCC具有指导作用。 1 HBV病毒及其进化发育现象 1.1 HBV病毒基因结构与复制特点

HBV属于嗜肝病毒科，包含1条3.2 kb的不完全环状双链DNA，负链为全长基因，正链只有其长度的20%~80%。HBV有4个开放阅读框(open reading frames,ORF)，即S区、C区、P区和X区，主要编码的蛋白有表面抗原蛋白(HBsAg)、核心蛋白(HBcAg)、核酸聚合酶以及X蛋白(HBx)。HBV前S区(pre-S)负责结合宿主细胞、控制HBV感染，同时具有S区启动子/增强子功能，影响HBsAg表达。具备免疫细胞T、B结合位点和反式转录结合位点，影响病毒免疫清除和致癌作用。HBV_X基因3′端上还包括2条增强子序列(EnhⅠ和EnhⅡ)，可以调节HBV启动子的转录，比如基本核心启动子(BCP)，可以调控核心区的转录。HBV前C区(PC)控制HBV e抗原(HBeAg)表达。HBV的ORF相互重叠，调控序列位于蛋白编码序列之中。利用这样的特点，HBV-DNA可以编码多种蛋白质，但也因此造成了基因序列相对不稳定性，而且重叠区域的突变所带来的功能变化也更为复杂。

HBV的复制过程有2个突出的特点。首先，HBV在侵入细胞核后会由HBV聚合酶修复正链，使之与负链互补并形成共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)。这是一种通过共价键结合的稳定的超螺旋结构，与HBV治疗后复发密切相关，也是抗病毒治疗的难点之一。其次，作为双链DNA病毒，HBV复制有RNA反转录病毒的特性，需要以cccDNA合成前基因组RNA，再由反转录酶于核衣壳内合成负链DNA。HBV的反转录酶缺乏校对功能，所以无法及时校对并修复HBV在反转录过程中出现的点突变、缺失、插入等变异。这一特性使得HBeAg阳性感染者的突变率达到(1.5~5)×10^-5核苷酸替换/(位点·年)^[20]。慢性炎症可促进HBV变异过程，但是能够生存下来的HBV变异程度是有限的，HBV编码基因(结构基因如C基因和S基因以及功能基因如P基因)交叉存在，如果HBV变异影响了病毒复制关键的结构和功能基因，病毒复制能力降低，在准种竞争中处于劣势，就难以保存下来；此外，如果HBV变异增加了免疫源性，那么很容易被免疫清除，尤其是在活动性炎症状态下。因此，经生存和免疫选择保留下来的HBV变异一定遵循某种固有的规律。这为HBV的进化提供了大量可供环境选择的固定变异。 1.2 HBV免疫清除机制及进化发育特点

HBV在宿主间的进化相对保守，始终保持为具有感染优势的野生型。在侵入人体后，HBV变异大量出现并在慢性炎症致癌的过程中不断积累，到癌症阶段时HBV多以变异型存在，然而在母婴传播中能够突破胎盘屏障的HBV又以野生型为主，变异型则无法通过^[21]。这些变异型病毒往往具有免疫逃逸的生存优势或是基因整合的致癌能力。比如，与HBV前S抗原(pre-S)区的“野生型”相比，“突变型”更容易使病毒保留在细胞内，从而促进细胞的恶性转化；HBV-BCP区中的羧基末端截短型HBx蛋白(Ct-HBx)，失去了其抑制细胞增殖和转化的能力，却可以结合p53基因，减弱了DNA修复功能和p53介导的凋亡作用，有助于癌症的发生^[20]；与之类似，HBV pre-S区和HBV Enh Ⅱ/BCP/PC区的相关基因突变不仅是HCC发生的独立危险因素，还可以用来预测癌症的预后和复发风险^{[15, 16, 17, 18, 19]}，C型HBV的致癌性强于B型也是因为前者携带更多的HCC相关突变^[22]。可见，HBV在体内呈现一种感染性下降、生存和致癌能力上升的“末路进化”特征。目前认为，HBV变异本身是随机的，所以进化的半定向性应来源于肝脏中大量的先天性和获得性免疫细胞及免疫分子形成的动态炎症网络。

HBV感染人体后可以引起体液免疫、细胞免疫和细胞因子介导的免疫反应。由于HBV不会通过大量增殖造成感染细胞裂解，因此免疫系统主要依赖CD8⁺T细胞或自然杀伤细胞破坏感染细胞，释放病毒，再由抗体消灭。同时，细胞因子如干扰素(IFN-α)或肿瘤坏死因子α(TNF-α)可以通过激活APOBECs核酸编辑酶直接抑制HBV复制或引发其降解^[20]。这些炎症-免疫机制有效地清除了体内绝大多数病毒。在慢性感染者体内，每天约一半的HBV病毒被淘汰，但经过环境选择而残余下来的病毒突变体，则逐渐得到毒力增强、耐受抗病毒治疗、促进细胞附着和改变抗原表位逃避机体免疫应答等优势。除选择作用外，免疫机制还可以提高变异率。比如炎症因子可以激活APOBECs核酸编辑酶，引发脱氨基突变，使得大部分病毒因功能缺陷而被清除，但也有可能会产生优势突变或致癌突变。比如HBx是APOBECs偏好的片段，易受核酸编辑酶作用产生Ct-HBx，Ct-HBx是HBV基因整合常见形式，容易发生在人基因组与癌症发生密切相关的区域，导致基因稳定性的降低，从而起到致癌作用^[20]。另外，核酸编辑酶作为炎症因子引起的免疫机制，会产生损伤人体基因组的副作用，直接产生大量体细胞突变，促进宿主的体细胞癌症进化发育进程^[20]。由于当前主要的抗乙肝病毒治疗药物均是围绕增强免疫抗病毒效应或特异性免疫重建而起效，所以其预防HCC的效果就与免疫机制在HBV和肿瘤细胞进化发育中的作用有一定的联系。 1.3 病毒复制是HBV致癌的主要驱动力

目前，无论是流行病学横断面病例-对照研究还是前瞻性队列研究均证实，HBV复制水平是HBV致癌以及HBV相关HCC患者预后不良的主要危险因素之一^{[3, 4, 5]}。但是在HBV自然感染史中，HBV浓度随着感染时间和所致疾病的不同阶段波动很大^[4]。在感染初期，尤其是HBeAg阳性阶段，HBV-DNA浓度较高，容易造成横向传播；在HBeAg抗原转换后，外周血HBV-DNA浓度可下降1~2个数量级。因此，在前瞻性队列研究中，由于收集基线资料的时间点不同，有可能出现HBV-DNA不是HCC危险因素的情况；病例-对照研究也可能出现类似的情况。因此，系统总结多种不同人群研究资料更加可能反映因果关系的原貌。目前大规模流行病学研究证实，HBV的复制水平是HBV致癌最可靠的驱动力之一。抗病毒治疗有望降低这种驱动力对HCC进化发育的促进作用。 2 抗乙肝病毒治疗在阻滞肝癌进化发育方面的作用 2.1 目前抗乙肝病毒治疗的主要方法

目前，经美国食品与药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准并在临床大范围应用的HBV抗病毒药物有两大类：干扰素类，代表药物为IFN-α和聚乙二醇干扰素(Peg-IFN-α)；核苷类似物，包括拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦和替米夫定等。

IFN-α本身是炎症网络中的重要分子，具有免疫调节活性。其主要作用包括：诱导病毒感染细胞表达主要组织相容性抗原；激活并增强抗原提呈细胞功能，诱导巨噬细胞释放溶酶体酶，最终达到增强细胞免疫反应的作用。更重要的是，IFN-α还可以调节CD4⁺/CD8⁺比例以及CD4⁺T细胞亚群比例，使Th1/Th2细胞平衡偏向Th1优势反应。Th1和Th2都是CD4⁺T细胞的亚型，但Th1细胞通过分泌白介素2(IL-2)、IFN-γ和TNF-α等细胞因子参与细胞免疫应答；Th2细胞通过分泌IL-4、IL-5和IL-6等参与体液免疫应答。Th1比例高，感染呈急性自限性，病毒清除较彻底；Th2比例高，HBV感染易慢性化。目前认为，通过诱导IL-12 β2来催化Th0向Th1细胞分化，促进Th1相关细胞因子分泌，恢复Th1/Th2平衡是IFN-α发挥抗病毒能力的主要机制^{[5, 23]}。

核苷类似物可以竞争性地结合HBV-DNA聚合酶，并同时抑制其反转录酶活性，从而抑制病毒复制，降低病毒载量。但是这类药物只在胞质中发挥作用，对于核内的稳定cccDNA没有作用。一旦停药，HBV则以cccDNA为模板迅速复制发生数量反弹，因此必须长期服药。但长期用药后，随着病毒的不断变异进化，有可能出现P区变异型HBV，其DNA聚合酶空间构象发生改变，从而引发耐药^[24]。 2.2 抗乙肝病毒治疗阻滞HBV和宿主体细胞的进化发育

作为目前预防或延迟HBV-HCC发生发展的唯一措施，抗乙肝病毒治疗对恢复肝功能、降低终末期肝病发生和提高有效生存方面的有效性得到了广泛的证实，同时也有证据支持该措施有利于预防复发和改善肝移植预后^{[6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 25]}。从进化发育学的角度来看，抗乙肝病毒治疗阻滞病毒和宿主肿瘤细胞进化的作用主要是：首先，抗乙肝病毒治疗可以降低病毒载量，甚至能在某种程度上清除病毒，从根本上减少HBV变异基数，从而减少HBV的HCC相关突变造成的信号途径的活跃和关键分子的表达，阻滞HBV进化发育进程。其次，通过降低病毒浓度、促进血清转换以达到减轻免疫反应、消除炎症状态以及避免感染慢性化的效果。炎症微环境中，失调的免疫细胞浸润、促炎细胞因子/趋化因子持续活跃、NF-κB和Wnt/β-catenin等信号通路持续激活以及核酸编辑酶异常表达，是产生HBV及宿主体细胞突变的“土壤”，也是从中选择进化优势变异的环境压力来源；去除了炎症-免疫环境就去除了HBV及宿主体细胞进化的动力。同时，IFN-α抗病毒治疗还可以恢复失调的Th1/Th2以及CD4⁺/CD8⁺细胞比例，而根据前期研究，上述免疫细胞亚群的平衡失调、细胞因子分泌异常以及相关分子网络的活动是维持炎症状态，促进HBV相关疾病进展的风险因素之一^[5]。 2.3 目前抗乙肝病毒治疗预防HCC的局限性及其进化发育学分析

在采取抗乙肝病毒治疗措施阻滞癌症的过程中有一个有趣的现象：尽管慢性乙肝患者使用口服核苷类似物进行抗病毒治疗可以使HCC的患病风险显著低于未进行治疗的患者，但HCC的患病风险仍然高于一直处于非活动状态下的慢性乙肝患者^[13]。一方面，这可能与HBV变异的进化有关。核苷类似物对于潜伏于细胞核的稳定cccDNA没有作用，HBV始终能够以此为模板进行复制，从而反复引起炎症免疫反应的再激活；如果P区编码聚合酶催化中心核酸结合区的序列出现变异，引发“酪氨酰(Y)-蛋氨酰(M)-天冬氨酰(D)”模序(YMDD)的结构改变，则会在治疗压力下选择出耐药突变型病毒^[24]。耐药型突变可以引起病情复发，也可能与其他HCC高危突变发生复合变异，比如导致免疫逃逸的S区突变^[20]，进而出现抗原标志物阴性、无明显临床症状但是HBV-DNA仍可检出的情况。另一方面，这可能与HBV整合引起宿主体细胞突变进而诱发肿瘤细胞进化发育的作用有关。HBV整合是HCC发生的重要原因，而且常在肝炎活动早期就已经出现，尤其是Ct-HBx不仅易于整合，而且位点常在癌症进化的驱动基因附近。重要的整合事件发生后，为变异细胞的进化提供了竞争优势，而且由于变异片段已经属于人体基因组范围，其复制不再受抗病毒药物限制，所以可以持续在细胞进化过程中起作用。我们前期的工作发现抗乙肝病毒治疗预防HBV-HCC的作用对发生Ct-HBx整合的患者是无效的，这一现象也佐证了上述假设^[9]。因此，对cccDNA无效、长期使用可促进耐药株进化以及对治疗前发生的整合片段无效应该是口服核苷类似物阻滞HBV-HCC进化发育的局限所在。

IFN-α除了通过调节淋巴细胞亚群、增强细胞免疫反应之外，还可以上调APOBEC3核酸编辑酶，引起HBV-DNA序列突变，结合后续碱基切除修复机制来诱发HBV-DNA降解。尤其可以降解稳定的cccDNA，以获得彻底清除HBV的效果。达到这一效果所需的IFN-α浓度较高，可能引起不良反应而不利于临床应用，淋巴毒素β受体激动剂可以在安全浓度达到同样的效果，是理想的替代剂^[26]。然而APOBECs核酸编辑酶的诱变功能十分强大，而且对于核酸链的识别并没有绝对的外源特异性，因此在诱变HBV基因的同时也可能引起人基因组不稳定。事实上，APOBECs家族引发体细胞突变是多种癌症基因变异的共性机制^[27]，其在炎症-癌症转化中的桥梁作用也在肝癌、胃癌和胆管癌中得到了印证^[20]。同时，APOBEC3倾向于诱变产生Ct-HBx片段，而IFN-α通过上调APOBEC来降解DNA的机制对于整合到人基因组的HBV片段也不易产生效果^[26]。考虑到体细胞突变的隐患可能在未来促进癌症进化发育，应用这一机制实施抗乙肝病毒治疗的安全性还需进一步检测。

HBV-HCC的进化发育过程是一个遗传、病毒、免疫相互作用的复杂而漫长的过程，涉及的炎症因子、信号通路以及核酸编辑酶彼此影响，形成庞大的分子网络。因为HBV及体细胞突变是随机的，可能带来的变异也具有多样性的特点，所以免疫机制的作用就有了一定的矛盾性：一方面清除绝大多数病毒和变异，另一方面为优势变异型病毒和细胞提供了筛选环境。因此，单独依靠一种抗病毒药物，通过单一机制清除病毒并不能保证绝对的预防作用。这也在一定程度上解释了为什么个别临床随机对照试验的荟萃分析结果得出了抗乙肝病毒治疗没有预防HCC作用的结论^[14]。干扰素类药物对病毒清除较为彻底，但不良反应较大；核苷类似物药物可长期服用，但易产生耐药突变型。现在采用两种不同类型的药物进行联合治疗，起到了较好的效果。 3 总结与展望

在我国，HBV慢性感染是引起HCC的主要原因，其致癌过程中呈现HBV与宿主体细胞共进化的现象。炎症-免疫环境在清除HBV的同时，也促进了HBV和体细胞突变的产生，并从中筛选出优势亚型，HBV遵循“变异-适应-进化”的规律而促进HCC发生。实施抗乙肝病毒治疗阻滞这一过程可以有效预防或推迟HCC发生发展。

目前的干扰素类和核苷类似物类抗病毒药物，分别通过免疫调节机制和DNA聚合酶竞争性抑制机制，从增强病毒清除和抑制病毒复制两方面起作用，可以明显降低HCC的发生风险。但受药物自身局限性的影响，抗乙肝病毒治疗在阻滞肝癌进化发育方面仍不完善，可能存在“清除病毒-阻滞进化”和“筛选病毒-促进进化”的矛盾性。当前抗乙肝病毒治疗的效果评估只限于血清学检测和DNA定量，不能检测病毒变异情况，也不利于发现HCC高危突变型病毒以进行早期特异性干预。

更为合理的抗乙肝病毒治疗方案和药物研发是解决这一矛盾、充分发挥抗乙肝病毒治疗HCC预防作用的关键。癌症进化发育学理论为解决这一问题提供了方向，不断出现的核酸治疗新方法也提供了技术支撑。比如基于锁-RNA的反义技术，可以设计与mRNA或miRNA等功能核酸互补的核酸分子，按碱基配对原则形成异常稳定的互补链，从而达到封堵目的基因或功能核酸的目的。这一技术应用于治疗丙型肝炎病毒，被证明不仅有效而且安全^[28]。利用此类技术，结合癌症进化发育学对HBV-HCC进化各阶段、不同潜力的HBV突变型的研究，可以实现特异性地彻底清除高危HBV病毒，更有效地阻滞病毒和癌症进化。 4 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。