2. 广东省食品质量安全重点实验室, 广州 510642
2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety, Guangzhou 510642, Guangdong, China
环境雌激素(EEs)是指一类外源性化合物进入机体后,能够干扰体内正常分泌物质的合成、释放、运转、代谢、结合等过程,激活或抑制内分泌系统功能,从而破坏其维持机体稳定性和调控作用的物质[1]。壬基酚(nonylphenol,NP)是EEs的典型代表,主要源于洗涤剂、纺织、造纸、医药和化妆品等行业中非离子表面活性剂壬基酚聚氧乙烯醚(NPnEO,n表示乙氧基的数目,一般为1~20,亦可高达100)的分解或降解过程,NPnEO进入环境后在生物作用下逐步降解形成短链产物NP2EO和NP1EO及最稳定的产物NP,据估计我国每年约有50万吨的NP进入水体或土壤[2, 3]。环境中的NP可以通过食物、饮用水、乳汁、皮肤等多种途径进入机体[4, 5, 6]。体内外试验证明NP具有雌激素活性,能对机体产生一定的危害,包括诱导细胞凋亡、影响细胞间的信号传递、影响心血管系统和神经系统以及导致内分泌代谢器官产生脂质过氧化损伤等[7, 8, 9, 10]。5-羟色胺(5-HT)又叫血清素(serotonin),是一种杂环胺,分子式为C10H12N2O (相对分子质量为176.2)[11]。5-HT在大脑皮质及神经突触内含量很高,是一种抑制性神经递质;在外周组织,5-HT是一种强血管收缩剂和平滑肌收缩刺激剂[12]。 本课题组前期利用代谢组学方法研究NP的代谢轮廓发现5-HT可能是NP暴露的生物标记物,急性染毒试验研究证实5-HT是NP暴露的潜在尿液生物标记物[13, 14, 15]。5-HT在体内的代谢网络已十分清晰,但关于NP对5-HT的具体毒效应作用机制尚未见报道。本研究通过观察NP对血浆和尿液中5-HT及血小板中5-HT、5-HT2A受体含量的影响来探究NP作用于5-HT和5-HT2A受体的毒效应机制,为NP暴露的人群监测和干预提供试验依据。
1 材料和方法 1.1 实验动物SPF级健康雄性Sprague-Dawley大鼠24只,体质量170~210 g。动物及饲料均购自广东省医学实验动物中心[动物生产许可证号:SCXK(粤)2008-0002]。
1.2 实验试剂及设备试剂:NP(纯度>99.9%)购自美国Sigma公司(CAS:84852-15-3);金龙鱼牌玉米油(食品级)为市售;5-HT(纯度>98%)购自美国Sigma公司(CAS:153-98-0);大鼠5-HT ELISA试剂盒、大鼠5-HT2A受体ELISA试剂盒均购自上海江莱生物科技有限公司;三氯乙酸(TCA)、草酸铵及乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)均购自广州精科化玻仪器公司。
设备:LC-20A(配SPD-20A及RF-20A检测器)高效液相色谱仪购自日本岛津制作所;250 mm×4.6 mm,5 μm(配Security Guard○R保护柱)C18反相色谱柱购自美国Phenomenex○R GeminiTM;5417R冷冻高速离心机购自德国Eppendorf公司;Multiskan Mk3型酶标仪购自美国Thermo Fisher公司;EL204-IC电子天平购自瑞士METTLER TOLEDO公司;DK-600电热恒温水浴箱购自上海精宏实验设备有限公司;XSB-1A3倒置显微镜购自梧州市光学仪器厂;一次性1 mL注射器、进样瓶均购自广州精科化玻仪器公司;0.22 μm 水相/有机滤膜,有机针式滤头均购自广州泛宏贸易有限公司;含乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝剂真空采血管购自于广州阳普医疗有限公司。
1.3 实验动物分组、染毒、观察及收集尿液大鼠放置于动物房代谢笼中适应性饲养1周后,按体质量采用随机区组设计分组法分为4组:阴性对照组(C)和NP低、中、高剂量组,每组6只。低剂量组、中剂量组、高剂量组染毒剂量分别为30、90、270 mg/(kg·d);C组灌喂玉米油。每日上午9:00灌胃,隔日灌胃染毒,连续28 d,期间大鼠自由饮水、摄食,光/暗周期为12 h/12 h,室内温度为(22±0.5)℃,湿度为45%~55%。每次灌胃后至次日上午9:00收集每只大鼠24 h尿液。每日观察大鼠的精神状态、活动情况、被毛润泽度等。
1.4 体内5-HT及5-HT2A受体含量的测定28 d染毒完毕后,各组大鼠眼眶取血,断颈椎处死,处死前大鼠禁食12 h。用加入EDTA-K2抗凝剂的采血管采血,取得的血液于4℃下以3 600×g离心6 min,取上清液待测;下层白色血小板沉淀加入0.5 mL超纯水,轻轻振荡,混匀,取100 μL作血小板计数用,余下部分用漩涡振荡器充分振荡5 min,使血小板充分破裂,于4℃下以3 000×g离心10 min,取上清液待测。血小板计数采用全国临检方法学学术会议首推的草酸铵溶解计数法。血液检测指标包括血浆5-HT、血小板5-HT及血小板5-HT2A,检测方法严格按照各试剂盒的说明书进行操作。
1.5 尿液中5-HT含量的测定尿液样品前处理:取5 mL尿样,在4 ℃下以3 000×g离心5 min,除去大颗粒固体杂质。取0.5 mL上清液,加入0.05 mol/L EDTA-Na2溶液20 μL,漩涡振荡1 min,以螯合金属;再加入0.5 mL TCA溶液,漩涡振荡1 min,以沉淀蛋白;在4 ℃下以12 000×g离心10 min,取上清液用0.22 μm有机针式滤头过滤后待测。采用高效液相法检测尿液5-HT的含量,以色谱峰的保留时间定性,外标法定量。
1.6 统计学处理采用Excel软件录入数据,所有数据以±s表示。采用SPSS18.0软件进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)若有差异则进一步进行组间两两比较,方差齐时采用LSD检验,若方差不齐则采用Tamhane’s检验。检验水准(α)为0.05。
2 结 果 2.1 大鼠一般状况在实验的整个过程中,对照组大鼠未见异常。染毒组大鼠则普遍出现活动减少,皮毛变黄,饮食减少;染毒后期,大鼠萎靡不振,脱毛现象严重。
2.2 体内5-HT及5-HT2A受体含量变化各组大鼠血浆、血小板5-HT及血小板5-HT2A受体含量结果见表 1。随NP暴露剂量的增加,各组大鼠的血浆和血小板5-HT含量逐步增高;各组大鼠血小板5-HT2A受体表达则逐步下降。NP暴露中、高剂量组大鼠血浆5-HT含量与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01;P<0.01); NP暴露中、高剂量组大鼠血小板5-HT含量与对照组相比有差异有统计学意义(P<0.01;P<0.01);NP暴露高剂量组大鼠血小板5-HT2A受体表达与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。
各组大鼠尿液中5-HT的含量结果见表 2。随NP暴露剂量的增加,对应同一时间点的大鼠尿液5-HT含量越高,呈现剂量-毒效应;随染毒时间增加,对应同一染毒剂量组的大鼠尿液5-HT含量也越高,呈现时间-毒效应。第4~28天,NP暴露低、中、高剂量组大鼠的尿液5-HT含量均高于对照组(P<0.01)。
NP作为一种化工合成原料被大量应用于生产表面活性剂、抗氧剂、润滑油添加剂,农药乳化剂等领域,目前在环境中已造成极为广泛的污染[16]。研究表明,NP通过模仿内源性激素的作用,发挥其生物学效应[17, 18, 19]。本研究发现,在大鼠28 d短期重复染毒期间,NP暴露使大鼠在饮食、精神、外观等方面产生了一般毒性效应。
5-HT的代谢网络已很明晰:即色氨酸(Trp)在色氨酸羟化酶(TPH)的作用下生成5-羟色氨酸(5-HTP),5-HTP在芳香族氨基酸脱羧酶(AAAD)的作用下脱去羧基生成5-HT,5-HT经单胺氧化酶(MAO)作用生成5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)[12]。由于血脑屏障的存在,血液中的5-HT很难进入中枢神经系统,因此中枢神经系统和外周的5-HT分属两个独立的系统,但5-HT的生物合成途径在中枢和外周是完全相同的[20]。5-HT2A受体是目前研究最多的一种5-HT受体亚型,在中枢和外周均有分布,主要分布于血小板、脑、血管平滑肌上。已知5-HT2A受体具有收缩血管、促血小板聚集、加快心率和介导神经内分泌的功能,并与血浆5-HT浓度升高导致的高血压、冠状动脉粥样硬化及心血管事件有关,5-HT2A受体的活化还能刺激某些激素分泌,如促肾上腺皮质激素、皮质酮、肾素等[21]。血小板中5-HT的摄取释放机制与中枢神经元相似,Coppen等[22]早在1972年就提出人类血小板5-HT2A受体是脑内5-HT2A受体的有效外周模型。当机体需要5-HT时,血小板中贮存的5-HT需要与5-HT2A等受体结合,才能发挥相应的作用。因此本研究所观察到的大鼠NP暴露后血浆中5-HT、血小板中的5-HT和5-HT2A受体含量的变化也能够反映出脑内5-HT和5-HT2A受体可能的改变,从而了解外周和中枢5-HT、5-HT2A受体是如何受到NP毒效应的影响。
研究发现,去卵巢后大鼠下丘脑5-HT2A受体mRNA表达升高,补充雌激素后表达降低,这表明雌激素可直接影响5-HT2A受体mRNA的表达,雌激素对5-HT2A受体mRNA的表达总趋势是负调控作用[23]。对卵巢切除的大鼠短期使用雌激素可以提高中缝核、纹状体、杏仁核内5-HT及其代谢物5-HIAA的浓度,表明这些脑区内5-HT含量增多[24, 25]。对卵巢切除的恒河猴使用雌激素,同样可以提高5-HT浓度及其堆积速率。这种刺激5-HT合成的作用,一方面是通过诱导TPH的基因表达来实现的[26],另一方面,雌激素也可以降低丘脑和杏仁核内MAO的活性,通过减少降解来增加突触间隙内单胺类物质浓度,如去甲肾上腺素、多巴胺、5-HT[27]。雌激素可增强单胺类递质活性和突触后5-HT能效应,增加5-HT能受体数量和神经递质的转运和吸收[28]。
本研究发现随NP暴露剂量的增加,各组大鼠的血小板5-HT2A表达逐步下降。推测其机制可能是NP化学结构与17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)相似,可竞争性抑制E2与靶器官的雌激素受体(estrogen receptor,ER)结合,形成配体-受体复合物与DNA结合区的DNA反应元件结合,诱导或抑制靶基因的转录,启动一系列雌激素依赖性生理生化过程[16]。由于NP可能模拟E2在机体内发生作用,因此随着染毒组NP暴露剂量的增加,雌激素作用增强,引起5-HT2A受体mRNA的表达减少,导致5-HT2A受体含量下降。5-HT只有与5-HT受体结合才会起作用,因而本研究中所发现的随着NP暴露剂量增加,血浆和血小板中5-HT含量升高的原因可能是由于5-HT2A受体含量下降,5-HT结合减少,反应不能继续进行,导致了5-HT的积累。另外,随着NP暴露剂量的增加拟雌激素作用也抑制了MAO的降解和神经元内5-HT的转运,增加了5-HT的积累效应[29, 30],进一步导致5-HT含量的上升,过量的5-HT最终也使其在尿液中的排出增加。
本研究结果表明,NP抑制机体内5-HT2A受体表达、引起5-HT与5-HT2A受体结合障碍,是导致血浆5-HT含量上升、尿液5-HT排出增加的一个重要原因,但尿液5-HT排出增加是否与NP暴露导致的肾脏毒效应有关,尚需作更深入的研究。
4 利益冲突所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。
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