帕金森病(Parkinson disease，PD)是一种常见于中老年的神经变性疾病，临床上以静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势步态障碍为主要特征，常伴胃排空延迟、便秘等胃功能障碍^[1]。PD胃功能障碍的发生机制尚不清楚，可能与胃肠神经系统(enteric nervous system，ENS)内神经递质的变化密切相关^[2-4]。酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是儿茶酚胺类活性物质生物合成的限速酶，这种酶染色阳性的神经元可能产生多巴胺，TH的变化可能与PD的发生发展密切相关^[5]。一氧化氮(nitric oxide，NO)是ENS 主要抑制性神经递质之一，在体内由神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)催化所产生，介导平滑肌的松弛效应，在胃肠道蠕动反射中介导下行性抑制作用^[6]。司来吉兰(咪多吡，selegiline)是一种常用的单胺氧化酶B抑制剂，能保护黑质细胞免于各种神经毒素的侵害而阻止PD进展，具有神经保护作用^[7]，但其对PD模型大鼠胃功能障碍有何影响尚不明确。本研究通过观察司来吉兰对PD 模型大鼠胃窦TH和nNOS表达的影响，探讨司来吉兰对PD患者胃功能障碍的治疗机制。
1 材料和方法 1.1 主要试剂与仪器

司来吉兰(批号H20040400；产地Orion Corporation Espoo，Finland)，片剂，规格5 mg/片；鱼藤酮(批号201212)购自北京博奥森生物工程有限公司；市售葵花油；SP-0023免疫组化试剂盒(批号201302)、兔抗大鼠TH抗体和兔抗大鼠nNOS抗体均购自北京博奥森生物工程有限公司；DAB显色液购自北京中杉金桥生物技术有限公司；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳低分子量标准蛋白购自华美生物工程有限公司；奥林巴斯BX63全自动显微镜扫描系统由日本奥林巴斯公司提供。高速台式离心机购自上海安亭科学仪器厂。 1.2 实验动物与分组

健康雄性SD大鼠72只，体质量250～300g，由北京华阜康生物科技股份有限公司供给，合格证号：SCXK(京)2013-0013。在河北联合大学屏障环境动物实验室饲养，室温控制在(23±2)℃，自然光照，自由进食。适应饲养2周后，将大鼠随机分为正常对照组、PD模型组和司来吉兰治疗组，并根据预实验结果将各组随机分为模型制备成功后4 d、8 d 两亚组。每组各12只大鼠。 1.3 PD模型制备

采用颈背部皮下注射鱼藤酮制备PD模型^[8]。鱼藤酮以葵花油溶解配制成2 mg/mL鱼藤酮葵花油乳液，充分震荡混匀后避光保存。模型组和司来吉兰组大鼠每日经颈背部皮下注射鱼藤酮葵花油乳液(鱼藤酮剂量为2 mg/kg)，对照组每日颈背部皮下注射等量葵花油，待模型制备成功后停止注射。以出现行为学改变作为判定模型成功的指标^[9]，选择得分2～6分者作为实验大鼠。 1.4 治疗方法

模型制备成功后，对照组和模型组每日灌胃给生理盐水，治疗组每日灌胃给司来吉兰0.5 mg/kg，根据亚组分组情况分别连续给药4 d 或8 d。 1.5 胃固体食物残留率测定

参照朱红灿等^[6]报道的方法，各组分别取6只大鼠，禁食不禁水12 h后自由进食1 h移去食物，进食前后分别称量食物以计算食物的消耗量。2h后腹腔注射10％水合氯醛麻醉处死大鼠，取胃用滤纸拭干后称量，沿胃大弯剪开胃体，洗去胃内容物后拭干称量净质量，测定胃固体食物残留率：胃固体食物残留率(% )=(胃全质量－胃净质量) /食物消耗量×100%。 1.6 免疫组化法检测TH和nNOS表达

按试剂盒说明书操作要求检测各组TH和nNOS蛋白表达。各组分别取6只大鼠，用10％水合氯醛(3 mL/kg)腹腔麻醉动物，麻醉后经4%多聚甲醛灌流固定，剖腹后取大鼠胃窦1.5～2.0 cm，清洗干净胃内容物，剪去胃窦周围的脂肪和结缔组织，用4%多聚甲醛固定24 h。常规包埋、切片、脱蜡、水化、抗原修复；0.3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶20 min；1％山羊血清封闭 20 min，分别加入一抗(兔抗鼠 nNOS多抗；兔抗鼠 TH 单抗)，4℃孵育过夜；加生物素化二抗，37℃孵育 30 min；再加辣根酶标记的链酶卵白素，37℃孵育 30 min。以上各步骤均用PBS 缓冲液浸洗 5 min×3 次。后加 DAB 显色，光镜下观察。以胞质呈棕黄色，胞核呈浅蓝色或紫蓝色为阳性细胞。高倍镜下随机观察各组大鼠胃窦不重叠的6个视野，进行TH和nNOS阳性细胞计数。 1.7 蛋白质印迹法检测TH和nNOS 蛋白表达

取胃固体食物残留率测定后胃窦1.5～2.0 cm，清洗干净胃内容物，剪去胃窦周围的脂肪和结缔组织，即刻投入液氮，后放入EP管中－80℃保存。冷冻胃窦按40 mg/kg加入蛋白裂解液，电动匀浆器匀浆，冰浴中静置30 min，12 000 r/min(r=3 cm)，4℃，离心10 min。取上清液－20℃保存。经蛋白定量后分装，用4℃预冷PBS调蛋白浓度到一致(5.3 μg/μL)，加入5×的上样缓冲液，使终浓度为1×，在沸水中至少煮5 min，冷却至室温，置于4℃备用。取各组制备好的胃窦组织15 μL (蛋白质量80 μg)，10%、15% SDS-PAGE电泳分离后，以湿转法电转移至聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜上。将PVDF膜放入封闭液中封闭1 h，加入稀释好的一抗(兔抗鼠 nNOS多抗；兔抗鼠TH 单抗)，浓度为1∶1 000，4℃孵育过夜，PBS洗膜，加入相应稀释好的二抗(羊抗兔1∶2 000)，37℃反应1 h，洗膜，以ECL显色，胶片曝光显影，结果用Image J分析。 1.8 统计学处理 所得数据以Excel建库，用SPSS19.0软件包进行统计分析。计量资料以 ±s 表示。数据做正态性W检验和方差齐性Levene检验，采用随机区组设计的方差分析比较组间差异。检验水准(α)为0.05。
2 结 果

动物模型大鼠经颈背部皮下注射鱼藤酮7周左右，出现PD行为学改变，其中4只由于病情过重给予淘汰，另有2只死亡，均给予相应补充。模型组大鼠各时间点胃内固体食物残留率均高于对照组(均P<0.01)，治疗组大鼠各时间点胃内固体食物残留率均低于模型组(P<0.05或P<0.01)，且治疗后8 d亚组大鼠胃内固体食物残留率低于治疗4d亚组(P<0.05)。具体数据见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 各组大鼠胃固体食物残留率 Tab 1 Residual rate of solid food in the gastric antrum of rats in each group x±s,n=6,% Group 4 d 8 d Control 40.495±1.618 40.296±1.496 PD 69.925±1.634** 68.367±2.105** Selegiline 60.259±1.261△ 50.310±1.417△△▲ PD：Parkinson disease. **P<0. 01 vs control group; △P<0.05,△△P<0.01 vs PD group; ▲P<0.05 vs selegiline 4 d group

表 1各组大鼠胃固体食物残留率 Tab 1 Residual rate of solid food in the gastric antrum of rats in each group

免疫组化结果显示，对照组大鼠各时间点胃窦可见多量TH阳性细胞表达和少量nNOS阳性细胞表达。与对照组比较，模型组各时间点胃窦TH阳性细胞表达均减少，nNOS阳性细胞表达均增加，差异有统计学意义(均P<0.01)。与模型组比较，治疗组各时间点胃窦TH阳性细胞表达均增加，nNOS阳性细胞表达均减少，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与治疗组术后4 d亚组比较，术后8 d 亚组大鼠各时间点胃窦TH阳性细胞数升高(P<0.05)，nNOS阳性细胞数降低(P<0.05)。 具体见表 2和图 1。

表 2(Table 2)

表 2各组大鼠胃窦TH、nNOS阳性细胞数的比较 Tab 2 Numbers of TH and nNOS positive cells in the gastric antrum of rats in each group x±s,n=6,A/HP Group TH nNOS 4 d 8 d 4 d 8 d Control 26.00±2.00 24.83±2.32 7.50±1.87 6.06±1.41 PD 7.83±2.64** 7.12±2.88** 21.13±2.61** 19.52±1.87** Selegiline 13.00±1.41△ 20.26±2.31△△▲ 14.67±2.16△ 10.33±2.11△△▲ TH: Tyrosine hydroxylase; nNOS: Neuronal nitric oxide synthase; PD：Parkinson disease. **P<0. 01 vs control group; △P<0.05,△△P<0.01 vs PD group; ▲P<0.05 vs selegiline 4 d group

表 2 各组大鼠胃窦TH、nNOS阳性细胞数的比较 Tab 2 Numbers of TH and nNOS positive cells in the gastric antrum of rats in each group

图 1

Fig. 1

图1 各组大鼠胃窦TH和nNOS免疫组化结果 Fig.1 Effects of hypothermia infusion on liver histology A-F:TH;G-L:nNOS. A,G: Control group 4 d; B,H: Model group 4 d; C,I: Treatment group 4 d; D,J: Control group 8 d; E,K:Model group 8 d; F,L: Treatment group 8 d. Original magnification:×400

蛋白质印迹检测结果显示，对照组大鼠各时间点胃窦TH表达量较多，nNOS表达量较少。与对照组比较，模型组各时间点胃窦TH表达量减少，nNOS表达量增加，差异有统计学意义(均P<0.01)。与模型组比较，治疗组各时间点胃窦TH表达量增加，nNOS表达量减少，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与治疗组术后4 d时比较，治疗后8 d 时大鼠各时间点胃窦TH表达量增加，nNOS表达量降低(均P<0.05)。具体见表 3和图 2。

表 3(Table 3)

表 3 各组大鼠胃窦TH和nNOS 蛋白质印迹检测结果 Tab 3 Western blotting results of TH and nNOS protein expression in the gastric antrum of rats in each group x±s,n=6 GGroup TH nNOS 4 d 8 d 4 d 8 d Control 3.32±0.13 3.39±0.03 0.17±0.02 0.15±0.03 PD 1.52±0.09** 1.58±0.14** 0.52±0.09** 0.56±0.08** Selegiline 2.11±0.18△ 2.94±0.42△△▲ 0.40±0.01△ 0.18±0.06△△▲ TH: Tyrosine hydroxylase; nNOS: Neuronal nitric oxide synthase; PD：Parkinson disease. **P<0. 01 vs control group; △P<0.05,△△P<0.01 vs PD group; ▲P<0.05 vs selegiline 4 d group

表 3 各组大鼠胃窦TH和nNOS 蛋白质印迹检测结果 Tab 3 Numbers of TH and nNOS positive cells in the gastric antrum of rats in each group

图 2

Fig. 2

图2 各组大鼠胃窦TH(A)和nNOS(B)蛋白质印迹检查结果 Fig.2 Western blotting results of TH (A) and nNOS (B) protein expression in the gastric antrum of rats in each group TH: Tyrosine hydroxylase; nNOS: Neuronal nitric oxide synthase; PD: Parkinson disease

PD患者常伴胃功能障碍等非运动症状，胃排空延迟是PD患者常见的上消化道功能紊乱症状^[10]。本研究结果表明PD模型组大鼠进餐2 h后胃内固体食物残留率大于对照组，说明PD模型组大鼠胃排空速度明显减慢，PD可引起胃功能障碍，这与Greene等^[11]报道的结果一致。

PD的主要病理改变是黑质多巴胺能神经元的变性丢失，PD 除了中枢神经变性外，胃肠神经亦发生变性，但其具体作用机制目前尚不清楚，有学者发现PD患者胃窦肌层内多巴胺能神经元的数量较对照组明显减少^[12]，提示PD胃功能障碍可能与胃窦神经系统内神经递质的变化密切相关^[2-4]。TH是儿茶酚胺类活性物质生物合成的限速酶，在多巴胺生物合成的调节中发挥重要作用^[13]。NO是一种具有很强氧化还原特性的自由基性质的气体，在中枢神经系统中发挥着重要作用。NO的半衰期非常短并难以控制，而一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)则相对稳定，且NOS广泛分布于神经元中，其在神经系统损伤中的表达变化已成为研究热点。 目前NOS包括3种不同的亚型，分别为神经元型(nNOS) 、内皮型(eNOS) 及诱导型(iNOS) 。有报道^[14]PD大鼠出现的胃肠功能障碍可能与胃肠神经系统nNOS水平降低有关。本研究中免疫组化法和蛋白质印迹检测结果均显示，模型组大鼠胃窦TH表达比对照组明显降低，胃窦nNOS表达比对照组明显升高，表明PD大鼠胃窦TH减少及nNOS增多在PD的胃功能障碍发病过程中起着重要作用。
司来吉兰是一种常用的单胺氧化酶B抑制剂，它能够选择性不可逆地抑制多巴胺降解为高香草酸，从而增加多巴胺的蓄积，同时也能减少突触前膜对多巴胺的再摄取，促进多巴胺的释放。这些都延长了外源性及内源性多巴胺的作用时间而使PD患者的临床症状得到改善，在临床应用中表现为较好的治疗效果和耐受性^[15-16]。另外，研究证实司来吉兰还能够抵抗氧自由基的氧化作用，上调超氧化物歧化酶和过氧化氢酶水平，减少细胞凋亡^[17]；产生神经营养因子，保护黑质细胞免于各种神经毒素的侵害^[18-19]，阻止PD进展。本研究显示，经司来吉兰治疗后，PD模型大鼠胃固体食物残留减少，同时，大鼠胃窦TH表达明显增加，胃窦nNOS表达明显减少，表明司来吉兰能改善PD患者的胃肠功能障碍，其作用机制可能与其减轻PD模型大鼠胃窦多巴胺能神经元的损伤和抑制nNOS表达有关，且随着时间的延长，作用更明显。这为PD患者胃功能障碍的防治提供了一定的理论依据。
4 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。