肝豆状核变性(Wilson’s disease，WD)是常染色体隐性遗传的铜代谢障碍疾病，患病率为1/50 000～1/30 000^[1,2,3]，好发于儿童、青少年。WD患者由于ATP7B基因发生功能丧失性突变，使铜沉积于肝、脑等处,导致多脏器损害，临床表现多样,以肝、神经系统的损害为主，有不同程度的锥体外系病变、精神障碍、角膜 K-F 环等。1993 年 Bull等克隆了ATP7B 基因，该基因定位于13q14.3，基因全长为78 821 bp，mRNA 长8.5 kb，含21个外显子和20个内含子；编码的ATP7B蛋白含1 465个氨基酸残基，相对分子质量159 000，为 P 型铜离子转运ATP 酶^[4,5,6,7]。ATP7B突变可导致细胞内铜离子转运、排出功能丧失，迄今已发现 651 种突变，突变形式有错义/无义突变 (占63% )、小片段缺失(占17%)、小片段插入(占8%)、剪接突变(占9%)、大片段缺失(占2%)、同义突变(占2%)^[3]等；以往国内鲜有报道复合突变(指有2个或2个以上突变点)。本研究对WD患者ATP7B基因全部外显子5′ 端 → 3′ 端进行测序，发现了一些ATP7B基因错义、插入突变及复合突变，现报告如下。 1 资料和方法 1.1 研究对象

67例中国汉族WD患者均为2009年5月至2013年1月在安徽中医药大学第一附属医院接受治疗的患者，诊断标准参照中华医学会WD诊断指南^[8]及美国Roberts 和 Michael 编写的AASLD的WD诊断及治疗指南^[9]；其中男46例，女21例，年龄6~56岁，平均(21.7±2.6)岁。其中 34例为先证者患者，其余的 33例患者来自于 12 个患者家庭。选取安徽中医药大学第一附属医院中国汉族健康输血员20例，设为正常对照组，其中男14例，女6例，年龄21~32 岁，平均(27.7±2.8岁)。本研究经医院伦理委员会批准，所采集样本对象均有临床数据调查表并签署知情同意书。 1.2 基因组 DNA 抽提

取67例WD患者和20例正常人口腔黏膜细胞，制备细胞悬液，4℃保存。在1.5 mL离心管中，加入200 μL口腔黏膜细胞悬液，再加裂解缓冲液STE 410 μL，10％SDS 90 μL，蛋白酶K液(100 μg/mL)5 μL，65℃消化15 h。加入300 μL饱和NaCl液轻摇3 min。加氯仿340 μL，混匀后高速离心，将上清液吸入另一离心管中，加异丙醇650 μL混匀后高速离心。弃上清液,加500 μL 75％乙醇，高速离心2次，弃上清得DNA 沉淀，室温干燥1.5 min，加30 μL蒸馏水溶解，4℃保存。取3 μL基因组DNA溶液经1.5%琼脂糖凝胶电泳检查质量，为一条带，达电泳纯；基因组DNA溶液经紫外分光光度计检测，D₂₆₀/D₂₈₀为1.8，纯度合格；基因组DNA溶液浓度为1 μg/μL。 1.3 PCR引物的设计

PCR引物设计参考美国国立生物技术信息中心(NCBI)的ATP7B基因序列信息，用 Premier 5 软件设计21对外显子+5′ 端和+3′端的PCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物信息见表 1。

表 1(Tab 1)

表 1 ATP7B 基因外显子 PCR 扩增引物及序列 Tab 1 Primers for PCR amplification of ATP7B gene exons Primer Sequence (5′-3′) ATP7B-EXON1-F CCCACTCTCCCCTCACGC ATP7B-EXON1-R GGTGCGGGGTTTTCCATT ATP7B-EXON2-F GCTTGCTTTCTGTGTATGTTATGTTC ATP7B-EXON2-R AGGGCTCACCTATACCACCATC ATP7B-EXON3-F CATCTGTGCAGGAAGTGGCTC ATP7B-EXON3-R CCTAACTGAGAAGTCTATCCACAAAAG ATP7B-EXON4-F ACCTACCCTGGGATACTCTGATTT ATP7B-EXON4-R CAGGGCAGTCCACCGTCTT ATP7B-EXON5-F GCTGCCTGTTACCTAGACTCCC ATP7B-EXON5-R AATGTCTTTTCCTCATCTTTCTCTTAC ATP7B-EXON6-F ACAGGGTTTGTAGGGCTATTGG ATP7B-EXON6-R CACTGTTTCAGAGGGTTCACATTAC ATP7B-EXON7-F ATTTTAACCCCTGGTGGTCTGT ATP7B-EXON7-R GCCCTTAGTAGTCCCCCACA ATP7B-EXON8-F TTCATAAACGCCCATCACAGAG ATP7B-EXON8-R GGTGTTCAGAGGAAGTGAGATTTG ATP7B-EXON9-F CACGCTTGTGACTCTCAGGCT ATP7B-EXON9-R TTCTGCCCACACTCACAAGGT ATP7B-EXON10-F CAGCTGGCCTAGAACCTGACC ATP7B-EXON10-R AGATTGGGATAATCTCCTTCATTT ATP7B-EXON(11-12)-F CCAGGTGAGATGGCTTGTTTC ATP7B-EXON(11-12)-R GCCCAGTGAATCTAAGATATGAAAG ATP7B-EXON13-F CTCTGCTCCTGTAATGCCTCTTT ATP7B-EXON13-R GGTGGCTACTCTGTTGCTACTGTT ATP7B-EXON14-F GGGAGTTGTTGAACCCTGAGAT ATP7B-EXON14-R GCAAATGCCTGTGACACTGAAC ATP7B-EXON15-F CTTTCTCTCAGTTCCCGCTTTC ATP7B-EXON15-R GCAATCACTGCTGGGCGT ATP7B-EXON16-F GTCACAAGAGGTGCTTACAAGGTTA ATP7B-EXON16-R TGACTCTGAACTGCCCACCTG ATP7B-EXON17-F CGAAAATGAAATCACTCGTAATCC ATP7B-EXON17-R TCACGTGCAACACTACATGGC ATP7B-EXON(18-19)-F CGTAACTTGAGGTTTCTGCTGCT ATP7B-EXON(18-19)-R CAGCCAAGCATCTCCACTAGC ATP7B-EXON20-F GGGGCTTCTGAGCACGC ATP7B-EXON20-R CAGCCCTTGAGGAGCAGAGTA ATP7B-EXON21-F CAAAAGTTAGTGGCAGCCTACAAT ATP7B-EXON21-R AGCCTCACAGAAGCCCTCG

表 1 ATP7B 基因外显子 PCR 扩增引物及序列 Tab 1 Primers for PCR amplification of ATP7B gene exons

PCR反应总体积 10 μL，含Taq 酶1 U，2 μmol/L 上、 下游引物各 1 μL，基因组DNA液1 μL，10 × buffer 1 μL，50 mmol/L MgCl₂ 0.3 μL，10 mmol/L dNTPs 0.2 μL，水补齐至10 μL。外显子短片段扩增条件： 95℃预变性5 min，PCR扩增 40个循环 (95℃ 15 s、60℃ 20 s、72℃ 30 s)，72℃下延伸15 min，4℃保存。外显子(2、11、12、18、19、21)长片段扩增条件：95℃预变性5 min，PCR扩增 40个循环 (95℃ 15 s、60℃ 20 s、72℃ 2 min)，72℃下延伸15 min，4℃ 保存。 1.5 PCR产物测序

PCR反应产物经Qiaquick Spin柱纯化后，由广州华大生物科技有限公司检验中心使用ABI3730型测序仪进行荧光全自动DNA正向测序及反向测序，用SeqMan、BioEdit分析软件分析ATP7B 基因全部外显子5′端 →3′端的突变，对初步发现的突变中有疑问者，均经PCR克隆测序后再确认；分析测序图时，注意使用核苷酸荧光扫描峰较高且噪声线几乎贴近底线的图分析，以免噪声干扰；且测序引物一般距离要分析的外显子若干bp。 1.6 突变分析

扩增67例WD患者和20例正常人ATP7B基因的所有外显子5′ 端 → 3′端，并将其DNA的测序结果与由GenBank中获得的正常人ATP7B基因相应序列进行比对，分析突变情况。 2 结 果

本次研究通过对 67 例WD患者的 ATP7B 基因的全部外显子5′端 → 3′端进行直接扩增测序，发现16例纯合子突变(12例Arg778Leu纯合子突变和4例Arg919Gly纯合子突变),5例复合突变,31例单纯杂合子突变,15例未检出突变，突变总检出率为77.61%(52/67)。5种国内罕见的ATP7B基因复合突变的具体信息见表 2，相应的测序图见图 1。通过PubMed数据库中文献检索,以及在肝豆状核变性突变网站 (http://www.wilsondisease.med.ualberta.Ca/database.asp)和人类突变数据库(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/validate.phP)进行查询,发现这5种ATP7B基因复合突变在中国汉族人群中罕见报道。正常对照组中未发现ATP7B 基因突变。

表 2(Tab 2)

表 2 肝豆状核变性患者ATP7B基因的新复合突变 Tab 2 New complex mutations of ATP7B gene in Wilson’disease patients Patient Nucleotide mutation Exon AA change Sequence Rate 7 1216T→G 2 [Ser]→[Ala] ATCCC[G/T]CTGTA 2/67 2419T→C 16 [Val]→[Ala] TGCAG[C/T]CCCCC 1/67 1172G→A 21 3′UTR mutation CATCT[A/G]TTTAC 1/67 15 3132G→A 13 [Pro]→[Leu] CCGTG[A/G]GCGTG 1/67 4058insG 20 [Cys]→[Ser] GGGCT[C/G]CAGCG 1/67 26 -127insGCCGC 1 5′UTR mutation GCCGA [GCGGC/-] GCCGC 1/67 -75C→A 1 5′UTR mutation ACACC[A/C]CGCTC 2/67 2785G→A 12 [Val]→[Ile] TTATC[G/A]TCATC 1/67 43 2855G→A 12 [Arg]→[Lys] TCAGA[A/G]ATACT 1/67 3419T→C 16 [Val]→[Ala] TGCAG[C/T]CCCCC 1/67 51 -127insGCGGC 1 5′UTR mutation GCCGA[-/GCGGC]GCCGC 1/67 -75C→A 1 5′UTR mutation ACACC[A/C]CGCTC 2/67 1216T→G 2 [Ser]→[Ala] ATCCC[G/T]CTGTA 2/67 1366G→C 3 [Val]→[Leu] CATCT[G/C]TGCAG 1/67 1524G→C 3 [Arg]→[Ser] GAAAG[C/G]AATCT 1/67 2495A→G 10 [Lys]→[Arg] CGTCA[A/G]GGTGG 1/67

表 2 肝豆状核变性患者ATP7B基因的新复合突变 Tab 2 New complex mutations of ATP7B gene in Wilson’disease patients

图 1

Fig 1

图 1 5种ATP7B 基因复合突变测序图 Fig 1 Sequences of 5 complex mutations of ATP7B gene A: Patient 7,exon 2,16,and 21 mutation; B: Patient 15,exon 13,20 mutation; C:Patient 26,exon 1,1,and 12 mutation; D:Patient 43,exon 12,16 mutation; E: Patient 51,exon 1,1,2,3,3,and 10 mutation

铜是维持人正常生理活动必需的微量元素，参与机体氧化还原反应、细胞呼吸、活性氧防御、细胞代谢、生存或凋亡等，常参与形成铜蛋白、铜酶。肠道吸收的Cu²⁺进入肝门静脉，在血中90%与铜蓝蛋白结合，其余的与白蛋白、组氨酸等结合成三元复合体。细胞摄取 Cu²⁺ 时主要通过铜蓝蛋白、白蛋白及 组氨酸释放 Cu²⁺，经细胞表面的还原酶还原为Cu⁺，通过转运载体摄入细胞，再由还原型谷胱甘肽运输到不同细胞器，细胞内的Cu⁺ 能通过铜转运蛋白转运给铜蛋白，合成超氧化物歧化酶(SOD)、金属硫蛋白(MT)等；多余的 Cu⁺主要由ATP7B排出细胞。

一般肝细胞内的ATP7B主要定位于核周高尔基体外侧网络，当细胞质Cu⁺ 水平升高后，ATP7B移至细胞质，Cu⁺ 能结合、活化ATP7B，促进后者ATP 结合区结合 ATP、释放能量，使天冬氨酸激酶磷酸化区(P 区)磷酸化^[10,11]，再将Cu⁺ 转运至细胞膜，或者形成铜蓝蛋白排入血，或者把Cu⁺ 排入毛细胆管经肠道排出，从而避免过多Cu⁺ 积聚于细胞内。细胞质Cu⁺ 水平过高时，肝细胞也能经溶酶体小泡排出Cu^{+ [10]}。

ATP7B分子有7个功能区，有的可发生突变：(1) N端区，有6个Cu⁺ 结合区(与1~6外显子相关)，第1~4 Cu⁺ 结合区突变时，如已报道的 G85A、G591D等突变，患者可出现症状；(2) TGES 磷酸酶区(与11外显子相关)，能使磷酸化的ATP7B第1 027位天冬酰胺去磷酸化，其突变后能使ATP7B过度磷酸化，丧失催化活性，停留在细胞膜，不能转运Cu⁺，如 G591D；(3) CPC 阳离子跨膜转运区(与7~10/12~13外显子相关)突变，会导致ATP7B一直停留在核周高尔基体、内质网，不能排出Cu⁺，如Arg778Leu、Gly937Ser等突变；(4) DKTGT天冬氨酸激酶磷酸化区(P区，与14~16外显子相关),ATP7B活化时，DKTGT基序中的D1027(天冬酰胺)磷酸化，使ATP7B能转移位置，如果该天冬酰胺突变，则阻断ATP7B形成ATP7B-酰基磷酸盐，使 ATP不能供应能量，ATP7B不能转移位置，也不能转运Cu⁺；(5) GDGV ATP结合区(N 区，与17~18 外显子相关)，该区H1069等突变，ATP7B不能结合ATP，因而不能被 γ-磷酸化，不能形成ATP7B-酰基磷酸盐，不能转运Cu⁺，该区目前已发现至少40多种突变；(6) C端磷酸化作用区(DVP，与19~20 外显子相关)；(7) C末端区(ACTGT区，与21外显子相关)，参与调节ATP7B功能^[10,11]。

本研究发现WD患者ATP7B基因复合突变的形式有一定异质性，7号患者有exon 2、16、21复合突变，第2外显子突变出现在第2 Cu⁺ 结合区，使ATP7B不能结合Cu⁺、排出Cu⁺ 减少；第16外显子突变出现在天冬氨酸激酶磷酸化区，使该区不能磷酸化，不能到细胞质结合Cu⁺，不能排Cu⁺；第21外显子突变在C 末端区，使ATP7B功能不正常，不能排Cu⁺，导致Cu⁺ 转运停滞，引起疾病发生。15号患者有exon 13、20复合突变，第13外显子突变出现在CPC 阳离子膜转运区，使ATP7B一直停留在核周高尔基体外侧网络、内质网，不能到细胞膜排出Cu⁺，第20外显子突变出现在磷酸化作用区，使ATP7B不能完全磷酸化，不能到细胞质结合Cu⁺，不能排出Cu⁺。26号患者有 exon 1、12复合突变，第1外显子突变出现在第1 Cu⁺ 结合区，使ATP7B不能结合Cu⁺、不能活化，ATP7B由高尔基体转移到细胞质的速度减慢，排出Cu⁺ 减少；第12外显子突变出现在CPC 阳离子膜转运区，使ATP7B一直停留在核周高尔基体外周网络、内质网，不能到细胞膜排出Cu⁺。43号患者有exon 12、16复合突变，第12外显子突变，不能排出Cu⁺；第16外显子突变出现在DKTGT 天冬氨酸激酶磷酸化区，阻断ATP7B形成ATP7B-酰基磷酸盐，ATP不能供应能量，ATP7B不能移位转运Cu⁺。51号患者有exon 1、2、3、10复合突变，第1、2、3外显子突变出现在第1、2、3 Cu⁺ 结合区1~3，使ATP7B不能结合Cu⁺、不能活化，排出Cu⁺ 减少；第10外显子突变出现在CPC 铜离子跨膜转运区，使ATP7B一直停留在核周高尔基体外周网络、内质网，不能到细胞膜排出Cu^+[12,13]。

本研究检测的67例WD患者中，ATP7B基因突变率为77.61%,还发现了5种国内罕见的复合突变，显示ATP7B基因突变有较大的异质性。对WD患者ATP7B基因的复合突变，目前还有待进一步深入研究。Maier-Dobersberger等^[14] 对ATP7B基因突变位点研究后认为，复合突变比单一突变者发病常更早。WD为一种常染色体隐性遗传性疾病，因此只有2个突变为直接导致疾病发生的，其余的一般均可视为单核苷酸多态性(SNPs)。SNPs可能在WD发生发展中起着一定的作用。从1995年到目前对WD中ATP7B基因突变的研究中，欧美患者的单突变类型主要是HIS1069Gln(28%)、Gly1266Lys(10%)，其他突变各见于3%以下患者。许多国外资料显示,肝豆状核变性基因14号外显子第1 069位密码子突变是一个典型的热点突变,染色体突变频率高达28%~68.3%^[15]。国内学者对中国WD患者基因突变研究后发现8号外显子Arg778Leu突变频率为11.4 %～60%^[16],此突变公认为中国WD患者ATP7B基因第一突变热点,陆续报道的突变分布在外显子5、7、8、11、12,13、14、18，而对第二突变热点目前存在一定的争议性^[17]。2013年复旦大学附属儿科医院报道，53例WD患者ATP7B基因突变频率91.5%，纯合子突变8例，复合杂合突变36例，杂合突变9例；复合杂合突变即有2个或2个以上突变点，因此在ATP7B全基因检测时，要仔细找出全部突变点^[18]。复合突变一般分别来自父亲、母亲，2013年Coffey等^[19] 也有同样报道，发现复合突变，提示可引发ATP7B多处功能损伤并与患者症状较重可能相关，值得重视，我们也将进一步研究。

4 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。