第二军医大学  2014, Vol. 35 Issue (11): 1177-1182   PDF    
引用本文
马宜冬, 王真, 巩睿智, 李林芳, 吴红平, 金华君, 钱其军. 靶向黏蛋白1嵌合抗原受体修饰的Jurkat T细胞特异杀伤肝癌细胞. 第二军医大学学报, 2014，35(11): 1177-1182  
MA Yi-dong, WANG Zhen, GONG Rui-zhi, LI Lin-fang, WU Hong-ping, JIN Hua-jun, QIAN Qi-jun. Specific cytotoxicity of MUC1 chimeric antigen receptor-engineered Jurkat T cells against hepatocellular carcinoma. Academic Journal of Second Military Medical Universitya, 2014,35(11): 1177-1182 (in Chinese with English abstract)  
靶向黏蛋白1嵌合抗原受体修饰的Jurkat T细胞特异杀伤肝癌细胞
马宜冬1, 王真2, 巩睿智2, 李林芳3, 吴红平3, 金华君3 , 钱其军3     
1. 苏州大学医学部基础医学与生物科学学院细胞生物学系, 苏州 215123;
2. 第二军医大学东方肝胆外科医院生物治疗科, 上海 200438;
3. 第二军医大学东方肝胆外科医院基因-病毒治疗实验室, 上海 200438
2014-4-12 收稿, 2014-8-6 改回.
基金项目：艾滋病和病毒肝炎等重大传染病的防治重大专项(2013ZX10002-010-007);上海工程技术研究中心专项课题(12DZ2251600).
第一作者简介：马宜冬, 硕士生. E-mail: mayidong@live.cn;王 真, 硕士. E-mail: wangzhenyangguang@163.com
通讯作者：金华君, HJ-Jin@hotmail.com;钱其军, qianqj@sino-gene.cn
摘要：目的 探讨靶向黏蛋白1(mucin 1,MUC1)的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)修饰的T细胞株(CAR-T)对MUC1高表达肝癌细胞的特异杀伤能力。方法 分别构建第1代与第3代靶向MUC1的CAR基因表达框(MUC1-CAR与 G3MUC1-CAR),并将其装入慢病毒载体,利用获得的重组慢病毒感染Jurkat细胞,通过CCK-8法、ELISA法、乳酸脱氢酶释放实验,分别检测在MUC1抗原存在条件下,CAR-T细胞的增殖、IL-2分泌量、杀伤作用。结果 成功构建2种靶向MUC1嵌合抗原受体表达框的重组慢病毒Jurkat CAR-T细胞株。两种Jurkat CAR-T细胞均能特异识别MUC1分子,杀伤MUC1高表达的肝癌细胞QGY-7701,而对MUC1低表达的正常肝细胞基本不杀伤;第3代CAR修饰的Jurkat T细胞接触MUC1分子后,其增殖速度、IL-2分泌量和杀伤效率均优于第1代MUC1修饰细胞(P<0.05或P<0.01)。结论 靶向MUC1的Jurkat CAR-T细胞能特异杀伤MUC1高表达的肝癌细胞。
关键词： 嵌合抗原受体     黏蛋白1     Jurkat细胞     肝细胞癌    
Specific cytotoxicity of MUC1 chimeric antigen receptor-engineered Jurkat T cells against hepatocellular carcinoma
MA Yi-dong1, WANG Zhen2, GONG Rui-zhi2, LI Lin-fang3, WU Hong-ping3, JIN Hua-jun3 , QIAN Qi-jun3*     
1. Department of Cell Biology, School of Biology and Basic Medical Sciences, Medical College, Soochow University, Suzhou 215123, Jiangsu, China;
2. Tumor Immunology and Gene Therapy Center, Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200438, China;
3. Laboratory of Viral and Gene Therapy, Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200438, China
Abstract: Objective To investigate the specific cytotoxicity of MUC1-specific chimeric antigen receptor (CAR)-engineered Jurkat T cells against hepatocellular carcinoma (HCC) cells. Methods The expression cassettes of both the first and the third generation MUC1-specific CAR gene (i.e. MUC1-CAR and G3MUC1-CAR) were constructed and cloned into lentivirus transfer plasmids, respectively. Then the obtained recombinant lentiviruses carrying the MUC1-specific CAR gene and hrGFP reporter genes were used to infect Jurkat T cells in vitro to establish MUC1-sepcific CAR-engineered Jurkat cells (i.e. CAR-T cells). Subsequently, the assays of CCK-8, ELISA, and LDH were used to detect the cell proliferation, IL-2 secretion and killing effect of the CAR-T cells, respectively. Results We successfully constructed the expression cassettes of MUC1-sepcific CAR gene and the corresponding recombinant lentivirus, established the MUC1-specific CAR-engineered Jurkat T cells. Both types of MUC1-specific CARs-engineered Jurkat T cells could recognize MUC1 molecule and specifically kill MUC1 over-expressed HCC cells while left normal hepatic cells almost undamaged. In addition, the cell proliferation, the secretion of IL-2 and killing effect of the G3MUC1-CAR-engineered Jurkat T cells was significantly superior to the MUC1-CAR-engineered counterpart(P<0.05 or 0.01). Conclusion The MUC1-sepcific CAR-engineered Jurkat T cells can specifically kill MUC1 over-expressed HCC cells.
Key words: chimeric antigen receptors     mucin 1     Jurkat cells     hepatocellular carcinoma    

近年来，利用肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)开展的过继细胞治疗在黑素瘤的治疗中取得令人振奋的临床效果[1]。然而对大部分肿瘤而言，难以获得肿瘤特异性的TIL细胞[2]。理想的替代方法就是对T细胞进行体外遗传操作，使其具备肿瘤特异性的增殖和杀伤功能。

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)由一个scFv单链抗体(由抗体VH区氨基酸序列和VL区氨基酸序列经Linker连接而成)，通过铰链结构与源于TCR复合体或者IgE 高亲和受体的跨膜和胞内信号结构域(源自CD3ζ/FcεRIγ免疫受体酪氨酸活化基序、源自CD28/4-1BB/OX40/ICOS/DAP10/LCK共刺激信号分子胞内结构域)连接构成[3]。经CAR遗传修饰的T细胞(CAR-T)，能够高效识别和杀伤由于MHC分子或抗原加工相关蛋白酶体低表达、逃逸TCR介导免疫反应的肿瘤细胞[4]。至目前为止，CAR结构已发展至3代，涉及肿瘤抗原包括CD19、HER2、CEA、PSCA等，已有29项CAR-T进入临床试验[5]，取得理想的临床疗效。因此，本研究尝试应用CAR修饰的T细胞株特异杀伤高表达黏蛋白1(mucin 1,MUC1)的肝癌细胞，为后续研究奠定基础。

1 材料和方法 1.1 主要材料及试剂

限制性内切酶购自NEB公司(New England Biolabs)；细胞株HEK-293T、QGY-7701、L02、Jurkat及质粒pMD.G(QJ005)、pCMVdelta8.91(QJ001)、pLV180为本实验保存。MUC1单链抗体基因克隆于HMFG2，HMFG2 VH：AM747043，HMFG2 VL：AF042143[6]。载体质粒结构设计主要参考Sadelain等[7]设计的嵌合抗原受体的结构。各个基因在GenBank中的序列号如下：CD8a hinge+TM基因序列号为AY039664.1，CD28基因序列号为XM_006712862.1，CD137基因序列号为U03397.1，CD3ξ基因序列号为AF228312.1，质粒载体基因交由捷瑞(Generay)公司全基因合成。2 mol/L CaCl2，2×Hank液由实验室自配。Cell Counting Kit-8(碧云天，产品编号C0037)，乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(碧云天，产品编号C0017)，人IL-2 ELISA kit(上海依科赛公司，货号EH002-96)。Human MUC-1 Allophycocyanin MAb (Clone 604804)；Mouse IgG2B、Mouse IgG2B Allophycocyanin Isotype Control (同型对照)均购自R&D公司。Recombinant human MUC1-Fc(Sinobiological公司，12123-H02H)；Purified Mouse Anti-Human CD3ξ(BD公司，货号551033)。

1.2 质粒的构建与鉴定

将全基因合成的Anti-MUC1(VH-VL)-CD3ζ-F2A-hrGFP和CD28-CD137-CD3ζ-F2A-hrGFP基因通过基础分子克隆技术装入慢病毒载体，分别构建pLV180-MUC1-CAR-F2A-hrGFP与pLV180-G3MUC1-CAR-F2A-hrGFP，以及不含CAR基因的对照载体pLV180-hrGFP。 1.3 慢病毒包装

将HEK-293T细胞4×106/孔的密度铺于100 mm培养皿中，用含10%胎牛血清的DMEM培养液于37℃、5% CO2孵箱培养至60%～80%融合度时，换8 mL无血清DMEM培养液于37℃、5% CO2孵箱培养。2 h后，用三质粒磷酸钙法包装慢病毒，具体步骤如下：在1个10 mL离心管中加慢病毒载体质粒30 μg，pCMVdelta8.91(QJ001) 20 μg，pMD.G(QJ005) 10 μg，2 mol/L CaCl2 124 μL，加双蒸水补全至1 mL，再加1 mL 2×Hank，充分混匀，室温静置20 min，然后逐滴加入到上述100 mm 培养皿中，37℃、3% CO2孵箱培养，6～8 h后，换新鲜含10%胎牛血清的DMEM于37℃、5% CO2孵箱培养培养。48 h 和72 h 后分别收集100 mm 培养皿中含病毒的上清液，离心去除细胞碎片，0.45 μm 滤膜(Millipore)过滤后，将病毒上清液移入Millipore 浓缩柱，离心 30 min，浓缩至100～200 μL，将浓缩的病毒液移入EP管，-80℃冰箱中保存。 1.4 慢病毒感染Jurkat细胞

将生长状态良好的Jurkat细胞以5×105/孔的密度接种于6孔板中，加无血清RPMI 1640培养基至2 mL，加入2 μL 8 μg/mL Polybrene，加入100 μL纯化病毒液，混匀，于37℃、5% CO2孵箱培养，8 h后换成10%FBS的RPMI 1640培养，48 h 后观察绿色荧光。 1.5 Western 印迹检测CAR表达

离心收集生长状态良好的经慢病毒感染的5×105个Jurkat 细胞株，用预冷的生理盐水清洗2遍，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液160 μL，放在冰盒中于摇床上轻微摇晃，30 min 后加40 μL 5×上样buffer，然后在100℃水浴锅里煮沸10 min，蛋白样品保存于-80℃冰箱或直接使用。配制好SDS-PAGE蛋白胶，点样，跑电泳，将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入稀释过的一抗，4℃冰箱过夜，取出膜后，用TBST洗3次，每次10 min，加入稀释过的二抗，孵育2 h，取出膜后，用TBST洗3次，每次10 min，加显色剂，最后在凝胶成像仪上拍照。 1.6 细胞增殖实验

用5 μg/mL MUC1抗原蛋白包被96孔板过夜，第2天，用PBS洗1遍，每孔加入2 000 个Jurkat细胞，补齐培液至100 μL，37℃、5% CO2孵箱孵育48 h。每孔加10 μL CCK-8溶液，37℃、5%CO2培养90 min，在450 nm测定光密度值(D)。详细步骤参见CCK-8 kit使用说明书。 1.7 肝癌细胞MUC1表达水平及IL-2的测定

将生长状态良好的QGY-7701和L02细胞消化下来，离心收集，用PBS清洗2遍，加入抗体，室温孵育30 min后，用PBS洗2次，重悬浮，上样，经流式细胞仪检测肝癌细胞MUC1表达水平。将5 000个Jurkat-CAR和 5 000个QGY-7701或L02细胞在24孔板中共培养，48 h后离心2 min，收取200 μL上清，使用人IL-2 ELISA kit 检测 IL-2含量，具体步骤参见人IL-2 ELISA kit使用说明书。 1.8 杀伤实验

接种100 μL 1×104/孔的靶细胞(QGY-7701或L02)到96孔细胞培养板中，按不同效靶比(E/T值0.5∶1、1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、16∶1)加入Jurkat-CAR细胞，补培养液至200 μL，37 ℃、5%CO2共培养24 h。共培养24 h后，从细胞培养箱里取出细胞培养板，在只接种QGY-7701或L02细胞的培养孔中加入试剂盒提供的乳酸脱氢酶(LDH)释放试剂，加入量为原有培养液体积的10%(20 μL)。加入LDH释放试剂后，反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育。1 h后，将细胞培养板用多孔板离心机400×g离心5 min。分别取各孔的上清液120 μL，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。各孔分别加入60 μL LDH检测工作液。混匀，室温(约25℃)避光孵育30 min(可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动)。然后在490 nm处测定光密度值。详细步骤参见乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒使用说明书。 1.9 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，检验水准(α)为0.05。 2 结 果 2.1 质粒的构建与鉴定

构建了第1代CAR(pLV180-MUC1-CAR-F2A-hrGFP)和第3代CAR(pLV180-G3MUC1-CAR-F2A-hrGFP)慢病毒载体，CAR结构简图见图 1。pLV180-G3MUC1-CAR-F2A-hrGFP、pLV180-MUC1-CAR-F2A-hrGFP、pLV180-hrGFP质粒经3组酶切后经电泳鉴定正确(图 2)。

图 1 CAR结构简图 Fig 1 Schematic structure of CAR

图 2 质粒电泳鉴定图 Fig 2 Electrophoresis identification of digested plasmid A：pLV180-G3MUC1-CAR-F2A-hrGFP.1:NheⅠ+SaⅡ(2 500 bp+6 300 bp),2:ClaⅠ+NheⅠ(560 bp+8 300 bp)，3:EcoRⅠ+XbaⅠ(1 600 bp+7 200 bp). B：pLV180-MUC1-CAR-F2A-hrGFP. 4:ClaⅠ+NheⅠ(560 bp+8 100 bp)，5: NheⅠ+XhoⅠ(2 200 bp+6 300 bp)，6:EcoRⅠ+XhoⅠ(1 400 bp+7 200 bp); C：pLV180-hrGFP. 7:ClaⅠ+EcoRⅠ(560 bp+6 600 bp)，8:EcoRⅠ +BamHⅠ(720 bp+6 400 bp)，9:NcoⅠ(1 800 bp+5 300 bp). M: Marker
2.2 慢病毒包装及感染Jurkat细胞结果

应用三质粒磷酸钙法感染HEK-293T细胞，获取携带嵌合抗原受体基因的重组慢病毒。感染24 h后，在荧光显微镜下表达绿色荧光的HEK-293T细胞达到80%以上，表明含绿色荧光基因的慢病毒载体质粒在HEK-293T细胞能高效地包装携带嵌合抗原受体基因的慢病毒。将得到的含慢病毒载体的上清经离心纯化后，感染Jurkat T 细胞，传代培养3代后，在荧光显微镜下观察表达绿色荧光的Jurkat T细胞达到95%以上(图 3)，由此可以确定包装的慢病毒滴度很高，可以有效感染Jurkat T 细胞株，构建携带CAR的Jurkat T 细胞株。

图 3 慢病毒感染Jurkat T细胞荧光图 Fig 3 Jurkat T cells infected by lentivirus under fluorescence microscope A: Jurkat T cells infected by lenti-G3MUC1-CAR-F2A-hrGFP; B: Jurkat T cells infected by lenti-MUC1-CAR-F2A-hrGFP; C: Jurkat T cells infected by lenti-hrGFP. Original magnification: ×400
2.3 Western 印迹检测CAR在Jurkat细胞中的表达

Western 印迹检测结果(图 4)表明：Jurkat T细胞高表达CAR蛋白。 2.4 增殖实验结果

Jurkat-CAR 细胞在受到5 μg/mL浓度包被MUC1蛋白抗原刺激48 h后比Jurkat-CAR细胞单独培养增殖速度快(图 5)，其中Jurkat-G3MUC1-CAR细胞快67%，Jurkat-MUC1-CAR细胞速度快23%。对照组为Jurkat-hrGFP细胞，其是否接受MUC1蛋白抗原刺激增殖速度没有明显差别。

图 4 Jurkat-CAR T细胞裂解物的免疫印迹图 Fig 4 M: Marker; 1: Control; 2: MUC1-CAR; 3: G3MUC1-CAR

图 5 Jurkat-CAR细胞株在5 μg/mL浓度包被MUC1蛋白抗原刺激48 h后细胞增殖柱状图 Fig 5 Proliferation of Jurkat-CAR T cells 48 h after stimulation of 5 μg/mL recombinant protein MUC1 +: Jurkat T cells co-cultured with MUC1-Fc,-: Jurkat T cells alone; **P<0.01,n=3, ±s
2.5 IL-2的检测结果

流式检测表明：肝癌细胞株QGY-7701高量表达MUC1，而正常肝细胞L02 MUC1表达量低。ELISA检测Jurkat T细胞与QGY-7701共培养上清中的IL-2量。结果(图 6)表明：第3代和第1代 MUC1-CAR Jurkat T细胞与7701共培养分泌IL-2的量明显高于MUC1-CAR T细胞单独培养，第3代MUC1-CAR T细胞分泌IL-2的量明显高于第1代MUC1-CAR Jurkat T细胞；第3代和第1代 MUC1-CAR T细胞与L02共培养分泌，只有第3代MUC1-CAR T细胞分泌IL-2的量区别于第3代MUC1-CAR T细胞单独培养，其余都无明显区别，Jurkat分泌IL-2的量都停留在本体水平。

图 6 IL-2在不同Jurkat-CAR细胞株中的表达量 Fig 6 ELISA results for IL-2 secretion of different Jurkat-CAR cells +: Jurkat T cells co-cultured with QGY-7701/L02,-: Jurkat T cells alone; **P<0.01,*P<0.05,n=3, ±s
2.6 杀伤实验结果

结果(图 7)表明：随着E/T值的升高，Jurkat T 细胞杀伤QGY-7701细胞能力逐渐增强。其中，在E/T=16时，Jurkat-G3MUC1-CAR杀伤QGY-7701细胞达到88%，Jurkat-MUC1-CAR杀伤QGY-7701细胞达到65%，对照组杀伤QGY-7701细胞达到51%，可见经嵌合抗原受体修饰的Jurkat T细胞能有效杀伤MUC1高表达的QGY-7701肝癌细胞。Jurkat T细胞对L02细胞的杀伤作用无显著差异，表明MUC1-CAR 的修饰未增强Jurkat 细胞对L02的本底杀伤活性。

图 7 Jurkat-CAR细胞株在不同效靶比时的杀伤效果折线图 Fig 7 QGY-7701 and L02 lysis at indicated effector/target ratios of Jurkat-CAR cells A: QGY-7701; B: L02. n=3, ±s
3 讨 论

原发性肝癌是我国最常见恶性肿瘤之一，预后差、死亡率高。大多数患者发现时已处于中晚期，丧失手术机会，且其对化疗敏感性差，因而亟需研发其他治疗手段应用于肝癌，尤其是中晚期肝癌的临床治疗。MUC1是一种大分子跨膜糖蛋白，广泛高表达于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、肝癌和胰腺癌等恶性肿瘤，其胞外区主要由20个氨基酸(PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA)的核心重复序列组成，是MUC1蛋白糖基化修饰位点，且相对于正常细胞，肿瘤细胞表面MUC1具有不同的糖基化结构[8]。过表达和糖基化异常都使MUC1成为各种免疫治疗的理想靶点。其中，根据MUC1核心重复序列设计的脂质体癌症疫苗(L-BLP25)能高效激活患者免疫反应，已进入Ⅲ期临床试验[9]；抗MUC1的抗体Yttrium-90-labeled muHMFG联合化疗治疗卵巢癌，已经进入Ⅲ期临床试验[10]。

本研究应用肿瘤过继细胞治疗策略，将MUC1作为靶点用于肝癌治疗。本研究克隆了抗原决定簇位于MUC1蛋白异常糖基化位点的MUC1单链抗体(HMFG2)基因，分别构建了针对MUC1分子的第1代与第3代MUC1 嵌合抗原受体(MUC1-CAR/G3MUC1-CAR)，并将其装载到慢病毒载体，利用包装获得的重组慢病毒感染Jurkat T 细胞，分别构建了表达第1代和第3代MUC1特异性CAR的Jurkat T细胞株，验证了该CAR-T细胞对肝癌细胞的杀伤功能与杀伤特异性。结果表明，相对于对照，两种经MUC1嵌合抗原受体修饰的Jurkat T细胞均能特异识别MUC1分子，杀伤MUC1高表达的肝癌细胞QGY-7701，而对MUC1低表达的正常肝细胞基本不杀伤。此外，第3代CAR(G3MUC1-CAR)修饰的Jurkat T细胞接触MUC1分子后，其增殖速度、IL-2分泌量和杀伤效率均优于第1代MUC1修饰细胞(MUC1-CAR)。本研究结果为应用MUC1-CAR修饰的患者原代T细胞用于肝癌过继性免疫细胞治疗的研究提供了实验依据。

4 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。

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