第二军医大学  2014, Vol. 35 Issue (11): 1243-1246   PDF    
引用本文
王君, 郑兴. 载有人心肌细胞钠离子通道及PRKAG2基因的HEK-293T细胞模型的建立. 第二军医大学学报, 2014，35(11): 1243-1246  
WANG Jun, ZHENG Xing. Establishing HEK-293T cell model carrying human sodium channel and PRKAG2 gene. Academic Journal of Second Military Medical Universitya, 2014,35(11): 1243-1246 (in Chinese with English abstract)  
载有人心肌细胞钠离子通道及PRKAG2基因的HEK-293T细胞模型的建立
王君1,2, 郑兴1     
1. 第二军医大学长海医院心内科, 上海 200433;
2. 大连市第五人民医院心内科, 大连 116000
*通信作者
2014-3-11 收稿, 2014-10-10 改回.
基金项目：国家自然科学基金(81170092).
第一作者简介：王 君, 硕士. E-mail: wangjunsmmu@163.com
通讯作者：郑兴, zhengxing57530@163.com
摘要：目的 尝试建立类似PRKAG2心脏综合征钠离子通道功能的HEK-293T细胞模型,为探讨PRKAG2心脏综合征心律失常机制奠定基础。方法 分别构建人PRKAG2基因质粒载体和SCN5A基因质粒载体,共转人胚肾细胞(HEK-293T);应用免疫荧光法、Real-time PCR、蛋白质印迹法检测HEK-293T细胞转染结果及基因表达情况。结果 转染48 h后,HEK-293T细胞在细胞免疫荧光显微镜下可见红色荧光和绿色荧光。Real-time PCR及蛋白印迹结果证实:单独转染SCN5A组、SCN5A+PRKAG2组、SCN5A+G100S组、SCN5A+R302Q组SCN5A基因及蛋白均有表达,而在空白对照组无表达,差异有统计学意义(P<0.05);SCN5A+PRKAG2组PRKAG2基因及蛋白高表达,而空白对照组、SCN5A组、SCN5A+R302Q组、SCN5A+G100S组表达量较低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 成功建立类似PRKAG2心脏综合征钠离子通道的HEK-293T细胞模型,为后续研究奠定了基础。
关键词： PRKAG综合征     心脏肌细胞     钠通道     人胚肾细胞     共转染    
Establishing HEK-293T cell model carrying human sodium channel and PRKAG2 gene
WANG Jun1,2, ZHENG Xing1     
1. Department of Cardiology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China;
2. Department of Cardiology, The Fifth People's Hospital of Dalian, Dalian 116000, Liaoning, China
*Corresponding authors
Abstract: Objective To establish a HEK-293T cell model with sodium channel function similar to that in PRKAG2 syndrome. Methods Vectors of PRKAG2 gene and SCN5A gene were constructed and were used to co-transfect HEK-293T cells. Immunofluorescence, real-time PCR and Western blotting analysis were used to examine the transfection results and the expression of interested mRNA and protein. Results Imunofluorescence findings showed red fluorescence and green fluorescence in HEK-293T cells 48 hours after co-transfection. Real-time PCR and Western blotting analysis showed SCN5A expression in pure SCN5A group, SCN5A + wild-type group, SCN5A + R302Q mutant group, and SCN5A + G100S mutant group, but not in the blank control group, showing significant significance(P<0.05). Expression of PRKAG2 gene and protein in SCN5A+PRKAG2 group was significantly higher than those in the blank control group, pure SCN5A group, SCN5A+R302Q, and SCN5A+G100S groups (P<0.05) . Conclusion We have successfully established a HEK-293T cell model with sodium channel function similar to that in PRKAG2 syndrome, paving a way for future study.
Key words: PRKAG2 syndrome     cardiac myocytes     sodium channels     HEK-293T cells     co-transfection    
PRKAG2心脏综合征是由于编码单磷酸腺苷激活蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)γ2亚基的PRKAG2基因发生点突变而导致的罕见常染色体显性遗传性心脏病，主要表现为家族性心肌肥厚、心室预激和心肌糖原沉积[1, 2]。与预激综合征等不同，PRKAG2心脏综合征所致心室预激等心律失常的发病机制尚不清楚，值得深入探讨。因此，本研究拟建立载有人心肌细胞钠离子通道及AMPK γ2亚基的HEK-293T细胞模型，为进一步研究PRKAG2心脏综合征心律失常发病机制奠定基础。 1 材料和方法 1.1 主要材料及试剂

质粒 pCDH-GFP、质粒p3×FLAG-CMV-7.1、PRKAG2基因、HEK-293T细胞由本实验室保存，转染试剂LipofectaminTM 2000购自美国Invitrogen公司，人心肌细胞钠离子通道(SCN5A)基因由华大基因合成，其他试剂购自Invitrogen、TaKaRa公司、Bioteke Corporation、国药集团、碧云天生物工程有限公司、上海国药等公司。 1.2 质粒载体的构建及转染

通过PCR技术扩增目的基因，后将载体与目的基因通过酶切反应及连接反应构建质粒载体，构建SCN5A过表达载体pCDH-GFP-SCN5A及PRKAG2过表达载体p3×FLAG-CMV-7.1-PRKAG2，应用突变试剂盒在载体p3×FLAG-CMV-7.1-PRKAG2基础上构建R302Q突变体及G100S突变体载体。按每孔2×105个HEK-293T细胞，质粒(μg)∶LipofectaminTM 2000(μL)=1∶2进行转染，置于细胞培养箱37℃、5％CO2条件下培养48 h。在4~6 h的时候可以取出培养板，小心吸去培养基，每孔加1 mL新鲜的含10%血清H-DMEM培养基，37℃、5％CO2继续培养48 h。 1.3 HEK-293T细胞免疫荧光染色

载体p3×FLAG-CMV-7.1-PRKAG2载有GFP绿色荧光标记蛋白基因，载体pCDH-GFP-SCN5A载有FLAG标签蛋白基因，经过细胞免疫荧光染色后，可在荧光显微镜下看到红色荧光。HEK-293T细胞共转染48 h后在荧光显微镜下观察细胞荧光情况。 1.4 HEK-293T细胞real-time PCR验证

共转染48 h后的HEK-293T细胞，提取细胞总RNA进行real-time PCR验证。首先提取总RNA，而后合成cDNA，最后进行Real-time PCR反应。 1.5 HEK-293T细胞Western 印迹验证

共转染48h后的HEK-293T细胞，提取细胞总蛋白进行Western印迹验证。先将各组细胞进行蛋白质抽提及浓度鉴定，之后进行SDS-PAGE电泳、蛋白质转移、蛋白质显像、免疫检测、化学发光检测。 1.6 统计学处理

采用SPSS14.0统计软件对实验数据进行分析，所有计量资料均采用 ±s 表示，检验水准(α)=0.05。 2 结 果

2.1 转染后HEK 293T细胞荧光检测

结果(图 1)发现：各组在曝光量相同情况下，SCN5A(S)组可见绿色荧光标记，SCN5A+PRKAG2野生型组(S+P)、SCN5A+G100S组(S+G)、SCN5A+R302Q组(S+R)细胞内均可见绿色和红色荧光标记，表明PRKAG2基因及SCN5A基因均被转染入细胞内。

图 1 转染后HEK-293T细胞免疫荧光染色 Fig. 1 Immunofluorescence staining of co-transfected HEK-293T cells S: SCN5A; S+P: SCN5A+PRKAG2; S+G: SCN5A+G100S; S+R: SCN5A+R302Q. Original magnification: ×100
2.2 转染后HEK-293T细胞real-time PCR验证

结果表明：SCN5A组、SCN5A+PRKAG2野生型组、SCN5A+R302Q组、SCN5A+G100S组SCN5A基因均表达，而空白对照组未表达(图 2A)，差异有统计学意义(P<0.01)；SCN5A+PRKAG2野生型组PRKAG2基因高表达，而SCN5A组、SCN5A+R302Q组、SCN5A+G100S组表达量较低(图 2B)，差异有统计学意义(P<0.01)。

图 2 转染后HEK-293T细胞real-time PCR验证 Fig. 2 Real-time PCR verification of co-ransfected HEK-293T cellsA: SCN5A RNA; B: PRKAG2 RNA. S: SCN5A; S+P: SCN5A+PRKAG2; S+G: SCN5A+G100S; S+R: SCN5A+R302Q group. **P<0.01 vs control group; n=9, ±s
2.3 转染后HEK-293T细胞的Western印迹验证

结果(图 3)表明：与空白对照组相比Nav 1.5蛋白在SCN5A组(S)、SCN5A+PRKAG2野生型组(S+P)、SCN5A+R302Q组(S+R)、SCN5A+G100S组(S+G)均有表达，表达量基本相同，而在空白对照组无表达，差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组相比，AMPKR2(PRKAG2基因编码蛋白)在S+P组高表达，而在S组、S+R组、S+G组表达量较低，差异有统计学意义(P<0.05)。

图 3 转染后HEK-293T细胞的Western印迹验证 Fig. 3 Western blotting analysis for verification of co-ransfected HEK-293T cells S: SCN5A; S+P: SCN5A+PRKAG2; S+G: SCN5A+G100S; S+R: SCN5A+R302Q. *P<0.05 vs control group; n=3, ±s

3 讨 论

AMPK是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是由1个催化亚基(α)和2个调节亚基(β、γ)组成的异源三聚体复合物。其中α亚单位的Thr-172位点是调节AMPK功能的至关重要的磷酸化位点；β亚基包含2个保守的区域——中间的糖原结合区和C-末端与其他两个亚基的结合区；γ亚基包含4个cystathionine-β-synthase串联重复序列，组成2个Bateman 域，每个Bateman 域能结合1个AMP或ATP。AMPK的活化主要通过以下3种机制：(1)变构激活；(2)通过AMPK的上游激酶(AMPKKs)促使α亚基 Thr-172的磷酸化；(3)抑制PPS的去磷酸化作用。AMPK是重要的能量调节酶，通过增加产能和减少耗能来弥补能量不足[1-2]。经过研究发现，AMPK参与了多种心脏病发生和发展，包括心肌肥厚、心力衰竭、心肌缺血再灌注损伤以及调节心肌细胞离子通道功能，研究发现调节AMPK活性可使心脏获益[4-6]。因此人们越来越认识到，AMPK对心脏来说起着至关重要的作用[1, 3]，极有可能成为未来心脏病治疗的新靶点。

心脏的电压-门控钠离子通道是位于心肌细胞的细胞膜跨膜蛋白。钠通道由α亚基及β亚基组成，其中α亚基——Nav1.5(由SCN5A基因编码)由4个结构域(DⅠ~DⅣ)组成，每个结构域包含6个跨膜α-螺旋片段(S1~S6)，其中每个结构域的带正电荷的S4形成了电压感应器，在细胞膜去极化时促使通道激活，S5、S6组成了钠离子孔道[7-8]。通过钠离子孔道进入心肌细胞内的钠离子参与了心肌细胞0期快速去极化，在心肌细胞电活动的产生及传导过程中起着核心作用。在生理情况下，钠离子通道的激活和失活受到严格调控，从而保持心肌的兴奋性。先天性或获得性钠离子通道功能异常可导致致命性心律失常的发生，PRKAG2心脏综合征就是由于编码AMPK γ2亚基(由PRKAG2基因编码)的基因点突变的先天性心脏病。Light等[9]研究发现PRKAG2突变体可导致钠通道失活延迟，进而导致心律失常。2007年由张静等[10]首次发现汉族人PRKAG2心脏综合征家系，对该家系进行基因分析发现了一个新的PRKAG2基因突变位点——G100S，该位点区别于之前发现的所有突变位点，它位于非CBS区域。通过对PRKAG2基因非CBS区域的G100S突变进行功能研究，可以明确这一新突变在汉族人PRKAG2心脏综合征家系心律失常发病中的作用通路，并加深对AMPKγ2亚基非CBS区域的功能认识，对全面阐述AMPKγ2亚基在遗传性心脏病中的作用具有重要价值。

本实验通过将编码人心肌细胞钠离子通道的SCN5A基因质粒载体及PRKAG2基因质粒载体共转染HEK-293T细胞，建立了PRKAG2基因突变体对心肌细胞钠离子通道影响的研究模型，从而为研究PRKAG2 G100S突变体对PRKAG2心脏综合征心律失常发病机制的影响奠定了基础。
4 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。

参考文献
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