第二军医大学  2014, Vol. 35 Issue (10): 1078-1082   PDF    
引用本文
何朝晖, 刘浏, 谭关平, 孙晓川. 儿茶酚胺氧位甲基转移酶基因多态性与动脉瘤性蛛网膜下隙出血后早期脑血管痉挛的相关性[J]. 第二军医大学学报, 2014, 35(10): 1078-1082  
HE Zhao-hui, LIU Liu, TAN Guan-ping, SUN Xiao-chuan. Correlation between COMT gene polymorphism and early cerebral vasospasm after aneurismal subarachnoid hemorrhage[J]. Academic Journal of Second Military Medical Universitya, 2014, 35(10): 1078-1082 (in Chinese with English abstract)  
儿茶酚胺氧位甲基转移酶基因多态性与动脉瘤性蛛网膜下隙出血后早期脑血管痉挛的相关性
何朝晖, 刘浏, 谭关平, 孙晓川*    
重庆医科大学附属第一医院神经外科, 重庆 400016
收稿日期:2014-1-6     接受日期: 2014-4-8.
基金项目：国家自然科学基金面上项目(81371309)，国家临床重点专科建设项目(财社[2011]170号)，重庆市科委自然科学基金(CSTC，2008BB5219).
作者简介：何朝晖，博士，教授.E-mail：geno_he@163.com
通信作者(Corresponding author)：孙晓川，E-mail：sunxch1445@gmail.com
摘要：目的 探讨儿茶酚胺氧位甲基转移酶(catechol-O-methyltransferase, COMT)基因多态性与动脉瘤性蛛网膜下隙出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)后早期脑血管痉挛(cerebral vasospasm, CVS)的相关性。方法 搜集重庆医科大学附属第一医院神经外科2008年1月至2008年12月收治的167例自发性SAH急性期(<3 d)患者的临床资料。运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术分析SAH患者COMT基因型及等位基因频率；运用TCD判定SAH患者早期CVS的严重程度；运用Hunt-Hess分级评估患者病情严重程度；运用头颅CT的Fisher分级评估出血量的多少。采用χ2检验和logistic回归分析等方法分析COMT基因分型结果等临床资料与CVS的相关性。结果 各等位基因分布符合Hardy-Weinberg定律,研究样本为遗传平衡群体。A等位基因携带者的CVS发生率(51.7%)明显高于G等位基因携带者(38.5%)。A/A基因型患者CVS发生率(66.7%)明显高于G/G(35.9%)。单因素logistic回归分析提示A等位基因、A/A基因型和Hunt-Hess分级3~5级与CVS具有相关性。调整临床相关因素后,多因素logistic回归仍提示A等位基因、A/A基因型是SAH后早期CVS的危险因素。结论 COMT A等位基因、A/A基因型可能是SAH后早期CVS的危险因素。
关键词： 蛛网膜下隙出血     脑血管痉挛     儿茶酚胺氧位甲基转移酶     单核苷酸多态性    
Correlation between COMT gene polymorphism and early cerebral vasospasm after aneurismal subarachnoid hemorrhage
HE Zhao-hui, LIU Liu, TAN Guan-ping, SUN Xiao-chuan*    
Department of Neurosurgery, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
Abstract: Objective To analyze the correlation between catechol-O-methyltransferase (COMT) gene polymorphism and cerebral vasospasm (CVS) in early period after subarachnoid hemorrhage (SAH). Methods The clinical data of 167 patients with spontaneous SAH, who were treated in our hospital from Jan. 2008 to Dec. 2008, were collected for this study. COMT genotyping was performed by means of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). The degree of CVS was identified by transcranial Doppler (TCD). Hunt-Hess classification was used to evaluate the severity of the patients' condition. The bleeding amount was evaluated by means of Fisher classification of head CT. χ2 test (SPSS13.0 software) and logistic regression were adopted to analyze the correlation of COMT gene polymorphism and other clinical data with early CVS after SAH. Results The distribution of each allele matched with Hardy-Weinberg law and the research samples were heredity equilibrium population. Early CVS incidence of patients with COMT A allele was significantly higher than those with COMT G allele (51.7% vs 38.5%, P<0.01). Early CVS incidence of patients with COMT A/A genotype was significantly higher than those with COMT G/G genotype (66.7% vs 35.9%, P<0.05). Univariate logistic regression demonstrated that COMT A allele, A/A genotype and Grade 3-5 of Hunt-Hess classification were all associated with early CVS. After adjustment of general information, further multivariate logistic regression demonstrated that COMT A allele, A/A genotype were the risk factors of early CVS after SAH. Conclusion COMT A allele and A/A genotype might be risk factors of early CVS after SAH.
Key words: subarachnoid hemorrhage     cerebral vasospasm     catechol-O-methyltransferase     single nucleotide polymorphism    

动脉瘤性SAH后CVS可造成严重脑缺血和脑损害，是动脉瘤破裂后患者病情加重导致死亡或残疾的主要原因。临床工作中常见SAH后早期CVS的严重程度存在个体差异的现象。目前研究发现，某些基因的多态性与SAH后CVS的严重程度的个体差异有关[1]。早期研究表明，SAH后早期CVS与机体释放入血的儿茶酚胺(catecholamine，CA)增多有关[2]。儿茶酚胺氧位甲基转移酶(catechol-O-methyltransferase,COMT)是CA主要的分解代谢限速酶，据此我们推测，SAH后早期CVS的严重程度的个体差异可能与COMT活性的个体差异有关，而COMT活性的个体差异可能由其基因多态性决定。但迄今为止，COMT的基因多态性是否与SAH后早期CVS的严重程度有关尚未见相关报道。本研究旨在通过验证COMT基因多态性与SAH后早期CVS的相关性，探讨SAH后早期CVS程度个体差异的可能机制。

1 资料和方法 1.1 病例选择

入选标准：(1)自发性SAH后3 d内的患者；(2)SAH 患者均经CT或血性脑脊液证实；(3)临床资料记录完整。排除标准：(1)发病时有可疑头部外伤史；(2)出血3 d内伴有脑疝形成；(3)出血后存活不足3 d的病例。

1.2 临床资料记录

对所有入选的病例记录性别、年龄、高血压病史、高血脂病史、入院时Hunt-Hess分级情况、发病后首次头颅CT的Fisher分级情况、经CTA或DSA及经颅多普勒超声(transcranial Doppler sonography，TCD)检查结果、治疗措施等。将患者血压控制在90~140/50~90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)范围内，常规予以抗脑血管痉挛、抗纤溶等治疗。

1.3 SAH患者的血管痉挛判断标准

行CTA或DSA检查提示动脉瘤位于前循环(大脑前动脉ACA、大脑中动脉MCA)的患者，手术或介入治疗前，在出血后的1~3 d内，每天行TCD检查，测量大脑中动脉和大脑前动脉的血流速度，取每例患者TCD检查测得的大脑中动脉的最高流速(Vm)为判断依据，具体标准如下[3]：无痉挛，Vm<120 cm/s；有痉挛,Vm≥120 cm/s。 1.4 COMT基因型分析

引物设计和合成由上海生工生物工程有限公司完成，特异性扩增COMT基因第4外显子第158位氨基酸的基因序列。序列为：P1，5′-TCG TGG ACG CCG TGA TTC AGG-3′；P2，5′-AGG TCT GAC AAC GGG TCA GGC-3′。PCR反应体系：DNA 2.0 μL，P1 0.5 μL，P2 0.5 μL，Taq酶 10.0 μL，H2O 7.0 μL。PCR反应条件：94℃ 5 min→(94℃ 30 s→57℃ 30 s→72℃ 30 s)×30→72℃ 10 min。限制性酶切反应体系：NIa Ⅲ 0.5 μL；100×BSA 0.2 μL; 10× Buffer 2 μL; PCR扩增产物10 μL; 灭菌水,7.3 μL。5 V/1 cm电泳。电泳后于紫外灯下观察，并于成像系统成像。PCR产物全长应为217 bp。G等位基因含83 bp、197 bp两个NIa Ⅲ酶切位点，经NIa Ⅲ酶切后应呈现83、114、20 bp共3个条带；A等位基因含83 bp、179 bp、197 bp 3个NIa Ⅲ酶切位点，应被酶解为83、96、18、20 bp共4个条带。结果判读：参照Richard方法加以简化，做出分型结果。

1.5 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，χ2检验分析自发性SAH患者的临床资料中各相关因素的构成比；χ2检验分析COMT各基因型和等位基因患者CVS的发生率的统计学差异；logistic单因素回归分析各相关因素、COMT基因型及等位基因和CVS的相关性；对临床资料进行调整后，采用logistic多元回归分析COMT基因型及等位基因和CVS的相关性。多元回归方程采用Forward wald方法，变量入选标准为P<0.05，剔除标准为P>0.10。

2 结 果 2.1 SAH患者的相关临床资料

根据纳入标准和排除标准，2008年1月1日至2008年12月31日重庆医科大学附属第一医院神经外科收治的167例自发性SAH患者入选本研究。所有患者均进行COMT基因型鉴定。167例患者中入院时Hunt-Hess分级1~2级者135例，3~5级者32例；头颅CT的Fisher分级1~2级者104例，3~4级者63例；TCD检查发现无CVS 97例(58.1%)，有CVS 70例(41.9%)。根据TCD结果，将患者分为CVS(+)组与CVS(-)组。经χ2检验分析(表 1)发现：CVS(+)组与CVS(-)组在年龄、性别、高血压病史、高血脂病史、Fisher分级级别的构成上差异无统计学意义，而CVS(+)组中Hunt-Hess分级3~5级的构成比较CVS(-)组高，差异有统计学意义(P=0.022 6)。

表 1 入选患者基本临床资料 Tab 1 Clinical data of the included spontaneous SAH patients
2.2 COMT基因型分布和等位基因频率

COMT基因型和等位基因频率分析结果表明：G/G、G/A、A/A基因型分别为92(55.1%)、63(37.7%)、12(7.2%)例，分布符合Hardy-Weinberg定律，研究样本为遗传平衡群体。

2.3 COMT基因多态性与CVS的关系 2.3.1 COMT基因型与CVS的关系

A/A基因型患者CVS发生率(66.7%,8/12)明显高于G/G(30.4%,28/92)，差异有统计学意义(χ2=6.157 1,P=0.013 1)；A/A基因型患者CVS发生率也高于G/A基因型患者(46.0%,29/63)，但差异无统计学意义(χ2=1.717 1,P=0.190 1)；G/A基因型患者CVS发生率(46.0%)也高于G/G基因型患者(30.4%)，但差异无统计学意义(χ2=3.275 4,P=0.087 3)。

2.3.2 COMT等位基因频率与CVS的关系

A等位基因携带者CVS发生率(51.7%,45/87)明显高于G等位基因携带者(34.4%,85/247)，差异有统计学意义(χ2=8.110 4，P=0.004 4)。

2.4 CVS发生的影响因素分析

单因素logistic回归分析显示：(1)A等位基因与CVS具有相关性(P=0.021 7)，G等位基因与CVS无明显相关(P=0.135 6)；(2)A/A基因型与CVS具有相关(P=0.022 4)，G/G和G/A基因型与CVS无明显相关(P=0.197 4，P=0.073 6)；(3)Fisher分级3~4级与CVS无明显相关(P=0.058 7)；(4)Hunt-Hess分级3~5级与CVS具有相关性(P=0.043 2)。多因素logistic回归分析显示：调整临床资料后，仍然发现A等位基因、A/A基因型是CVS的危险因素(P=0.039 7，P=0.031 0)。详见表 2。

表 2 CVS发生的影响因素分析 Tab 2 Logistic regression analysis of factors for CVS
3 讨 论

TCD是目前临床上检查和连续监测CVS的最常用方法[4]。研究证明TCD所反映的血流速度增加与动脉造影所显示的脑血管痉挛有很好的相关性，特别是大脑中动脉[5]。Aslid[6]根据TCD的临床追踪观察，对SAH引起的CVS进行临床分级：血流速度120~140 cm/s为轻度血管痉挛，140~200 cm/s为中度血管痉挛，大于200 cm/s时为重度血管痉挛，小于120 cm/s时无血管痉挛表现。因此，本研究采用TCD在SAH后急性期(1~3 d)观测SAH患者的血流动力学变化，并以TCD观察最准确和最灵敏的大脑中动脉为主要观测点来诊断CVS。

临床工作中常发现部分患者中出血量多少与CVS严重程度不相符，如部分SAH量少的患者出现较为严重的CVS，而部分SAH量多的患者不出现CVS。这提示SAH后CVS的严重程度及患者预后存在个体差异，而机体的个体差异可能与基因多态性有关。目前研究发现，某些基因的多态性与SAH后CVS的严重程度有关，并且可能影响到SAH患者预后[1]。前已述及，SAH后早期CVS与机体释放入血的CA增多有关[2]。COMT是主要的CA分解代谢限速酶，广泛存在于人体内前脑、基底神经节、神经胶质细胞及边缘系统等各部位。在突触间隙，特别是突触后膜，COMT活性较高，在镁离子的催化下能将S-腺苷蛋氨酸提供的甲基转移到CA苯环的3位氧上，成为3-甲氧基4-羟基衍生物，进而使具生物活性或毒性的CA灭活[7]。因此，COMT是影响体内CA含量以及CVS严重程度的重要因素。

针对SAH后CVS的严重程度存在个体差异这一现象，我们推测：由于基因多态性的存在，在CVS发生后，部分患者COMT活性较低，对增多的CA的灭活能力较弱，因而CVS程度较重，持续时间较长，患者病情较重，预后较差；部分患者COMT活性较高，对增多的CA的灭活能力较强，因而CVS程度较轻，持续时间较短，患者病情较轻，预后较好。

研究表明，红细胞内COMT酶活性个体间差异很大，可以分成低度活性、中度活性、高度活性3种表型[8]。在人类COMT基因第4外显子存在1个G→A点突变，序列分析确认如果S-COMT的第108位的缬氨酸(Val)被甲硫氨酸(Met)取代，与此相对应MB-COMT的158位Val被Met取代，便可引起COMT热不稳定性改变，从而导致COMT活性改变。COMT的3种表型是由Val-COMT (高活性)和Met-COMT (低活性)两个等位基因所决定的，以共显性的方式遗传。前者使酶活性增高3～4倍，Val/Val基因型的酶具有高活性，Val/Met基因型的酶具有中度活性，而Met/Met基因型的酶活性低[9]。以上现象提示COMT基因具有多态性。另有研究发现，COMT基因多态性与帕金森病(PD)、精神分裂症和注意缺陷多动障碍遗传易患性之间存在相关性，提示此推测存在的可能性[10, 11, 12]。但迄今为止，COMT的基因多态性是否与SAH后早期CVS的严重程度有关尚未见相关报道。

本研究结果显示，A/A基因型患者CVS发生率明显高于G/G基因型患者(P=0.013 1)，A等位基因携带者CVS发生率明显高于G等位基因携带者(P=0.004 4)，这种相关性在单因素logistic回归中得到了证实。在调整了性别、年龄、血压、Hunt-Hess分级和Fisher分级后，用多元logistic回归分析发现，这种相关性同样存在。结果提示高活性COMT酶可更为有效地分解灭活CA，因而CVS程度较轻；而低活性COMT酶对增多的CA灭活能力较弱，因而CVS程度较重。

有学者把头颅Fisher分级法中的出血量与发生CVS的潜在危险性联系起来，认为可以帮助估计哪些患者在SAH后更容易发生CVS[13]。本研究显示，CT的Fisher分级中3~4级的患者发生CVS的比例(32/63，50.8%)虽明显高于1~2级的患者(38/104，36.5%)，但未显示出统计学意义(P=0.070 4)，单因素logistic分析亦未发现二者之间存在相关性，与文献报道不符。该结果印证了出血较多的患者CVS的程度不一定较重的临床现象，提示可能与基因多态性所致的个体差异有关，但同时也需要考虑到可能与样本量较少造成的统计学差异有关，尚待大样本量研究加以证实。

SAH的Hunt-Hess评分法也可预计CVS的严重程度，患者的评分分值越高，就越容易发生血管痉挛[14]。在本研究中，Hunt-Hess评级3~5级的患者发生CVS的比例(19/32,59.4%)高于Hunt-Hess评级1~2级的患者(51/135,37.8%)，差异具有统计学意义(P=0.022 6)，单因素logistic分析发现Hunt-Hess评级3~5级是CVS的危险因素之一，与文献报道相符。这提示CVS是造成患者病情危重的主要原因之一，换言之，只要患者病情较重，则往往提示患者发生CVS的机会较大。

需要特别注意的是，COMT仅为CA代谢通路中的其中1个限速酶，其在SAH后CA含量增高的发生机制中只能发挥部分作用，COMT基因多态性与CVS的相关性可能只是CVS个体差异中的重要因素，与CA代谢通路中的其他酶基因协同作用发挥其多态性作用。SAH患者CVS的个体差异应与CA代谢通路中的其他限速酶的基因多态性有关，这将是我们下一步研究的目标。

CVS是SAH后的主要并发症，已经有大量研究采用基因工程方法预防和治疗SAH后CVS。但目前临床实际工作中采取的治疗措施都是针对CVS的外部因素，而没有从患者个体差异的最根本原因——遗传学角度来进行预防和治疗。随着对CVS发生的危险因素和发生发展机制的认识不断深入以及基因技术的不断提高，临床上已经能够在短时间内检测各种基因类型并进行基因多态性分析，对SAH患者自然病程的危险性进行特别评估和预测。

4 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。

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