第二军医大学  2014, Vol. 35 Issue (1): 110-114   PDF    
引用本文
钱跹, 金柔男, 赵亮, 吕磊, 张海, 李悦悦, 张国庆. 高效液相色谱-紫外检测法同时测定染发剂中的20种染料成分[J]. 第二军医大学学报, 2014, 35(1): 110-114  
QIAN Xian, JIN Rou-nan, ZHAO Liang, LÜ Lei, ZHANG Hai, LI Yue-yue, ZHANG Guo-qing. HPLC-DAD for simultaneous determination of 20 colorants in hair dyes[J]. Academic Journal of Second Military Medical Universitya, 2014, 35(1): 110-114 (in Chinese with English abstract)  
高效液相色谱-紫外检测法同时测定染发剂中的20种染料成分
钱跹, 金柔男, 赵亮, 吕磊, 张海, 李悦悦, 张国庆    
第二军医大学东方肝胆外科医院药材科, 上海 200438
收稿日期:2013-7-10     接受日期: 2013-9-9.
作者简介：钱跹，硕士生.E-mail：cpuqianxian@163.com
通信作者(Corresponding author)：Tel: 021-81875571, E-mail:gqzhang@smmu.edu.cn.
摘要：目的 建立高效液相色谱（HPLC）-二极管阵列检测器（DAD）法测定染发剂中20种染料成分的含量，对《化妆品卫生规范》中的氧化型染料的HPLC检测方法进行改进和补充。 方法 样品经乙醇-水超声提取，过滤后进样检测。色谱柱：Agilent Zorbax Bonus-RP （4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相：A相为乙腈，B相为4 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.0，含0.1%的辛烷磺酸钠离子对试剂），梯度洗脱：0～24 min，10% A； 24～26 min，10%~40% A； 26～45 min，40% A； 45～47 min，40%~80% A； 47～52 min，保持80% A不变； 流速1 mL/min； 柱温15℃，使用DAD进行检测，检测波长为280 nm，进样量5 μL。 结果 各染料成分在50 min内基线分离。在10.0～500.0 mg/L浓度范围内，线性关系良好，相关系数均高于0.999。日内及日间精密度均小于4%，加样回收率为81.90%～119.88%。 结论 该方法简便、快速、准确，适于氧化型染发剂中染料成分的检测。
关键词： 高压效液相色谱法     染料     染发剂    
HPLC-DAD for simultaneous determination of 20 colorants in hair dyes
QIAN Xian, JIN Rou-nan, ZHAO Liang, LÜ Lei, ZHANG Hai, LI Yue-yue, ZHANG Guo-qing    
Department of Pharmacy, Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200438, China
Abstract: Objective To develop a high-performance liquid chromatography (HPLC)-diode array detector (DAD) method for determination of 20 colorants in hair dyes, so as to improve the method for determining oxidative hair dyes in Hygienic Standard for Cosmetics. Methods After ultrasonic extraction with ethanol-water, samples were analyzed by HPLC. The separation was achieved on an Agilent Zorbax Bonus-RP column (4.6 mm×250 mm,5 μm) using a gradient mobile phase system of A: acetonitrile and B: 4 mmol/L PBS (pH=6.0) containing 0.1% 1-octanesulfonic acid sodium salt solution at a flow rate of 1 mL/min. The gradient elution program was as follows: 0-24 min, 10% A; 24-26 min,10%-40% A; 26-45 min,40% A; 45-47 min,40%-80% A; 47-52 min,keep 80% A unchanged. The detection wavelength was set at 280 nm,the temperature of column was 15℃, and the injection volume was 5 μL. Results All the components were separated at baseline within 50 min. Within the concentration range of 10.0-500.0 mg/L, the peak areas and concentrations of colorants had good linear relationship, with the linear correlation coefficients being higher than 0.999. The intra-day and inter-day precisions were within 4% and the average recoveries ranged from 81.90% to 119.88%. Conclusion The present method is simple, rapid and accurate and is suitable for determination of colorants in oxidative hair dyes.
Key words: high pressure liquid chromatography     colorants     hair dyes    

近年来随着人们生活水平的不断提高,染发已成为常见的美容方式之一。城市中青少年彩色染发者逐年增多,中老年人群中染发者比例也呈上升趋势[ 1 ]。目前市售的染发剂有氧化型、直接型、金属盐类和天然植物型等类型,其中以氧化型染发剂为主。氧化型染发剂由氧化型染料和氧化剂组成,它具有染色效果好、色调变化宽、维持时间长等诸多优点[ 2 ]。氧化型染料多数属于芳香胺类化合物,对人体有一定的潜在危害性,因此也日益受到人们的关注。使用染发剂而引起的过敏反应非常普遍,长期使用还可能致突变、致敏、致癌、对神经行为功能及子代产生影响，因此国家2007版《化妆品卫生规范》中对暂时允许使用的93种染发剂中有关物质提出了限量标准,并对氢醌、 对氨基苯酚、邻苯二胺、间苯二酚、对苯二胺、甲苯2,5-二胺、对甲氨基苯酚、间氨基苯酚等染料成分提出了测定方法[ 3 ],而常用的邻氨基苯酚等染料目前尚未有国家标准检测方法。

目前测定氧化型染发剂中染料成分的常见方法主要有薄层色谱[ 4 ]、高效液相色谱(HPLC)[ 5,6,7 ]、高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)[ 8 ]、气相色谱[ 9 ]、气相色谱-质谱[ 10 ]、毛细管电泳[ 11 ]等。其中薄层色谱法前处理步骤复杂,定量的准确度和重现性较差; 毛细管电泳法上样量小,检出灵敏度相对较低; 质谱法运行成本高。HPLC法具有灵敏度高、准确性好、通用性强等特点,是目前最理想的检测染料的方法。本研究选择市场上使用频率较高的染料成分为研究对象,优化样品前处理方法,摸索色谱柱及流动相等液相条件,建立染发剂中20种染料成分的HPLC-二极管阵列检测器(DAD)检测方法。

1 材料 1.1 仪器

Agilent 1100 高效液相色谱仪,包括在线脱气机、四元泵、柱温箱、自动进样器和DAD(安捷伦公司,美国); pH计(Orion公司,美国); 0.45 μm 微孔滤膜。

1.2 试剂

对苯二胺(1,4-diaminobenzene)、4-氨基酚(4-aminophenol)、3-氨基酚(3-aminophenol)、2-氯-1,4-二氨基-苯-硫酸盐(2-chloro-1,4-diamino-benzol-sulfat)、间苯二酚(1,3-benzenediol)、2-硝基-1,4-苯二胺(2-nitro-1,4-penylenediamine)、3,4-二氨基甲苯(3,4-diaminoluene)、5-氨基-邻甲酚(5-amino-o-cresol)、2-甲基雷锁辛(2-methylresorcinol)、2-氨基-5-甲基苯酚(2-amino-5-methylphenol)、3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one)、4-N,N-二乙基-2-甲基-对次苯基-二胺(4-N,N-diethy-2-methyl-p-phenylene-diamine)、4-氨基-3-硝基苯酚(4-amino-3-nitophenol)、6-羟基吲哚(6-hydroxyindole)、4-氯间苯二酚(4-chlororesorcinol)、2,7-二羟基-萘(2,7-dihydroxy-naphthalene)、1,5-二羟基-萘(1,5-dihydroxy-naphthalene)、N-苯基-1,4-苯二胺(N-phenyl-1,4-phenylene-diamine)、邻氨基酚(2-aminophenol)、1-萘酚(1-naphthol)等20种染料标准品购于美国Sigma公司。乙腈、辛烷磺酸钠(色谱纯); 磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、亚硫酸钠、磷酸、95%乙醇(均为分析纯); 水为超纯水。样品染发剂A和B均为市售。

2 方法和结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 磷酸盐缓冲体系

称取十二水合磷酸氢二钠3.6 g、磷酸二氢钾4.2 g和辛烷磺酸钠1 g溶于1 L 水中混匀,配制成含0.1%辛烷磺酸钠的4 mmol/L 磷酸盐缓冲液,并用磷酸调节pH至6.0。用0.45 μm微孔滤膜过滤。

2.1.2 标准溶液的配制 称取各染料对照品约25 mg (精确至0.1 mg),按2 mg/mL浓度水平加入亚硫酸钠,并用95%乙醇-水(体积比为1∶1)混合溶液定容至2 mL,分别配成约12.5 mg/mL的染料单标储备液。以下几种物质在上述溶剂中的溶解性较差,需要采取不同的措施溶解: 2-氯-1,4-二氨基-苯-硫酸盐加入几滴10%氨水以增加其溶解性; 3,4-二氨基甲苯可直接用95%乙醇溶液定容; 2-硝基-1,4-苯二胺需将称样量减至12.5 mg,再用95%乙醇溶液定容,配成约6.25 mg/mL的单标储备液。各染料的单标储备液保存于4℃冰箱中,存储期限为2 d。

用移液管移取各单标储备液适量至10 mL容量瓶中,用95%乙醇稀释至浓度为10.0、25.0、50.0、100.0、200.0 和500.0 mg/L,作为混合标准溶液。

2.2 样品前处理

称取样品约0.25 g(精确至1 mg),用95%乙醇-水(体积比为1∶1)定容至5 mL,超声提取15 min,4 458×g离心10 min,上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤,待测。

2.3 色谱条件 色谱柱:Agilent Zorbax Bonus-RP柱(4.6 mm×250 mm,5 μm); 流动相:乙腈-4 mmol/L磷酸盐缓冲液 (pH 6.0,含0.1%的辛烷磺酸钠离子对试剂),A相为乙腈,B相为磷酸盐缓冲液。梯度洗脱:0~24 min,10% A; 24~26 min,10%~40% A; 26~45 min,40% A; 45~47 min,40%~80% A; 47~52 min,保持80% A不变。流速1 mL/min; 柱温15℃; 进样量5 μL; 检测波长280 nm。

2.4 方法学考察 2.4.1 系统适用性实验

分别配制空白溶剂、20种染料混合对照品溶液及样品溶液5 μL进样分析,根据各对照品和样品溶液色谱峰中各成分的保留时间和紫外吸收,可确定20种染料所对应的色谱峰,如图 1所示。

图 1 空白溶剂(A)、混合对照品溶液(B)及样品溶液(C)的HPLC图1: 对苯二胺; 2: 4-氨基酚; 3: 3-氨基酚; 4: 2-氯-1,4-二氨基-苯-硫酸盐; 5: 间苯二酚; 6: 2-硝基-1,4-苯二胺; 7: 3,4-二氨基甲苯; 8: 5-氨基-邻甲酚; 9: 2-甲基雷锁辛; 10: 2-氨基-5-甲基苯酚; 11: 3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮; 12: 4-N,N-二乙基-2-甲基-对次苯基-二胺; 13: 4-氨基-3-硝基苯酚; 14: 6-羟基吲哚; 15: 4-氯间苯二酚; 16: 2,7-二羟基-萘; 17: 1,5-二羟基-萘; 18: N-苯基-1,4-苯二胺; 19: 邻氨基酚; 20: 1-萘酚

2.4.2 标准曲线、线性范围和检测限

分别吸取2.1.2项下配制的6个浓度的混合对照品溶液5 μL,按2.3项下色谱条件进行HPLC分析,计算线性回归方程。结果表明,在10.0～500.0 mg/L质量浓度范围内,各染料成分的峰面积和浓度间具有良好的线性关系,相关系数均高于0.999。将标准溶液逐级稀释,计算信噪比(S/N); 以S/N=3为检测限, S/N=10 为定量限。结果见表 1。

表 1 20种染料成分的标准曲线、相关系数、检测限和定量限
2.4.3 精密度实验

将浓度为25.0、100.0和500.0 mg/L 混合标准溶液在1 d内分别连续进样6次,以及连续3 d分别进样,根据所得峰面积分别计算日内精密度和日间精密度。结果显示,20种染料成分日内及日间精密度RSD值均小于4%,表明该方法的精密度良好。

2.4.4 加样回收率

由于染发剂的空白样品难以得到,故实验中选择含染料种类少的样品扣除本底后作为基体样,分别加入25.0、100.0和500.0 mg/L 低、中、高3种浓度的混合标准溶液进行加样回收实验。结果显示,各染料成分的低浓度加样回收率为81.90%～115.08%,中浓度的加样回收率为91.29%～119.88%,高浓度的加样回收率为 88.25%～118.19%,基本满足分析要求。

2.4.5 稳定性考察

取制备的染发剂样品溶液,分别在0、2、4、6、8、12、24 h时测定20种染料的峰面积,考察稳定性。结果显示各成分峰面积RSD均小于2%,表明供试品溶液在24 h内保持稳定。

2.5 样品测定

市售2种染发剂按2.2项下方法平行处理5份,每份测定2次,计算含量，结果见表 2。两种染发剂均有含量标识,通过比较实测值和配方值之间的相对误差评价结果的准确度。所含成分的含量测定值和配方值基本符合,共检测出 4-氨基酚、3-氨基酚、2-氯-1,4-二氨基-苯-硫酸盐、间苯二酚、3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮、4-N,N-二乙基-2-甲基-对次苯基-二胺、4-氯间苯二酚等7种成分。对于商品包装上明确标出的“无对苯二胺”,在本研究中也未检测到该成分。

表 2 染发剂A及染发剂B染料成分及含量 n=5, ±s,wB/(mg·g-1)
3 讨 论 3.1 提取条件的选择

由于2-氯-1,4-二氨基-苯-硫酸盐等染料成分可能以盐的形式存在于样品中,为确保提取完全,本实验考察了不同比例乙醇-水作提取溶剂的提取效率,结果表明,采用95%乙醇-水(体积比为1∶1)能达到最佳提取效果,并能提高进样溶液和流动相的混合性。

3.2 色谱柱的选择

实验分别考察了6种类型3种规格的Agilent色谱柱,即 SB-C18柱(3.0 mm×100 mm,3.5 μm)、 Extend-C18柱(3.0 mm×100 mm,5 μm)、 Eclipse Plus Phenyl-Hexyl柱(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)、 Eclipse Plus-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、 SB-C18柱(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)以及 Zorbax Bonus-RP柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),结果显示后4个色谱柱较适用于本实验分离要求,但使用Eclipse Plus Phenyl-Hexyl柱(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)对苯二胺和4-氨基酚在同一位置出峰,提高乙腈比例虽然可以改善分离,但会影响其他成分分离效果; 使用Eclipse Plus-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm) 3,4-二氨基甲苯和2-甲基雷锁辛、邻氨基酚和1-萘酚分离度不够,同时3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮峰展宽严重,峰形还有待改善; 使用SB-C18柱(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)对苯二胺和4-氨基酚、2-氨基-5-甲基苯酚和3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮未能达到理想的分离效果,只有Zorbax Bonus-RP柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm)能够同时分离这20种染料成分,且峰形较好。

3.3 流动相的选择

在研究初期我们比较了甲醇-水和乙腈-水系统对分离的影响,结果表明乙腈-水系统更利于目标染料的分离。提高离子对试剂的烷基量有助于提高分离度[ 6,7 ],因此考察了庚烷磺酸钠和辛烷磺酸钠作为离子对试剂的效果。采用庚烷磺酸钠作离子对试剂时,4-氨基酚和3-氨基酚、2-氨基-5-甲基苯酚和4-N,N-二乙基-2-甲基-对次苯基-二胺、6-羟基吲哚和4-氯间苯二酚未完全分离,而辛烷磺酸钠能更有效地提高分离度。同时考察了流动相梯度、离子对试剂浓度、磷酸盐缓冲液浓度、pH值、柱温等条件对分离的影响,最终确定2.3项下色谱条件为最优。

3.4 检测波长的选择

根据紫外全扫光谱图,统计各染料成分特征吸收波长的分布情况。结果表明,20种染料成分在220～240 nm和270～310 nm处均有特征吸收,230 nm和280 nm均可选作检测波长。由于在230 nm低波长处干扰较多,对基线影响较大,因此本实验选择280 nm作为通用检测波长。

本实验建立了HPLC-DAD法同时测定染发剂中20种染料成分含量,并对该方法进行了系统的方法学验证。通过对实验条件的优化,确定色谱条件,在50 min内分离了20种目标化合物。方法的线性相关系数、加样回收率、相对标准偏差等各项参数表明,实验的灵敏度和精确度均满足实际样品检测需要。该检测方法简便、快速,较好地覆盖了目前染发产品中常用的染料成分,为染发剂的监督检测提供了一定的技术支持,是对《化妆品卫生规范》中的氧化型染料测定方法的有效修改和补充。

4 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。

参考文献
[1] Nohynek G J,Fautz R,Benech-Kieffer F,Toutain H.Toxicity and human health risk of hair dyes[J].Food Chem Toxicol,2004,42:517-543.
[2] 徐燕英,童 建.氧化型染发剂毒性研究进展[J].环境与职业医学,2004,21:403-404.
[3] 中华人民共和国卫生部.化妆品卫生规范[S].北京:卫生部,2007:237-238.
[4] Koh D,Tan C,Ng S K,Tan B T,Leow Y H,Goh C L.Screening for p-phenylenediamine (PPD) in hair-care products by thin-layer chromatography (TLC)[J].Contact Dermatitis,2000,43:182-183.
[5] 祝伟霞,王彩娟,杨冀州,魏 蔚,孙转莲,张书胜.高效液相色谱法同时测定染发剂中11种氨基苯酚[J].色谱,2012,30:870-875.
[6] Lai Y,Wang H,Dong Q,Chen H,Lin R,Cai Y.Simultaneous determination of 13 components in oxidative hair dyes by high-performance chromatography using an ion-pair reagent[J].J Cosmet Sci,2012,63:321-331.
[7] Penner N A,Nesterenko P N.Simultaneous determination of dihydroxybenzenes,aminophenols and phenylenediamines in hair dyes by high-performance liquid chromatography on hypercross-linked polystyrene[J].Analyst,2000,125:1249-1254.
[8] Eggenreich K,Golouch S,Töscher B,Beck H,Kuehnelt D,Wintersteiger R.Determination of 4-amino-m-cresol and 5-amino-o-cresol and metabolites in human keratinocytes (HaCaT) by high-performance liquid chromatography with DAD and MS detection[J].J Biochem Biophys Methods,2004,61:23-34.
[9] Schettgen T,Heinrich K,Kraus T,Gube M.Determination of 2,5-toluylenediamine (2,5-TDA) and aromatic amines in urine after personal application of hair dyes: kinetics and doses[J].Arch Toxicol,2011,85:127-133.
[10] Di Gioia M L,Leggio A,Le Pera A,Liguori A,Napoli A,Perri F,et al.Determination by gas chromatography/mass spectrometry of p-phenylenediamine in hair dyes after conversion to an imine derivative[J].J Chromatogr A,2005,1066:143-148.
[11] Masukawa Y.Separation and determination of basic dyes formulated in hair care products by capillary electrophoresis[J].J Chromatogr A,2006,1108:140-144.
[12] 周永贵,李真观.染发剂的致突变、致癌和毒代动力学的研究进展[J].环境与职业医学,2008,25:103-104.