2020, Vol. 37 
2. 中国科学院大学, 北京 100049
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)是继X射线检测之后最重要的成像方法之一，自从二十世纪八十年代被引入临床应用之后，它一直在诊断医学和基础研究中发挥着无与伦比的作用[1-3].功能磁共振成像(Functional MRI，fMRI)技术在在体研究脑功能活动中发挥着重要的作用，血氧水平依赖的fMRI(Blood Oxygenation Level Dependent-fMRI，BOLD-fMRI)虽已被广泛研究和应用长达20多年，但引起其信号改变的基本神经机理仍未研究清楚.fMRI在应用中一个重要的不足之处是：由于基于脑区血液动力学改变，它是间接检测神经元簇的空间特异性和时间反应性活动的替代性信号[1].锰增强磁共振成像(Manganese-Enhanced MRI，MEMRI)在fMRI上应用越来越广泛，与标准的BOLD-fMRI相比，MEMRI并不是测量基于血液动力学改变的信号，而是直接测量与细胞去极化相关的信号；同时较高的在体纵向弛豫使其在检测脑活动时，可达到较高的灵敏度.MEMRI是基于二价锰离子(Mn2+)作为钙离子生物类似物的成像方法，即Mn2+作为第二信使可通过L型电压门控或配体门控通道进入中枢神经系统的可兴奋性神经元，从而在功能活动增强脑区逐渐累积，并通过MEMRI方法检测出来.MEMRI利用Mn2+作为弛豫对比剂的特性，以及Mn2+能够通过L型电压门控通道进入中枢神经系统、心脏、肝脏、胰腺等生物系统特性，能特异性地检测生物系统的功能活动变化.
根据Mn2+应用类别特点可将MEMRI的影像学应用进行分类，利用Mn2+作为MRI对比剂的主要影像学应用[4]有：1、Mn2+全身给药能作用于感兴趣区(Region of Interest，ROI)的组织或器官以增强对比，通过MEMRI可显示区域特异性增强的脑组织结构，因此MEMRI可应用于脑功能成像；2、Mn2+沿着中枢神经系统(脑和脊髓)的神经元之间通路移动和转运，从而使得Mn2+可作为一种MRI可检测的神经元示踪剂；3、由于Mn2+可进入兴奋性神经元，因此，能作为脑、心脏和胰脏的功能活动的标记物.使用Mn2+作为功能活动标记物，主要优点是图像对比直接以活动依赖模式与兴奋性神经元的Mn2+累积相关.因此，相比与功能性血液动力学改变作为神经元活动增强标记物的fMRI技术，活动诱导的锰依赖的MRI(Activity-Induced Manganese-Dependent-MRI，AIM-MRI)更能直接反映神经元活动、并更好地显示空间定位.Dudek等[5]使用MEMRI测量了乙醇偏爱的AA(Alko alcohol)大鼠长时程乙醇自饮之后，脑功能活动改变情况，发现长时程乙醇给予之后，大鼠脑皮层和亚皮层区域功能活动增加，这些区域主要包括：中脑皮层边缘系统和黑质纹状体多巴胺系统以及它们的传入纤维.Yu等[6]发展了一种MEMRI方法来揭示正常行为小鼠声音诱发的全脑范围内功能活动变化，并使用MEMRI方法显示了下丘脑的音频拓扑结构，结果表明MEMRI可作为一种敏感和有效的方法来揭示小鼠听觉相关的脑区功能活动，并可作为正常、手术和特定转基因小鼠功能影像研究较好的手段.另外，MEMRI还可作为一种有用的和非侵入的方法来精确地测量2, 5-二甲氧基-4-碘苯丙胺(2, 5-dimethoxy-4-iodoamphetamine，DOI)诱导的正常觉醒行为的精神分裂症小鼠脑功能活动变化[7].
先前已有研究使用MEMRI方法来探究嗅觉系统[8]，Lehallier等[9]使用MEMRI来揭示狐狸排泄物气味和巧克力气味诱发初级嗅皮层功能活动变化的差异；Gutman等[10]使用MEMRI和弥散张量成像(Diffusion Tensor Imaging，DTI)方法清楚显示了嗅球与杏仁核、梨状皮层、尾壳核等脑区的神经通路；而方可等[11]用MEMRI技术揭示了嗅上皮到嗅球的神经功能投射，且发现了嗅觉信息是从嗅球层状结构的外层向内层传递.但这类MEMRI模式用于嗅觉系统研究，是通过鼻腔给予MnCl2来实现的，并未通过全身给药方式来研究气味刺激诱发的全脑功能活动变化.Chen等[12]使用了无气味空气、觉醒相关(柠檬)和恐惧相关[三甲基噻唑啉(Trimethylthiazoline，TMT)]气味，并利用MEMRI方法来评定认知和情绪关联的神经环路.研究结果显示，对于先前未暴露于任何气味刺激的动物，当暴露于柠檬气味之后，在下丘脑和海马区有显著的激活；而当暴露于TMT之后，在下丘脑和杏仁核有显著的激活.从而表明MEMRI在探究与认知和情绪相关的神经环路上具有有效性.Chen等研究的模式若用于嗅觉脑功能研究，存在问题在于：1、使用挥发性柠檬油复合物而非单体吸入，产生的脑区功能活动变化不具有特异性；2、使用股静脉给予MnCl2，并且使用甘露醇增加血脑屏障通透性，但这种通透性增加可能并不是全脑统一性的，从而导致获得了不完整的锰增强脑功能活动图[4]，其柠檬气味暴露时间仅为18 min，且在MnCl2开始注射之后45~50 min就进行MEMRI扫描，因此不利于Mn2+在气味诱导条件下全脑范围内长时程统一性累积；3、Chen等的研究柠檬油吸入仅观察了在不同统计阈值下Mn2+的累积程度，并未将吸入柠檬油复合物组与无气味空气组进行基于体素的比较.
本文利用MEMRI探究了长时程吸入挥发性气味单体诱导的脑功能活动变化.由于吸入诸如挥发性柠檬油等含有多种单体的复合物，其对大脑功能活动改变产生影响机理较难解释；柠檬醛(3, 7-二甲基-2, 6-辛二烯醛)为柠檬油的基本组成成分之一，是一种易反应、挥发性的，-不饱和醛类[13]，而且有关单体成分柠檬醛、柠檬烯吸入后作用于大脑功能活动的研究较少，因此本研究利用MEMRI方法来探究大鼠长时程吸入挥发性柠檬醛之后脑功能活动变化情况.
1 实验部分 1.1 实验动物嗅觉吸入柠檬醛(国药集团化学试剂有限公司，纯度95%)实验中，选用雄性SD(Sprague-Dauley)大鼠，体重范围300~400 g(购自湖南斯莱克景达实验动物中心).实验分为嗅觉吸入柠檬醛组(n=6)和吸入无气味空气组(n=7)，大鼠随机分笼饲养，自由获取食物和水，环境温度保持在(24±1)℃，昼夜循环定在7:00 am/7:00 pm，所有实验流程和动物使用规范均按照国家实验室动物使用和管理条例来执行(武汉物理与数学研究所动物实验许可证编号：SYXK(鄂)2015-0051)，且获得中国科学院武汉物理与数学研究所实验动物审查委员会通过.为减少对实验动物的伤害，实验动物使用数量尽可能减至最小.
1.2 嗅觉吸入装置嗅觉吸入装置[14, 15](图 1)主要包括：一个产生无气味空气的泵[图 1(a)]、空气流量计(控制装置流通气体流速为1 L/min)[图 1(b)]、锥形瓶(内装柠檬醛与矿物油的混合溶液或纯的矿物油)和加热板(对锥形瓶底部进行加热，温度保持在100 ℃)[图 1(c)]、密闭的长方体大鼠饲养盒(48×35×30 cm3，有一个气体入口和一个气体出口)[图 1(d)]，以及连接各装置的硅胶管.柠檬醛与矿物油混合溶液由按1 mL柠檬醛单体溶于100 mL矿物油的比例配制，大鼠吸入前将其震荡混匀；而无气味空气组仅用纯的矿物油.
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图 1 嗅觉吸入装置示意图. (a)空气泵；(b)空气流量计；(c)锥形瓶和加热板；(d)饲养盒 Fig. 1 The schematic diagram of olfactory inhalation instrument. (a) Air pump; (b) Air flowmeter; (c) Conical flask and heating plate; (d) Feeding box |
将MnCl2·4H2O溶解于生理盐水形成120 mmol/L的溶液，SD大鼠在饲养环境中适应一周后.吸入气体之前，以40 mg/kg剂量腹腔注射上述MnCl2溶液[16, 17]，分别置于柠檬醛或无气味空气环境内直到MEMRI实验.MnCl2注射24 h之后，分别对两组大鼠进行MEMRI扫描.
所有的MEMRI扫描在Bruker 7T/20 cm成像仪上进行，用于射频脉冲激发的体线圈直径72 mm，而用于信号接收的正交表面线圈直径为40 mm.大鼠进行MRI扫描之前使用含4%异氟烷的氧气进行麻醉，并使用牙杆和耳杆将其固定在动物床上.MRI实验进行时，使用2%的异氟烷维持大鼠的麻醉状态，并使用37 ℃循环水系统维持大鼠体温.T1-加权像采集使用三维快速小角度激发(Fast Low Angle Shot-array，FLASH-array)序列，重复时间为38.5 ms，回波时间为5.5 ms，脉冲激发角度为30˚，视野为30×30×30 mm3，矩阵大小为256×256×64，累加次数为8，图像空间分辨率为0.117 2×0.117 2 mm2.
1.4 MEMRI数据处理两组MEMRI图像分别使用基于体素和基于ROI的方法进行分析.
1.4.1 基于体素分析基于体素分析方法的过程为：两组FLASH图像原始数据通过Matlab转变为img格式，然后通过MRIcro软件手动去头颅.去颅骨磁共振图像被切去外周多余部分以形成合适的大小，以防止在数据处理过程中占取内存较大.通过MRIcro软件将各向异性图像转变为各向同性图像，并使用SPM(Statistical Parametric Mapping)软件来处理图像，主要步骤有：1、通过MRIcro软件将各向异性图像转变为各向同性图像；2、从两组磁共振图像中选择一个图像位置较为端正的个体，作为初始模板，并将所有的原始各向同性T1-加权像与初始模板进行配准；3、将所有第一次配准之后的图像通过SPM加和平均之后，形成一个平均模板；4、将两组原始的各向同性T1-加权像与平均模板配准，得到二次配准图像；5、对二次配准之后的图像进行场不均一性校正；6、将校正之后两组图像，在Matlab函数下进行全脑信号归一化；7、对归一化之后的两组图像进行半峰全宽(Full Width Half Maximum，FWHM)高斯核空间平滑，平滑参数设为2~3倍体素；8、对平滑之后的两组图像进行双因素T检验分析，得到T值的T-maps图.基于体素分析方法分析吸入柠檬醛组和无气味空气组大鼠图像，观察了在p < 0.01统计力度下T-maps图相应脑区功能活动的变化.T-maps图最小观察体素为10个体素.
1.4.2 基于ROI分析基于ROI的分析方法过程为：首先在ParaVision软件下将关注的ROIs：脑片左侧和右侧的伏隔核中心部(Accumbens Nucleus Core，AcbC)、嗅小球层(Glomerular Layer，GL)手动画取，之后将每个ROI的信号强度值平均到肌肉组织的信号强度值，形成标准化的信号强度(Normalized Signal Intensity，NSI)值.
1.4.3 统计分析在基于ROI分析中，对4个ROIs的NSI值采用单因素方差分析，并用均值±标准误表示；对基于体素分析中显示的9个脑区：AcbC、尾壳核(Caudate Putamen，CPu)、次级运动皮层(Secondary Motor Cortex，M2)、前联合皮层(Frontal Assocn Cortex，FrA)、GL、视皮层(Visual Cortex，VC)、听觉皮层(Auditory Cortex，AC)、压后皮层(Retrosplenial Cortex，RSC)和眶内皮层(Medial Orbital Cortex，MO)在基于ROI分析之后产生的NSI值(NSI原始数据可email作者索取)进行Pearson相关性分析，得到相关系数r，并以相关系数矩阵形式表现出来.统计差异p < 0.05有统计学意义.
2 结果与讨论 2.1 基于体素分析显示柠檬醛诱导的大鼠脑功能活动变化由于MnCl2在腹腔注射24 h之后，Mn2+才逐渐扩散至全脑.因此选用MnCl2注射之后，立即将两组大鼠至嗅觉吸入环境之中，分别吸入挥发性柠檬醛单体和无气味的空气，这样气味单体吸入之后引起脑功能活动改变，会由于Mn2+在功能活动脑区的逐渐累积，引起柠檬醛组和对照组之间对比的显著差异.基于体素分析结果(图 2)显示，与吸入无气味空气组相比，大鼠吸入柠檬醛24 h之后，AcbC、CPu、M2、FrA和GL脑区功能活动增强；而VC、AC、RSC和MO脑区Mn2+累积程度降低.
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图 2 基于体素分析显示柠檬醛嗅觉吸入诱导脑功能活动改变.每个脑片下的数字代表该脑片距离前囟点的位置(单位：mm)，标尺的数字坐标代表T-map图的T值范围 Fig. 2 The functional brain activation changes after citral olfactory inhalation demonstrated by voxel-based analyses. The number under each section indicates the position from bregma to the section in millimeters. The numbers of the bar indicate the range of T values of T-maps |
通过对ROI手动画取(图 3)之后，基于ROI分析结果(图 4)显示，与吸入无气味空气组相比，吸入柠檬醛24 h之后，大鼠图谱对应的大脑左侧脑区，AcbC [图 4(a)]的NSI值并无显著变化(p > 0.05)，GL [图 4(c)]的NSI值有所增加(p=0.064)；大鼠图谱对应的右侧脑区，AcbC [图 4(b)]的NSI值有显著增加(p < 0.05)，GL [图 4(d)]的NSI值亦有所增加(p=0.060).上述基于体素和ROI分析的结果，与Chen等[12]使用MEMRI研究嗅觉吸入挥发性柠檬油之后产生嗅球、运动皮层等脑区Mn2+累积程度增多的结果相一致.
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图 3 基于ROI分析的感兴趣脑区.每个脑片下的数字代表该脑片距离前囟点的位置(单位：mm) Fig. 3 ROIs analyzed by the ROI-based approach. The number under each section indicates the position from bregma to the section in millimeters |
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图 4 基于ROI分析显示柠檬醛嗅觉吸入诱导脑功能活动改变.(a)脑片左侧伏隔核中心部(AcbC)；(b)脑片右侧伏隔核中心部(AcbC)；(c)脑片左侧嗅小球层(GL)；(d)脑片右侧嗅小球层(GL) Fig. 4 The functional brain activation changes after citral olfactory inhalation demonstrated by ROI-based analyses. (a) AcbC in the left part of the brain sections; (b) AcbC in the right part of the brain sections; (c) GL in the left part of the brain sections; (d) GL in the right part of the brain sections |
大鼠吸入挥发性柠檬醛之后，GL、AcbC等脑区功能活动增强，AC、VC、RSC等脑区Mn2+锰累积相对显著减少.为了表明在吸入柠檬醛之后这些脑区活动存在功能相关性[18]，对9个基于体素分析的相关脑区的NSI值进行Pearson相关性分析.相关系数矩阵(图 5)和统计结果显示：吸入柠檬醛组大鼠左侧脑区GL与RSC(r=0.956，p < 0.01)，VC(r=0.967，p < 0.01)，AC(r=0.936，p < 0.01)，AcbC(r=0.855，p < 0.05)，CPu(r=0.853，p < 0.05)，M2(r=0.941，p < 0.01)，MO(r=0.874，p < 0.05)，FrA(r=0.991，p < 0.001)存在显著的相关[图 5(a)]；吸入柠檬醛组大鼠右侧脑区GL与RSC(r=0.954，p < 0.01)，VC(r=0.925，p < 0.01)，AC(r=0.888，p < 0.05)，AcbC(r=0.851，p < 0.05)，M2(r=0.934，p < 0.01)，MO(r=0.854，p < 0.05)，FrA(r=0.979，p < 0.01)亦存在显著的相关[图 5(b)]；而吸入无气味空气组大鼠左侧脑区GL仅与FrA(r=0.776，p < 0.05)存在显著的相关[图 5(c)]；吸入无气味空气组大鼠右侧脑区GL与其它8个脑区都不存在显著的相关(p > 0.05)[图 5(d)].上述结果表明，大鼠长时程吸入挥发性柠檬醛，是通过嗅觉通路产生的脑功能活动变化，且GL与其他脑区功能相关性显著增强.
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图 5 基于体素分析的9个脑区NSI的相关系数矩阵.(a)柠檬醛组大鼠左侧脑区；(b)柠檬醛组大鼠右侧脑区；(c)无气味空气组大鼠左侧脑区；(d)无气味空气组大鼠右侧脑区.色块图的数值代表Pearson相关系数值r Fig. 5 The correlation matrices of NSI values in 9 brain regions by voxel-based analyses. (a) The left part of the brain in citral group; (b) The right part of the brain in citral group; (c) The left part of the brain in odorless air group; (d) The right part of the brain in odorless air group. The numbers of colorbar indicate the r values of Pearson correlation coefficients |
通过嗅觉吸入挥发性柠檬醛单体研究发现：1、尽管长时程嗅觉吸入柠檬醛可能会产生嗅觉习惯化，从而影响影像结果，然而MEMRI研究Mn2+累积产生的脑功能活动，且此模式下吸入柠檬醛之后GL与关联的脑区功能相关性显著增强，并未受嗅觉习惯化显著影响.因此本研究的嗅觉MEMRI模式依然可认为是研究长时程吸入柠檬醛单体有效的和敏感的方法；2、与先前的研究比较发现，分别通过嗅觉吸入挥发性柠檬醛和柠檬油所产生的脑功能活动变化是存在差异性的：Chen等的研究显示，在吸入无气味空气之后，在嗅球、丘脑、海马、杏仁核和皮层区域出现了Mn2+累积；与吸入无气味空气组相比，当吸入柠檬气味之后海马和下丘脑区域锰的信号强度表现出显著的增强.在不同阈值下Mn2+累积图显示，在最严格的阈值下，嗅球出现了显著的Mn2+累积；在次严格阈值下，海马和广泛分布的皮层区域出现了显著的Mn2+累积；在最宽松的阈值条件下，柠檬气味吸入之后在大鼠脑室、杏仁核、丘脑和下丘脑区域展现了有意义水平的Mn2+累积[12].而本研究显示，与吸入无气味空气组相比，吸入柠檬醛组大鼠的AcbC等脑区活动增强，而AC、VC、RSC等脑区Mn2+累积程度有显著地减少，这在Chen等研究吸入挥发性柠檬油中并未显现.3、吸入柠檬醛之后，大鼠GL与其他脑区功能相关性显著增强；从而表明，吸入柠檬醛之后，气味单体通过GL影响了相关脑区的功能活动变化，也进一步证明了长时程吸入柠檬醛之后产生的脑功能活动变化可通过本研究的MEMRI模式来揭示.
2.4.2 柠檬醛通过嗅觉通路影响脑功能活动挥发性气味物质主要通过三种途径影响动物体征[14]：1、气味分子通过鼻粘膜或呼吸道粘膜皮肤吸收，或刺激支气管和肺粘膜上的化学受体；2、气味分子能直接进入循环的血液系统，并且能通过血脑屏障进入脑内，之后影响脑内相关受体位点；3、气味分子与嗅球神经元上气味受体部位结合，通过嗅觉通路作用于大脑.气味分子到达鼻腔与鼻腔粘膜上皮细胞的嗅觉受体神经元(Olfactory Receptor Neurons，ORNs)的感觉末端相接触，在啮齿类动物中，每个ORN能表达1 000个可能受体中的一种受体亚型.即一种特殊的气味分子可能仅对一种特异性的受体亚型具有高度亲和性.但是一种气味分子单体能结合到多种受体亚型，并且一种受体亚型能结合不同气味分子单体，受体亚型能自由地分布到嗅上皮，并且没有任何可区分的拓扑结构.ORN轴突投射到嗅球的GL，每个嗅小球接收来自于表达同样类别嗅觉受体的ORN的轴突传入.在每个嗅小球内，ORN轴突与僧帽细胞和簇细胞形成兴奋性突触连接[19, 20].因此经过挥发性柠檬醛单体长时程刺激，Mn2+在GL逐渐累积，相比于吸入无气味空气组，柠檬醛组大鼠在GL表现出功能活动显著增强.僧帽细胞和簇细胞的传出纤维经过侧嗅束(Lateral Olfactory Tract，LOT)，到达初级嗅皮层.初级嗅皮层主要包括嗅前核、嗅结节(Olfactory Tubercle，OT)、梨状皮层、杏仁核和吻侧内嗅皮层.初级嗅皮层的传出信息投射至眶额皮层、无颗粒岛叶皮层、下丘脑、外侧和基底外侧杏仁核、外嗅皮层、海马和纹状体等与情感、学习记忆相关的气味传入系统，另外还包括边缘和旁边缘皮层，这些脑区统称为次级嗅觉皮层[19].因此气味感知在调节动物对于情绪和觉醒事件的生理和行为反映上具有重要性.同时，OT与伏隔核都是腹侧纹状体一部分，腹侧纹状体被认为涉及了奖赏和恐惧动机行为的诱导，OT的传出神经元投射至腹侧苍白球(Ventral Pallidum，VP)，其神经元投射轴突至腹侧被盖核(Ventral Tegmental Area，VTA)多巴胺能神经元，形成突触连接.因此，来自OT处气味信息处理模式表现出了影响多巴胺环路的奖赏性期待[20].从而提示，AcbC在吸入柠檬醛之后功能活动增强，可能是由于气味分子通过OT通路影响多巴胺环路来作用于AcbC.
伏隔核是一个涉及许多奖赏关联行为的重要脑部区域，其包括伏隔核壳部(Accumbens Nucleus Shell，AcbSh)和中心部(AcbC).GABA能中型多棘神经元(Medium Spiny Neurons，MSNs)组成了AcbC和AcbSh的传出神经元.AcbC传出结构和功能类似于纹状体.AcbC按照MSNs的投射位点可分为两个不同亚区：含有的MSNs投射至VTA的亚区，差异性调节D1型多巴胺受体，其组成了直接的纹状体黑质通路来调节起始运动和行为；AcbC的MSNs支配VP的亚区，差异性调节D2型多巴胺受体，其形成了间接的纹状体苍白球通路来抑制竞争性活动[21, 22].尽管伏隔核与视觉处理区域之间的解剖连接先前研究并未清楚阐明，但有研究表明，奖赏反应脑区与视觉激活区域之间存在功能连接[23].在视觉策略处理中，奖赏增强了视觉系统包括枕叶皮层的活动，从而提示奖赏可能调节着感觉的信息处理.另有研究显示，伏隔核与AC相互作用可预测音乐奖赏值，在听觉条件需求值下，AC、杏仁核和腹内侧额叶区显示了增强的功能活动，并可通过增强这些脑区与伏隔核之间的功能连接来预测奖赏值[24].因此吸入柠檬醛之后，大鼠VC和AC等脑区Mn2+累积程度显著降低，可能与AcbC的GABA能MSNs对其突触后神经元的抑制性作用相关，但其具体机制仍需进一步研究.
3 结论本研究使用MEMRI方法来观察长时程嗅觉吸入柠檬油的单体成分之一，即挥发性的柠檬醛之后，大鼠脑功能活动变化情况.研究显示，大鼠吸入挥发性柠檬醛之后，GL、AcbC等脑区功能活动增强，而AC、VC、RSC等脑区Mn2+累积相对显著减少；且脑区相关性分析显示，GL与相应脑区功能相关性显著增强.结合先前研究表明，MEMRI是一种可用于揭示长时程嗅觉吸入挥发性气体引起脑功能活动变化的成像方法.
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