PAMAM树状大分子与5-氟尿嘧啶相互作用的NMR研究

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宁彩芳, 马敏珺, 郭朝晖, 等. PAMAM树状大分子与5-氟尿嘧啶相互作用的NMR研究[J]. 波谱学杂志, 2019, 36(4): 555-562. DOI: 10.11938/cjmr20192743.

NING Cai-fang, MA Min-jun, GUO Zhao-hui, et al. Interactions Between 5-Fluorouracil and PAMAM Dendrimers Studies by NMR Spectroscopy[J]. Chinese Journal of Magnetic Resonance, 2019, 36(4): 555-562. DOI: 10.11938/cjmr20192743.

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基金项目

国家自然科学基金资助项目（U1710106，U1810111）

通讯联系人

乔岩, Tel: +86 351 4040090, E-mail: qiaoy@sxicc.ac.cn
王英雄, Tel: +86 351 4049501, E-mail: wangyx@sxicc.ac.cn

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收稿日期：2019-04-26
在线发表日期：2019-05-30

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PAMAM树状大分子与5-氟尿嘧啶相互作用的NMR研究

宁彩芳 ^1,2, 马敏珺 ^1,2, 郭朝晖 ^1,2, 张书怀 ^1,2, 乔岩 ^1,2, 王英雄 ^1,2

1. 中国科学院山西煤炭化学研究所, 山西太原 030001;
2. 中国科学院大学材料与光电研究中心, 北京 100049

收稿日期：2019-04-26; 在线发表日期：2019-05-30

基金项目：国家自然科学基金资助项目（U1710106，U1810111）

通讯联系人(Corresponding author)：乔岩, Tel: +86 351 4040090, E-mail: qiaoy@sxicc.ac.cn
王英雄, Tel: +86 351 4049501, E-mail: wangyx@sxicc.ac.cn

摘要: 本文利用多种核磁共振（NMR）技术研究了聚酰胺-胺树状大分子（PAMAM）与5-氟尿嘧啶（5-FU）在水溶液中的相互作用.¹H NMR化学位移滴定结果表明5-FU分子结合在PAMAM分子表面，¹³C NMR化学位移滴定分析结果表明5-FU分子通过氢键或疏水间相互作用进入到PAMAM的内部疏水空腔.¹H核和¹⁹F核自旋-晶格弛豫时间（T₁）的测定结果也说明了二者之间存在相互作用.NOESY实验进一步验证了5-FU分子进入到PAMAM分子的内部空腔.本研究为研究树状大分子和药物小分子的相互作用提供了系统的NMR分析方法.

关键词: 液体核磁共振相互作用树状大分子PAMAM 5-氟尿嘧啶

Interactions Between 5-Fluorouracil and PAMAM Dendrimers Studies by NMR Spectroscopy

NING Cai-fang ^1,2, MA Min-jun ^1,2, GUO Zhao-hui ^1,2, ZHANG Shu-huai ^1,2, QIAO Yan ^1,2, WANG Ying-xiong ^1,2

1. Institute of Coal Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Taiyuan 030001, China;
2. Center of Materials Science and Optoelectronics Engineering, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Abstract: Interactions between 5-fluorouracil (5-FU) and PAMAM in D₂O solution were studied by NMR spectroscopy. The results of ¹H NMR chemical shift titration experiments demonstrated that 5-FU molecules bonded to the surface of PAMAM, and the results of ¹³C NMR chemical shift titrations experiments disclosed that hydrogen-bond interactions and/or hydrophobic interaction ins existed in the interior pockets of PAMAM and 5-FU. These results were further supported by ¹H and ¹⁹F relaxation time measurements. The NOESY experiment was used to confirm the presence of 5-FU encapsulation in the PAMAM-5-FU complexes. This study provides a methodology for studying the interactions between dendrimers and drug molecules.

Key words: liquid-state NMR interaction PAMAM dendrimers 5-fluorouracil

引言

聚酰胺-胺树状大分子（PAMAM）聚合物含有大量的表面活性官能团和非极性的内部疏水结构，几何对称性很高，而且分子质量及纳米尺寸相对可控^[1-4].作为一类新型的主体分子，PAMAM与多种客体小分子之间的相互作用已被广泛研究，例如PAMAM可作为缓释药物的载体、高效催化剂、信息存储材料、纳米材料^[5-9].而且，树状大分子也是生物医学领域研究最广泛的合成类高分子之一，特别是用作抗癌药物的载体^[10-12].5-氟尿嘧啶（5-FU）是一种嘧啶类似物，具有较低的水溶性和疏水性，其在中性介质中最稳定的互变异构体是二酮式结构^{[13, 14]}.5-FU是最具有抗代谢物和免疫抑制性活性的抗癌药物之一，可抑制DNA在恶性细胞中的快速合成，现已广泛应用于治疗消化道、胸部及头颈部等部位的恶性肿瘤^[15-17].然而，5-FU因具有半衰期短、对全身正常细胞毒性较大且分布很广泛等特点，常被限制使用^{[15, 18]}.如果利用常被用作临床药物载体^[19]的树状大分子所具备的低毒性和纳米尺寸的特点，使其与5-FU相互作用，从而延长5-FU的药效时间、减少5-FU对人体造成的危害，是十分有意义的.

目前，G3代、G4代和G5代的PAMAM对5-FU的包合量已通过紫外分光光度法、平衡透析法、量热滴定等方法进行了测定研究，并分析了不同树状大分子末端基团的性质以及空间位阻结构、活性位点等对5-FU的结合量的影响^{[7, 20-23]}.然而，关于PAMAM与5-FU分子二者之间的相互作用机制、相互作用位点等信息尚不清楚.

核磁共振（NMR）技术作为一种多维、多核、对样品无破坏的分析方法^{[5, 24]}，在识别主客体相互作用的研究方面可以提供大量有效的信息，如分子的聚集态、离子对和化学环境变化等^{[25, 26]}.本文利用一维¹H NMR、¹³C NMR、¹⁹F NMR化学位移滴定及二维¹H-¹³C HSQC谱图系统地揭示了PAMAM和5-FU之间的相互作用机制及作用位点.并通过测定5-FU分子的¹H核和¹⁹F核的弛豫时间及二者相互作用后混合溶液的¹H-¹H NOESY谱图进一步证明了5-FU与PAMAM之间的相互作用机制.

1 实验部分 1.1 仪器与试剂

实验所用仪器为配备5 mm PABBO BB/¹⁹F-¹H/D变温探头的带有梯度场的Bruker AV-Ⅲ 400 MHz液体NMR谱仪.

5-FU（C₄H₃FN₂O₂，质量分数 > 99%）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，G3代PAMAM树状大分子（C₃₀₂H₆₀₈N₁₂₂O₆₀）购于山东威海晨源分子新材料有限公司.重水（D₂O，99.8 atom% D）购于百灵威科技有限公司.

1.2 样品准备

将浓度为7.24×10^﹣⁴ mol/L的G3代PAMAM树状大分子重水溶液作为储备溶液使用.分别向400 μL的上述储备溶液中加入不同重量的5-FU粉末，配制成一系列不同摩尔比（n_5-FU:n_PAMAM=0:1, 8:1, 16:1, 24:1, 32:1, 48:1, 64:1, 1:0）的待测样品，25 ℃条件下磁力搅拌反应48 h.

1.3 NMR实验 1.3.1 一维¹H、¹⁹F和¹³C NMR化学位移滴定实验

¹H、¹⁹F和¹³C核的工作频率分别为400.13、376.50和100.62 MHz，谱宽分别为8 012.82、89 285.71和24 038.46 Hz.实验温度为25 ℃.均采用标准脉冲程序.

1.3.2 二维¹H-¹³C HSQC和¹H-¹H NOESY实验

二维梯度场¹H-¹³C HSQC及¹H-¹H NOESY实验温度为25 ℃.HSQC的F₂（¹H）和F₁（¹³C）维谱宽分别为4 795.40和16 668.48 Hz，采样数据点阵t₂×t₁=2 048×256，累加次数为8.NOESY的F₂（¹H）和F₁（¹H）维谱宽分别为2 673.80 Hz和3 654.97 Hz，采样数据点阵t₂×t₁=2 048×256，累加次数为8，混合时间为300 ms.均采用标准脉冲程序.

1.3.3 ¹H核和¹⁹F核弛豫时间的测定

自旋-晶格弛豫时间（T₁）的测定脉冲序列为t1ir.实验温度为25 ℃，5-FU的¹⁹F核的T₁测定实验的谱宽为11 312.22 Hz，弛豫延迟值在n_5-FU:n_PAMAM=1:0和1:6两个摩尔比例下分别为30 s和20 s，中心频率为﹣64 017.52 Hz，采样数据点阵t₂×t₁=16 384×16.¹H核的T₁测定实验的谱宽为4 000.00 Hz，弛豫延迟值为35 s，中心频率为2 470.97 Hz，采样数据点阵t₂×t₁= 32 768×16.T₁值的拟合用Topspin 3.1软件.

2 结果与讨论 2.1 ¹H NMR化学位移滴定

本文利用¹H NMR技术研究主客体体系PAMAM与5-FU分子之间的相互作用.PAMAM和5-FU的结构及原子标记如图 1所示.

图 1 分子的化学结构和原子标记. (a) 5-FU分子；(b) G3 PAMAM分子的内部重复单元；(c) G3 PAMAM分子最外层结构；(d) G3 PAMAM分子 Fig. 1 The chemical structure and atom labeling of (a) 5-FU molecule, (b) G3 PAMAM interior repetitive unit, (c) G3 PAMAM outermost layer, and (d) G3 PAMAM molecule

图 1显示，PAMAM一共应包含六种¹H NMR信号，分别对应于其内部结构的四种CH₂质子（a、b、c、d）和最外层的两种CH₂质子（b′、d′）.根据之前的研究报道^[27]，对PAMAM的内部质子归属如下：H-a，δ_H 2.30；H-b，δ_H 2.50；H-c，δ_H 2.69；H-d，δ_H 3.16.由于PAMAM最外层的H-b′、H-d′分别与H-c、H-d的信号在¹H NMR谱图中重叠，因此当溶液中只存在PAMAM时，其¹H NMR谱图中只观察到四个较宽的信号.但当加入5-FU分子后，通过COSY谱图（论文网络版图S1）对PAMAM信号进一步进行归属发现：H-b′与H-c、H-d′与H-d的信号可明显分开，其归属结果在滴定谱图中标出.

从一系列5-FU与PAMAM摩尔比例不同的重水混合溶液的¹H NMR谱图（图 2）可以看出，随着5-FU比例的不断增加，PAMAM化学位移变化较大的是最外层的亚甲基质子H-b′和H-d′，并且紧邻着末端胺基的质子H-b′的化学位移变化最大（∆δ_H=0.31），靠近酰胺的质子H-d′的化学位移变化也相对较大（∆δ_H=0.19）.以上信号变化趋势说明5-FU分子在PAMAM表面与其发生相互作用，由于去屏蔽效应，使位于最外层的质子向低场位移.同时，从图中也可以观察到加入PAMAM后，5-FU的质子信号与其在重水溶液中的信号（δ_H 7.53）相比，不断向高场移动，也说明PAMAM与5-FU之间发生相互作用.根据以前的研究报道^{[7, 21, 22]}，5-FU分子不仅在PAMAM表面与其发生相互作用，也可以通过疏水作用或氢键作用进入PAMAM分子非极性的内部空腔.然而，由于与5-FU相互作用后，PAMAM的¹H NMR谱峰变宽，难以确定G3 PAMAM内部质子的位移是否发生移动.因此，为判断PAMAM是否对5-FU分子进行包合作用，5-FU分子是否进入到PAMAM的分子内部空腔，需要做进一步的研究与分析判断.

图 2 摩尔比例（n_5-FU:n_PAMAM）不同的5-FU/PAMAM重水溶液的¹H NMR谱图 Fig. 2 The ¹H NMR spectra of 5-FU/PAMAM D₂O solutions with different molar ratios (n_5-FU:n_PAMAM)

2.2 ¹³C NMR化学位移滴定

由于PAMAM的¹³C NMR谱图的信噪低，难以直接对其信号进行指认.因此采集了n_5-FU:n_PAMAM=32:1时的重水溶液的¹H-¹³C HSQC谱图（图 3），通过对已归属的质子相关信号的指认，对混合物的¹³C NMR谱进行了归属.

图 3 n_5-FU:n_PAMAM=32:1时的5-FU/PAMAM重水溶液的¹H-¹³C HSQC谱图 Fig. 3 The ¹H-¹³C HSQC spectrum of the 5-FU/PAMAM D₂O solution with n_5-FU:n_PAMAM=32:1

根据¹H NMR谱，选取几种典型比例（n_5-FU:n_PAMAM=0:1、16:1、32:1、64:1、1:0）的5-FU/PAMAM重水溶液进行¹³C NMR化学位移滴定实验.与纯5-FU重水溶液的¹³C NMR谱图[图 4(a)]相比，当n_5-FU:n_PAMAM=16:1时，5-FU中位移变化最大的是C-3（∆δ_C=4.9）和C-4（∆δ_C=4.3），C-1（∆δ_C=0.8）和C-2（∆δ_C=1.8）位移相对变化较小，可以推测可能为5-FU分子酰胺键的碳氧双键与树状大分子相互作用.另外，当PAMAM与5-FU相互作用时，观察树状大分子的¹³C NMR谱[图 4(b)]，随着5-FU比例增大至n_5-FU:n_PAMAM=64:1时，PAMAM位移变化最大的是C-d′（∆δ_C=4.3）和C-b′（∆δ_C=0.6），这与¹H NMR化学位移滴定实验的结果一致，说明5-FU在PAMAM的表面与其发生相互作用.但值得注意的是，靠近酰胺键的C-d′比最外层的C-b′化学位向高场偏移更大，说明靠近PAMAM最外层酰胺键的氮氢键可能与5-FU酰胺键的碳氧双键形成氢键.另外PAMAM分子的C-a也向高场移动（∆δ_C=0.5）；且加入5-FU分子后，PAMAM上羰基的位移也发生变化，这些也可以推测出作用位点为PAMAM上酰胺键的碳氧双键与5-FU分子作用.这些结果都说明5-FU分子可能通过氢键作用或疏水作用进入PAMAM的空腔内部，与其内部结构的酰胺键发生相互作用.

图 4 摩尔比例（n_5-FU:n_PAMAM）不同的5-FU/PAMAM重水溶液中，(a) 5-FU和(b) PAMAM分子的¹³C NMR谱图 Fig. 4 The ¹³C NMR spectra of (a) 5-FU and (b) PAMAM molecules in the 5-FU/PAMAM D₂O solutions with different molar ratios (n_5-FU:n_PAMAM)

2.3 T₁测定

与纯5-FU重水溶液中的¹⁹F NMR信号（δ_F ﹣169.45）对比，当加入PAMAM（n_5-FU:n_PAMAM=16:1）后，5-FU分子的¹⁹F NMR信号（δ_F ﹣169.30）向低场移动（∆δ_F=0.15）（图 5），与¹³C NMR谱图变化趋势一致.另外，从图中可以看出，加入PAMAM后，5-FU分子的¹⁹F NMR信号谱峰变宽.通常情况下，若小分子与大分子发生相互作用，则小分子的运动受限，导致谱峰变宽及其T₁值明显降低^[5].与纯5-FU重水溶液相比，加入PAMAM的5-FU的¹⁹F核的T₁值下降25 %，¹H核下降26 %（表 1），这也充分说明了二者之间发生了相互作用.

图 5 摩尔比例（n_5-FU:n_PAMAM）不同的5-FU/PAMAM重水溶液的¹⁹F NMR谱图 Fig. 5 The ¹⁹F NMR spectra of 5-FU/PAMAM D₂O solutions with different molar ratios (n_5-FU:n_PAMAM)

表 1 纯5-FU重水溶液及n_5-FU:n_PAMAM=16:1时的重水溶液中5-FU分子的¹⁹F核和¹H核的T₁（单位为s） Table 1 The spin-lattice relaxation time (T₁/s) values of ¹⁹F and ¹H nuclei in 5-FU molecule from pure 5-FU and 5-FU/PAMAM (n_5-FU:n_PAMAM=16:1) D₂O solutions

2.4 2D ¹H-¹H NOESY谱图分析

2D NOESY技术已经被证明是研究主客体间相互作用有效的分析工具^[28-30].为证明5-FU分子进入到PAMAM的空腔内部，可以通过NOESY谱图观察二者的质子信号是否有相关性.为提高检测的灵敏度，选择n_5-FU:n_PAMAM=48:1的混合溶液用来进行测试，结果如图 6所示.通过纯PAMAM溶液的NOESY谱图（论文网络版图S2）以及二者相互作用后混合溶液的COSY谱图（论文网络版图S3）对比，从谱图中信号可以观察到：除PAMAM分子自相关外，还可以很清晰地看到5-FU分子的H-2（δ_H 7.56）与PAMAM的H-a（δ_H 2.43）存在交叉信号（H-2/H-a）.进一步验证了5-FU分子进入到PAMAM空腔内部，与其内部结构的酰胺基团发生相互作用.

图 6 n_5-FU:n_PAMAM=48:1的5-FU/PAMAM重水溶液的¹H-¹H NOESY谱图 Fig. 6 The ¹H-¹H NOESY spectrum of the 5-FU/PAMAM D₂O solution with n_5-FU:n_PAMAM=48:1

3 结论

本文利用一维¹H NMR、¹³C NMR、¹⁹F NMR化学位移滴定实验，二维¹H-¹³C HSQC，T₁测定及¹H-¹H NOESY等方法揭示了PAMAM和5-FU之间的相互作用机制.结果表明5-FU分子不仅在PAMAM分子表面与其发生相互作用，还进入PAMAM的疏水空腔内部，并与其内部结构的酰胺键发生相互作用.该研究为利用NMR技术研究树状大分子和药物小分子的相互作用提供了系统的分析方法.

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