2020, Vol. 37 
2. 上海市磁共振重点实验室, 华东师范大学 物理与材料科学学院, 上海 200062
2. Shanghai Key Laboratory of Magnetic Resonance, College of Physics and Materials Science, East China Normal University, Shanghai 200062, China
普遍存在固体核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）实验中的背景信号会造成NMR谱图相位和基线的畸变，甚至会产生假峰[1-4].背景信号一般来源于两个方面：一是射频脉冲产生的假信号（acoustic ringing），可通过相位循环消除[5, 6]；二是来自于定子或探头材料产生的真实信号，这类背景信号会随着样品信号的累积而累积，严重干扰样品的观测[7-10].探头中经常使用的材料有聚酰亚胺（Torlon）、聚三氟氯乙烯（Kel-F）和陶瓷等，这些材料含有13C、1H、15N、27A1等元素，可能会产生背景信号.对于天然丰度较低的核（如13C核），背景信号对其NMR谱图的干扰更为严重.
为了不影响样品信号的观测和分析，必须对背景信号进行有效抑制.目前报道的消除背景信号的方法有以下几种.Cory等[11-13]提出的DEPTH脉冲序列可以很好地抑制单脉冲实验中稀核的背景信号，这是由于线圈外有效场的不均匀性和射频场强度的急剧降低，导致线圈外的核自旋几乎不被激发.Fu等[14]提出连续发射两个绝热反转脉冲，再将两次采样的信号相减，以去除背景信号.Jaeger等[15, 16]报道的EASY方法在第一次采样后重复之前的90°脉冲，由于样品信号还未恢复，此时采集到的是背景信号，然后将两次采样信号相减即可去除背景信号，这种方法在稀核定量实验及二维谱中得到了很好的应用.White等[17]提出的组合脉冲
本文使用的是Bruker公司生产的静态探头，测试过程中发现探头产生严重的13C NMR背景信号，信号强度大，覆盖范围广，而且可以被交叉极化（cross polarization，CP）[19-21].以往的报道认为探头材料中由于1H核含量较低，而且线圈外有效场急剧降低，很难产生CP信号.而我们使用的静态探头13C NMR背景信号在CP实验中被增强，并与真实样品信号重叠，导致相位及基线矫正极其困难.以上几种去除背景信号的方法中，除了组合脉冲和EMMA方法外，均不适用于CP条件下静态探头产生的背景信号的去除.而组合脉冲和EMMA方法需要优化的参数较多，实验操作复杂.因此需要一种更加简洁有效的新方法去除静态探头经CP增强的13C NMR背景信号.
本研究的目的是找出背景信号的来源，并对其进行有效抑制.我们提出将相位步进脉冲（phase incremented pulses）引入CP实验中（以下称为PIPCP），可以完全抑制静态探头经CP增强的13C NMR背景信号，而样品信号不受影响.
1 实验部分 1.1 样品制备本文使用甘氨酸单晶样品制备方法如下：将1.8 g天然丰度的甘氨酸样品和0.2 g 13C全标记的甘氨酸样品（购买于美国CIL公司）混合均匀，溶解于5 mL蒸馏水中，待溶剂在室温下缓慢挥发完全，即得到10% 13C全标记的甘氨酸单晶，期间避免一切震动等干扰.
1.2 仪器设备及实验参数NMR实验使用配备双通道7 mm静态探头的Bruke Avance 300型固体NMR谱仪，1H核共振频率为300.15 MHz，13C核共振频率为75.54 MHz.13C NMR谱图以甘氨酸定标（δC 176.03）.本文共使用了三种脉冲序列：单脉冲，常规CP脉冲序列和PIPCP序列.
单脉冲实验参数优化如下：13C通道施加宽度为4 μs（90°）的脉冲，脉冲强度为62.5 kHz，采样时间为50 ms，重复等待时间d1为10 s，采样次数为5 000，激发中心O1设置在背景信号中心δC 151.3处.去耦脉冲为TPPM15脉冲序列，去耦脉冲强度为40.5 kHz.
CP实验参数优化如下：1H通道施加宽度为4 μs（90°）脉冲，脉冲强度为62.5 kHz，自旋锁定脉冲强度为40.5 kHz，自旋锁定时间P15为960 μs，去耦脉冲为TPPM15脉冲序列，去耦脉冲强度为40.5 kHz.13C通道自旋锁定脉冲强度为94.6 kHz，采样时间为50 ms，重复等待时间d1为5 s，采样次数为2 048，激发中心O1设置在背景信号中心δC 151.3处.
PIPCP脉冲优化过程及参数设置见1.3节.
1.3 PIPCP脉冲序列本实验提出的PIPCP脉冲序列如图 1所示.I通道为丰核通道，S通道为稀核通道.丰核通道施加90°脉冲将1H核的磁化矢量转移到XY平面，然后再施加自旋锁定脉冲（spin locking）；此时，稀核通道施加相位步进脉冲；采样在稀核通道进行，丰核通道施加高功率去耦脉冲.
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图 1 PIPCP脉冲序列示意图 Fig. 1 Pulse sequence of PIPCP |
相位步进脉冲由一系列相同脉宽（Δτ）的矩形脉冲相互连接组成，第一个脉冲的初始相位为φ0，每个矩形脉冲的相位都比前一个脉冲增加Δφ，其中-180°≤Δφ≤180°，N为步进个数，总的相位移动应满足：
| $ \varphi = \sum\limits_i {\Delta {\varphi _i} = 2n{\rm{ \mathsf{ π} }}} $ | (1) |
其中n必须为整数[22]，即表示总的相位移动大小应等于360°的整数倍，从而保证最终相位回到初始相位的方向.这里使用的相位步进脉冲中每一个步进脉冲的强度都相同，其大小根据CP匹配条件（Hartmann-Hahn match）调节，总的脉宽等于I通道锁定场的脉宽.相位步进脉冲的作用是使激发中心的频率发生移动，移动的大小满足：
| $ \Delta f = \Delta \varphi /(2{\rm{ \mathsf{ π} }}\Delta \tau ) $ | (2) |
PIPCP的原理如图 2所示.1H通道施加90°射频脉冲（f1）将1H核的磁化矢量从Z轴翻转到XY平面，然后1H通道加自旋锁定脉冲（spin locking），此时13C核通道施加相位步进脉冲，初始相位φ0=0°.1H核的磁化矢量通过极化转移传递给13C核，13C核的磁化矢量在XY平面增长.根据相位步进脉冲的原理，初始相位φ0通过相位步进在自旋锁定的过程中翻转360°的整数倍最终回到初始相位的方向.而处于线圈外的背景信号的相位变化具有不可预测性，且线圈外锁定场强度降低，因此无法被CP.
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图 2 PIPCP的原理，以及旋转坐标系下1H核和13C核磁化矢量的变化过程.Z0表示主磁场；M0表示初始磁化矢量；f1表示射频场；Δτ表示步进时间；φ0表示13C核的初始相位（浅蓝色）；φn表示13C核在PIPCP某一时刻的相位，虚线表示相位变化（红色）；φN表示13C核的最终相位（深蓝色） Fig. 2 Principle of PIPCP in the rotating coordinate system. Z0 represents the main magnetic field; M0 represents the initial magnetization vector; f1 represents the radio frequency field; Δτ represents the pulse width; φ0 represents the initial phase of 13C nucleus (light blue); φn represents the phase of 13C nucleus at a certain time in PIPCP (red); φN represents the final phase of 13C nucleus (dark blue) |
PIPCP实验参数优化如下：1H通道施加宽度为4 μs（90°）脉冲，脉冲强度为62.5 kHz，自旋锁定脉冲强度为40.5 kHz，自旋锁定时间P15为960 μs，去耦脉冲为TPPM15脉冲序列，去耦脉冲强度为40.5 kHz.13C核通道施加相位步进脉冲强度为94.6 kHz，初始相位φ0等于0°，相位步进Δφ等于12°，脉宽Δτ为2 μs，步进个数等于480，激发中心O1设置在背景信号中心δC 151.3处.采样时间为50 ms，重复等待时间d1为5 s，采样次数为2 048.
2 结果与讨论 2.1 背景信号的来源图 3(a)是探头空采得到的单脉冲13C NMR谱图，出现明显的背景信号，此背景信号包含两个成分，位于δC 108.5处较窄的信号和位于δC 151.3处较宽的信号.此背景信号强度较大，化学位移分布广（δC 20~250），几乎覆盖了整个13C核的出峰范围，对后续谱图分析造成困难.图 3(b)是探头空采得到的常规13C CP谱图，背景信号依然存在，但峰形与单脉冲采样结果[图 3(a)]不同.位于δC 108.5处较窄的信号消失，位于δC 151.3处的信号增强.将CP 1H通道锁定场的相位移动180°，背景信号也随之翻转180° [图 3(c)]，说明此13C NMR背景信号可能来自于探头所使用的有机材料.
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图 3 探头空采得到的13C NMR谱图：(a)单脉冲采样得到的信号；(b)常规CP脉冲采样得到的信号，1H通道锁定场脉冲相位设定为-X；(c)常规CP脉冲采样得到的信号，1H通道锁定场脉冲相位设定为X Fig. 3 13C NMR spectra of the empty probe head acquired with different pulse methods: (a) Single pulse; (b) Conventional CP with I spin locking pulse on –X; (c) Conventional CP with I spin locking pulse on X |
为了进一步验证背景信号的来源，通过改变CP锁定场脉冲的时间研究背景信号积分面积强度随时间的变化，从而得到CP动力学曲线（图 4）.从图 4可以看出，背景13C NMR信号的积分面积随着CP时间的增加出现明显的动力学变化.当CP时间小于700 μs，背景13C NMR信号的积分面积急剧增加，这是由于当达到Hartmann-Hahn匹配时，1H核的磁化矢量通过1H核和13C核之间的极化转移传递给13C核，导致13C NMR信号强度不断增加.当CP时间在700~1 000 μs之间，1H核到13C核的极化转移达到平衡，因此背景13C NMR信号的积分面积强度几乎不变.当CP时间继续增加大于1 000 μs，背景13C NMR信号的积分面积强度反而下降，这是由1H核信号在锁定场下的弛豫造成的.因1H核初始磁化矢量较大，相比初始磁化矢量，锁定场强度较弱，1H核在锁定场下弛豫导致信号强度损失.
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图 4 背景信号的积分面积随着CP时间的变化 Fig. 4 Variations of background signal integral area with CP time |
以上讨论说明背景信号受1H锁定场脉冲相位影响，并且其积分面积随着CP时间的增加出现先增长后降低的变化，这充分说明此13C NMR背景信号来源于探头所使用的有机材料.此13C NMR背景信号不仅强度大，会随着样品信号的累积而累积，而且它的化学位移范围非常宽（δC 20~250），很容易和样品信号重叠，因此必须要对背景信号进行有效抑制.
2.2 背景信号的消除我们发现激发中心O1的设置对背景信号的强度有严重影响.图 5显示了采用常规CP脉冲序列对探头进行空采，激发中心改变对13C NMR背景信号的影响.当激发中心设置在背景信号中心时（δC 151.3，即13 kHz），背景信号强度最大[图 5(a)].将激发中心向右移动到9 kHz时（4 kHz offset），相同的采样条件下，背景信号的强度有所降低[图 5(b)].继续将激发中心向右移动，可以看到背景信号的强度随着offset的增加而降低[图 5(c)和5(d)].当激发中心移动到-3 kHz（16 kHz offset）时，背景信号消失不见[图 5(e)].可见背景信号对offset敏感，可通过移动激发中心来消除背景信号.虽然改变激发中心使offset大于16 kHz可有效去除背景信号，但是这种做法无法对激发中心移动进行补偿，导致后续实验存在offset的影响[23].而相位步进脉冲既可以实现激发频率的移动又能保持相位相干，可通过施加相反的相位步进脉冲将激发中心再次移动到谱图中心，不影响后续实验.基于此种分析，我们提出将相位步进脉冲引入CP实验消除背景信号.
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图 5 改变激发中心（O1），采用常规CP脉冲序列对探头空采得到的13C NMR谱图.(a) O1 = 13 kHz; (b) O1 = 9 kHz; (c) O1 = 5 kHz; (d) O1 = 1 kHz; (e) O1 = -3 kHz Fig. 5 13C NMR spectra of the empty probe head acquired with conventional CP pulse sequence with different O1 values. (a) O1 = 13 kHz; (b) O1 = 9 kHz; (c) O1 = 5 kHz; (d) O1 = 1 kHz; (e) O1 = -3 kHz |
图 6(a)是10% 13C全标记甘氨酸单晶样品的常规13C CP谱图.位于δC 0和δC 50.5处的信号来自于甘氨酸分子中与氨基连接的13C原子（Cα），位于δC 214.8和δC 265.5处的信号来自于羰基13C原子（Co）.实验所使用的是10% 13C全标记的甘氨酸，Cα和Co之间强烈的偶极耦合（约为3 800 Hz），导致Cα和Co分别裂分为2个峰.位于δC 27.2和δC 239.4处的两个小峰来自于天然丰度的Cα和Co.除了甘氨酸样品的13C NMR信号，图 6(a)中还出现了一个明显的背景信号，位于δC 151.3，化学位移分布非常宽（δC 20 ~ 250），并且与甘氨酸的信号重叠，导致谱图难以进行基线矫正，影响样品信号的观测和分析.
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图 6 10% 13C标记甘氨酸单晶的13C NMR谱图.(a)使用常规CP脉冲序列；(b)使用PIPCP脉冲序列 Fig. 6 13C NMR spectra of a single crystal of 10% 13C double-labelled glycine acquired with (a) conventional CP pulse sequence, and (b) the PIPCP pulse sequence |
图 6(b)是使用PIPCP脉冲采集的13C NMR谱图，可以看到背景信号完全消失，而样品信号保持不变.PIPCP脉冲的优化过程如下：为了达到最佳Hartmann-Hahn匹配条件，13C通道相位步进脉冲功率等于常规CP脉冲13C通道锁定场的强度，为了使Co和Cα CP效率最佳，CP时间P15应在700~1 000 μs之间.经过多次尝试选取Δφ=12°，总的相位步进应等于360°的整数倍，因此总的步进个数N为480，总的步进时间为960 μs.
PIPCP脉冲序列在保持样品信号不损失的条件下完美地去除了背景信号.这是由于经过相位步进脉冲线圈外相位严重畸变，而且线圈外锁定场强度的急剧降低，使得来自探头材料的13C NMR信号无法有效进行CP.而对于被测样品来说，相对于1H核和13C核之间强烈的偶极耦合作用，16 kHz的激发频率移动对锁定场（94.6 kHz）的影响仅为1.4%：
| $ \sqrt {{{94.6}^2} + {{16}^2}} = 95.9 $ | (3) |
| $ \frac{{95.9 - 94.6}}{{94.6}} = 1.4\% $ | (4) |
因此Co和Cα基团的信号保持不变，而来自线圈外的13C NMR背景信号则消失不见.PIPCP方法去除背景信号简洁有效，不仅可以用于静态探头，也可以用于魔角旋转（magic-angle spinning，MAS）探头.
3 结论背景信号在固体13C NMR实验中普遍存在，严重干扰样品的测试分析.本文探讨了Bruker公司静态探头产生的13C NMR背景信号来源，此背景信号可通过CP累积.我们通过将相位步进脉冲引入CP脉冲，有效去除了经CP增强的13C NMR背景信号.施加相位步进脉冲后，线圈内相位的变化遵循相位步进脉冲的原理，而线圈外的相位变化则不可预测，另外线圈外射频场强度的急剧降低，来自线圈外的13C NMR背景信号无法进行CP.根据这个原理有效地去除了来自线圈外材料的背景信号，而样品信号不受影响.利用相位步进脉冲去除背景信号简洁有效，可被更多地用于其它脉冲序列去除背景信号，也可用于MAS探头.
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