2019, Vol. 36 
2. 集美大学 信息工程学院, 福建 厦门 361021;
3. 厦门大学 电子科学与技术学院, 福建 厦门 361005
2. Information Engineering College, Jimei University, Xiamen 361021, China;
3. College of Electronic Science and Technology, Xiamen University, Xiamen 361005, China
食品安全是近年来公众关心的热点.传统的食品成分检测方法包括感官检测法、生物检测法、色谱法、萃取法等[1].然而这些检测方式或操作复杂、或获得的食品组成信息有限，不能满足便携式食品检测装置的要求.尽管核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）技术具备不破坏样品、不需对样品做预处理、操作简单等优点，而且可以通过NMR谱图判别样品成分组成及其含量，是一种较为理想的食品检测方法，但是目前国内外仅有少量将其用于食品检测领域的报道.例如李玮等[2]利用基于NMR的代谢组学技术分辨天然奶油和人造奶油，所得的结果与传统的气相色谱法一致.Hohmann小组[3]利用传统1H NMR和同位素比质谱、中红外光谱相结合的技术识别有机番茄和常规种植番茄的差异，结果显示利用NMR技术能够检测到用于区分两种蕃茄的生物标记物.究其原因主要是因为要获得分辨率更高的NMR谱图，传统的NMR波谱技术应用到食品检测领域时通常需要对样品进行萃取，将其制备为溶液再进行检测.例如Choi小组[4]利用萃取法分辨出不同成熟阶段黑树莓果实中氨基酸、糖类和有机酸等物质含量的波动情况.这是由于液体NMR检测时，分子运动十分迅速，分子间各向异性得以消除，磁场呈现均匀状态[3]；而半固体的果肉内分子运动受到束缚，并且果肉的分布会破坏磁场的均匀度，干扰NMR检测，使得NMR图谱出现频谱变宽、谱峰重叠、分辨率降低等问题，导致从中获得的有效信息量变少.也有报道利用魔角旋转（Magic Angle Spinning，MAS）方法改善NMR谱图的分辨率.MAS通过对样品进行高速旋转降低分子间的相互作用、获得分辨率更高的NMR谱图.旋转轴与磁场夹角归为54.44˚，称为魔角[5-7].例如Iglesias小组[8]利用MAS分辨出三个不同成熟阶段的蕃茄果肉、果皮和种子中成分的变化.Sobolev小组[9]利用MAS技术研究了水果在生长过程中代谢物的变化[10-12].这两种方法都可以显著提高NMR光谱的分辨率.但是都有一定的局限性：萃取法会破坏样品的完整性，萃取过程中用到的化学药剂对环境有一定的污染，并且操作复杂耗时；MAS需要专用的旋转设备和探头，需要持续的维护费用，使NMR的便携化受到限制，而且高速旋转同时会对一些脆弱样品的物理结构产生破坏[13].
为寻找更具有发展前景的的水果无损检测方法，本文对基于分子间多量子相干（intermolecular Multiple-Quantum Coherence，iMQC）的NMR方法[14-17]在水果检测中的应用效果进行了探讨.Warren小组在80%水和20%重水组成的高极化溶液溶液中，利用CRAZED序列，在脉冲梯度场的作用下检测到iMQC信号[17, 18].iMQC信号的作用范围在微米数量级，样品在这个数量级上可以看作是均匀的，因此iMQC信号对不均匀场具有一定的免疫特性.利用脉冲梯度场可以选择不同的相干信号.本文将两个脉冲梯度场比例设置为1:2，即选择分子间双量子相干（intermolecular Double-Quantum Coherence，iDQC）.这种方法可以较好的抑制水峰的干扰，在不均匀场下获得分辨率较高的NMR谱图.本文选用甲基丙烯酸丁酯、蕃茄、西瓜作为样品，验证iMQC方法能否在不均匀场下直接获得水果的高分辨NMR谱，旨在探索更加方便快捷的便携式水果检测方式.
1 实验部分 1.1 仪器与试剂蕃茄和西瓜采购于厦门市集美区洪润福超市，甲基丙烯酸丁酯与二甲亚砜（DMSO）采购于青岛腾龙微波科技有限公司.使用Varian 500 MHz液体NMR谱仪（Varian NMR System）和5 mm NMR样品管.
1.2 NMR实验本文使用的基于iDQC的IDEAL-Ⅱ序列[19]如图 1所示.第一个射频（Radio Frequency，RF）脉冲为90˚硬脉冲，用于产生各个阶的量子相干，第二个RF脉冲为激发溶剂频率的选择性高斯脉冲.第三个RF脉冲为180˚硬脉冲，负责相位的重聚.由于在第一个和第三个RF脉冲后分别加入了G1、G3两个梯度场，且它们的比例为1:2，因此可以选择iDQC信号，也可同时滤除单量子相干（intermolecular Single-Quantum Coherence，iSQC）和iMQC信号.G2的作用为散相.为消除不需要的信号，我们设计了四位的相位循环.三个脉冲的相位依次是(x, y, x, y)、(x, x, ﹣x, ﹣x)和(x, x, x, x)，第三个脉冲相位固定在x方向.WS为溶剂压制模块，用于压制溶剂峰[20-22]；t1=1.2 ms，为间接维演化最长时间；t2=3.0 ms，为采样时间.
针对三种样品各分别进行了三次实验：第一个实验为在不均匀场下采用单脉冲序列采集1D 1H NMR谱图；第二个实验在均匀场下采集1D 1H NMR谱图，采用带PRESAT溶剂压制模块的单脉冲序列；第三个实验为不均匀场下采用IDEAL-Ⅱ序列，采集2D NMR谱图，其中F1维代表不均匀场的宽度，F2维代表化学位移，通过在横轴累计投影可以得到1D 1H NMR谱图.
在进行第三个实验时，不同样品所使用的实验参数有所不同.以甲基丙烯酸丁酯为样品（溶剂为DMSO）时，F2维和F1维的谱宽分别为5 000 Hz和80 Hz，F2维采样点数=50，回波时间= 300.8 ms，实验总时间为471 s.以番茄为样品时，取新鲜未经处理的蕃茄（200 μg）直接塞入NMR样品管中，没有添加锁场和定标物质，F2维和F1维的谱宽分别为5 000 Hz和90 Hz，F2维采样点数=20，回波时间=121.6 ms，实验总时间为759 s.以西瓜为样品时，选取了西瓜果肉中带有籽的部分（200 μg）直接塞入NMR样品管中，没有添加锁场和定标物质，F2维和F1维谱宽分别为5 000 Hz和120 Hz，F2维采样点数=32，回波时间=198.4 ms，实验总时间为925 s.
2 结果与讨论为模拟采集水果样品NMR谱图时的不均匀环境，我们首先以甲基丙烯酸丁酯为样品，通过调偏仪器中X、Y和Z方向的磁场，制造不均匀磁场，采集的不均匀磁场下甲基丙烯酸丁酯的NMR谱图如图 2(a)所示.使用带有PRESAT溶剂压制模块脉冲序列，仔细匀场后，采集得到的均匀磁场下甲基丙烯酸丁酯的NMR谱图如图 2(b)所示.本文选用半高宽衡量NMR谱图的分辨率：线宽越小，谱图分辨率更高；反之，则越低.比较图 2(a)和图 2(b)可以发现：不均匀场下，甲基丙烯酸丁酯大部分NMR谱峰几乎消失，谱图中最大的信号（δH 4.8）来源于溶剂.在与图 2(a)相同的不均匀场下，应用IDEAL-Ⅱ序列，采集得到的NMR谱图如图 2(c)所示.与图 2(a)相比，图 2(c)溶剂峰基本被抑制.可以清晰分辨谱峰的化学位移和J偶合裂分情况；最大信号（δH 2.3）的半高宽为6.01 Hz，远远小于图 2(a)最大信号的半高宽（58.18 Hz）.
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图 2 甲基丙烯酸丁酯的1H NMR谱.(a)不均匀场下，使用单脉冲序列采集的1D 1H NMR谱；(b)均匀场下，使用带有PRESAT溶剂压制模块的单脉冲序列采集的1D 1H NMR谱；(c)与图(a)相同的不均场下，应用具有溶剂压制模块的IDEAL-Ⅱ序列采集得到的2D NMR谱和在横轴累计投影得到的1D 1H NMR谱.谱图均以水峰定标（δH 4.8） Fig. 2 1H NMR spectra of butyl methacrylate: (a) 1D 1H NMR spectrum under inhomogeneous field; (b) 1D 1H NMR spectrum under uniform field using a pulse sequence with PRESAT pressure module; (c) 2D NMR spectrum obtained by IDEAL-Ⅱ sequence and 1D 1H NMR spectrum obtained by cumulative projection on transverse axis under the same inhomogeneous field as Fig. (a). The spectra were calibrated by water peak (δH 4.8) |
为了验证实验结果的准确性，我们利用Chemical Draw 7.0（Cambridge Soft）软件，通过搜索化学式进行谱库检索，将图 2(c)与谱库中的谱图和图 2(b)分别进行了对比，结果一致，根据化学位移的规律，我们对图 2(c)中的谱峰进行了基团归属（表 1）.
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表 1 甲基丙烯酸丁酯1H NMR谱峰的归属 Table 1 1H NMR assignments of butyl methacrylate |
图 2和表 1证明使用iDQC序列，能够在不均匀场下获得正确的、高分辨率的NMR谱图.为了将iDQC技术推广运用到水果NMR检测中，我们选取了蕃茄和西瓜两种具有代表性的水果进行NMR实验.
图 3(a)是利用一个RF脉冲激发采集得到的蕃茄的1H NMR谱图.蕃茄组织的不均匀性以及磁场的不均匀性导致从图 3(a)只可分辨出强的水峰信号，该水峰半高宽为82.79 Hz.使用带有PRESAT溶剂压制模块的脉冲序列，在均匀场下采集得到的番茄的1H NMR谱图如图 3(b)所示：水峰被压制后，出现了裂分，但其它信号仍然不够明显.应用带有溶剂压制模块的IDEAL-Ⅱ序列，在与图 3(a)相同的不均匀场下采集得到的番茄的NMR谱图如图 3(c)所示：谱图中最高峰的半高宽降至38.43 Hz；可以较为清楚的观察到谱图的多重裂分情况，谱图分辨率大大提升.我们根据文献[10]对图 3(c)所得的1H NMR谱图进行了归属（表 2）.
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图 3 番茄的1H NMR谱图：(a)不均匀场下1D 1H NMR谱；(b)均匀场下，使用带有PRESAT溶剂压制模块的单脉冲序列采集得到的1D 1H NMR谱；(c)与图(a)相同的不均场下，应用带有溶剂压制模块的IDEAL-Ⅱ序列采集得到的2D NMR谱和在横轴累计投影得到的1D 1H NMR谱.谱图均以水峰定标（δH 4.8） Fig. 3 1H NMR spectra of tomatoes. (a) 1D 1H NMR spectrum under inhomogeneous field; (b) 1D 1H NMR spectrum under uniform field using pulse sequence with PRESAT pressure module; (c) 2D NMR spectrum obtained by IDEAL-Ⅱ sequence and 1D 1H NMR spectrum obtained by cumulative projection on transverse axis under the same inhomogeneous field as Fig. (a). The spectra were calibrated by water peak (δH 4.8) |
相对于番茄组织，西瓜组织中的籽进一步增加了磁场的不均匀性.不均匀场下，其1H NMR谱[图 4(a)]仅显示一个半高宽为52.23 Hz的最高峰，分辨率很低.对比图 4(b)，我们发现加入了PRESAT压水序列后，在均匀场下采集得到的1H NMR谱图最高峰的半高宽反而增大到125.84 Hz.使用iDQC序列，在与图 4(a)相同的不均匀场下采集的西瓜的NMR谱图如图 4(c)所示：最高峰（δH 3.6）的半高宽下降至30.24 Hz；可较为清楚的分辨其裂分情况.对于图 4(c)的归属（表 3）显示谷氨酸盐信号主要位于δ 2.0~3.4(m)和δ 0.5(s).
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图 4 西瓜的1H NMR谱. (a)不均匀场下1D 1H NMR谱；(b)均匀场下，使用带有PRESAT溶剂压制模块的单脉冲序列采集得到的1D 1H NMR谱；(c)与图(a)相同的不均场下，应用IDEAL-Ⅱ序列采集得到的2D NMR谱和在横轴累计投影得到的1D 1H NMR谱.谱图均以水峰定标（δH 4.8） Fig. 4 1H NMR spectra of watermelon. (a) 1D 1H NMR spectrum under inhomogeneous field; (b) 1D 1H NMR spectrum under uniform field using pulse sequence with PRESAT pressure module; (c) 2D NMR spectrum obtained by IDEAL-Ⅱ sequence and 1D 1H NMR spectrum obtained by cumulative projection on transverse axis under the same inhomogeneous field as Fig. (a). The spectra were calibrated by water peak (δH 4.8) |
上述三个实验结果均显示iDQC技术对较为复杂的场强环境具有较强的适应性，是一种有效的不均匀场下NMR测量方法.
对于甲基丙烯酸丁酯，使用溶剂压制模块在均匀场下获得的50%线宽较为理想，以其作为基准制造不均匀场，用于模拟水果采样时的不均匀环境，结果显示得到甲基丙烯酸丁酯和蕃茄的NMR谱图中最高峰的50%线宽急剧增加，而西瓜在由果肉和籽引起的不均匀场下，其50% NMR线宽较均匀场反而降低，说明磁场均匀度对检测结果的准确性影响很大.当使用基于iDQC的序列后，在同样的不均匀场下，蕃茄和西瓜的NMR谱图中最高峰的半高宽几乎是没使用iDQC方法的1/2，甚至更窄，说明iDQC可以有效解决水果原位NMR检测时固有的不均匀场对NMR谱图分辨率的影响，这为NMR在水果检测中的应用提供了一条途径.一般来说，水果组织中的水分和代谢物与自身的成熟度有着一定的关系[24, 25]，通过基于基于iDQC方法的NMR技术是一种潜在的无损检测水果组织中多种成分和成熟度的方法.
但该种技术还存在以下问题：（1）2D NMR实验所需时间大多超过5 min，3D NMR实验时间则达到数小时，因此如何缩短采样时间是利用NMR技术检测水果组织时亟待解决的问题，可以进一步优化iDQC序列，而更有效的途径是结合空间编码方法[15, 26]；（2）在实验中，我们发现iDQC信号信噪比较低，大约为iSQC信号的1/10，提高便携式谱仪中小型磁体的磁场强度和均匀度，研发高灵敏度探头和与其配套的控制台和软件系统[27]，开发提高谱图分辨率的脉冲序列，都将提高未来利用便携化NMR设备检测水果组织的可行性.
3 结论食品领域的磁共振检测技术应用尚不成熟，为了提高未来便携化水果NMR检测设备应用的可行性，本文采用基于iDQC技术的IDEAL-Ⅱ序列对甲基丙烯酸丁酯、蕃茄和西瓜三种样品进行了NMR实验，结果证明基于iDQC技术在不均匀场下获得水果的高分辨NMR谱图是可行的，该序列在无损检测的基础上提高了水果NMR谱图的分辨率，对于水果NMR检测设备的优化提供了理论基础.
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