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  波谱学杂志   2018, Vol. 35 Issue (3): 280-286.  DOI: 10.11938/cjmr20182625
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李红卫, 袁志良, 夏斌. 扩散序谱(DOSY)实验测定缓冲体系中蛋白质表观分子量[J]. 波谱学杂志, 2018, 35(3): 280-286. DOI: 10.11938/cjmr20182625.
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LI Hong-wei, YUAN Zhi-liang, XIA Bin. Determination of Apparent Protein Molecular Weight in Solution by Diffusion Ordered NMR Spectroscopy[J]. Chinese Journal of Magnetic Resonance, 2018, 35(3): 280-286. DOI: 10.11938/cjmr20182625.
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基金项目

国家重点研发计划资助项目（2016YFA0501203）；国家自然科学基金青年科学基金资助项目（21705005）

通讯联系人

李红卫, Tel:010-62756056, E-mail:lihongwei@pku.edu.cn

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收稿日期：2018-03-27
在线发表日期：2018-05-02
Contents              Abstract              Full text              Figures/Tables              PDF
扩散序谱(DOSY)实验测定缓冲体系中蛋白质表观分子量
李红卫 1,2, 袁志良 1,3, 夏斌 1,2,3     
1. 北京大学 北京核磁共振中心, 北京 100871;
2. 北京大学 化学与分子工程学院, 北京 100871;
3. 北京大学 生命科学学院, 北京 100871
收稿日期：2018-03-27; 在线发表日期：2018-05-02
基金项目：国家重点研发计划资助项目（2016YFA0501203）；国家自然科学基金青年科学基金资助项目（21705005）
通讯联系人(Corresponding author)：李红卫, Tel:010-62756056, E-mail:lihongwei@pku.edu.cn
摘要: 液体核磁共振扩散序谱（DOSY）可以通过测定溶质分子的自扩散系数（Dt）来研究该分子在溶液中的表观分子量（M）.Dt与测试体系和分子本身性质相关，蛋白质体系较为复杂，从而增加了蛋白质自扩散系数（Dt-protein）测定的难度.本文以3-（三甲基硅基）丙磺酸钠（DSS）为内标，以蛋白质分子与DSS自扩散系数的比值（Dr）来表征蛋白质分子在溶液中的表观分子量（Mprotein），该方法降低了缓冲体系对Mprotein的影响，使得Mprotein主要由分子本身的性质决定.在此基础上，测定了不同分子量蛋白质分子相对于DSS的Dr，拟合得到了Dr与Mprotein的相关关系：lgMprotein =-2.6488 lgDr-0.7863，相关系数（R2）为0.997.最后测定了通过大肠杆菌表达纯化得到的SARS冠状病毒主蛋白酶C端结构域（Mpro-C）分子相对于DSS的Dr，并计算出与文献结果一致的Mprotein，进一步验证了拟合公式的准确性和实用性.
关键词: 液体核磁共振(liquid-state NMR)    表观分子量    扩散序谱(DOSY)    缓冲体系    脉冲梯度场    
Determination of Apparent Protein Molecular Weight in Solution by Diffusion Ordered NMR Spectroscopy
LI Hong-wei 1,2, YUAN Zhi-liang 1,3, XIA Bin 1,2,3     
1. Beijing Nuclear Magnetic Resonance Center, Peking University, Beijing 100871, China;
2. College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking University, Beijing 100871, China;
3. College of Life Sciences, Peking University, Beijing 100871, China
Abstract: Diffusion ordered NMR spectroscopy (DOSY) can be used to determine the apparent molecular weight of proteins (Mprotein) by measuring self-diffusion coefficient (Dt-protein). However, Dt-protein is also affected by the property of buffer solution, making the measurements complicated. In this work, 3-(trimethylsilyl) propane sodium sulfonate (DSS) was used as the internal reference molecule and the diffusion coefficient ratio between the target protein and DSS (Dr) was used to characterize the protein in solution. This method reduced the effects of buffer system on Mprotein determination, yielding more accurate Mprotein measurement. The Dr values of reference proteins with different molecular weight were determined. A correlation curve between Dr and Mprotein was established (lgMprotein=-2.6488 lgDr-0.7863, R2=0.997). Finally, Dr of the C-terminal domain of SARS-CoV main protease (Mpro-C) was determined and to yield its molecular weight. Accuracy and practicability of the fitting curve were demonstrated.
Key words: liquid-state NMR    apparent molecular weight    diffusion ordered NMR spectroscopy (DOSY)    buffer solution    pulse gradient    
引言

蛋白质溶液体系中的表观分子量（Mprotein）更加真实的反映了蛋白质在接近生理状态下的聚集状态，而该聚集状态与许多蛋白质的功能直接相关，也是导致一些疾病的直接原因[1-3].核磁共振（NMR）脉冲梯度场扩散序谱（DOSY）实验可以测定溶液体系中化合物的自扩散系数（$ {D_t} $），进而得到分子在溶液条件下的表观分子量（M），从而研究分子在溶液中的聚集状态.DOSY实验原理与方法在文献中已有深入的介绍[4-7].简单来说，对于球型分子来说，根据Stokes-Einstein方程，${D_t} $表达式为

$ {D_t} = kT/6{\rm{ \mathsf{ π} }}\eta {r_H} $ (1)

其中k为玻尔兹曼常数，T表示实验温度，η表示溶液粘度，$ {r_H} $表示与分子形状相关的流体力学半径.而流体力学半径与表观分子量的关系可以表示为

$ {r_H} = \sqrt[{{}^A}]{{M/[N\rho (4/3{\rm{ \mathsf{ π} }})]}} $ (2)

其中N是阿伏加德罗常数，ρ是分子密度，A是分子形状相关的常数，对于球形分子来说，A的值为3.在实际的测定中，$ {D_t} $通过改变的梯度场强度与得到的NMR信号的强度进行拟合得到[6]

$ \ln E = - {\gamma ^2}{G^2}{\delta ^2}{D_t}(\Delta - \frac{\delta }{3}) $ (3)

其中，E表示NMR信号强度，γ表示观测核的旋磁比，G表示使用的脉冲梯度场强度，δ是脉冲梯度场时间，${D_t} $表示自扩散系数，Δ表示扩散时间.

根据(1)式和(3)式可知，$ {D_t} $除了与反映分子本身性质的${r_H} $相关外，还与缓冲体系和测试环境相关.因此，如果要更加准确测定$ {r_H} $，进而获得准确M值，就必须尽可能消除缓冲体系和测试环境的影响.对于蛋白质样品来说，其研究多在缓冲体系中完成，而蛋白质样品缓冲体系多种多样；并且由于蛋白质分子量较大，蛋白质浓度对溶液的粘度影响较大，这使得同一蛋白质分子在不同缓冲体系、不同浓度时所测得的自扩散系数（$ {D_{t{\rm{ - protein}}}} $）有所不同.环境因素对蛋白质样品$ {D_{t{\rm{ - protein}}}} $测量值的显著影响增加了通过$ {D_{t{\rm{ - protein}}}}$测定其Mprotein值的难度.因此，虽然已经有较多文献应用DOSY实验对各种分子体系进行了研究[6-17]，但并未见到有普适性较高的应用DOSY实验测定蛋白质Mprotein值的报道.

引入内标物质是消除环境因素影响的简单且有效的方法.对内标物质的基本要求是内标物质的测定可以完全独立于溶质分子完成.由于内标物质和溶质分子处于同一环境中，根据具体测定参数的公式就能够较大降低甚至消除环境对测定值的影响.本文蛋白质体系以常用的化学位移定标内标物质——3-(三甲基硅基)丙磺酸钠（DSS）作为$ {D_t} $测量的内标物质，其NMR信号位置很少与蛋白质分子信号重叠；在实际操作中，除了需要增加DSS在溶液体系的浓度以提高积分的可统计性外，几乎不需要对NMR测试样品作任何改变.根据(1)式，蛋白质分子与DSS的$ {D_t} $的比值（$ {D_r} $）表示为：

$ {D_r} = {D_{t{\rm{ - protein}}}}/{D_{t{\rm{ - DSS}}}} = {r_{H{\rm{ - DSS}}}}/{r_{H{\rm{ - protein}}}} $ (4)

$ {D_r}$在本文称为相对扩散系数，$ {D_{t{\rm{ - protein}}}} $和$ {D_{t{\rm{ - DSS}}}} $分别是蛋白质分子和DSS分子的自扩散系数，$ {r_{H{\rm{ - protein}}}} $和$ {r_{H{\rm{ - DSS}}}} $分别为测试蛋白质分子和DSS分子的流体力学半径.根据该公式，不同蛋白质分子相对于DSS的$ {D_r} $仅与${r_{H{\rm{ - protein}}}} $相关，而环境因素的影响被抵消.将(2)式代入(4)式，可以得到Mprotein与${D_r} $的关系：

$\lg {M_{{\rm{protein}}}} = - A\lg {D_r} + \lg ({M_{{\rm{DSS}}}}{\rho _{{\rm{protein}}}}/{\rho _{{\rm{DSS}}}}) $ (5)

其中MDSS是DSS的表观分子量，${\rho _{{\rm{protein}}}} $和$ {\rho _{{\rm{DSS}}}} $分别表示蛋白质分子和DSS的密度，其它参数与前文一致.

基于以上分析，本文首先以DSS为内标物质，在500 MHz和700 MHz NMR谱仪器上测定了不同缓冲体系中不同浓度的标准蛋白质卵清蛋白相对于DSS的$ {D_r}$，证实了缓冲体系和仪器对$ {D_r} $的测定影响较小.在此基础上，对不同分子量的标准蛋白质相对于DSS的${D_r} $和Mprotein进行了拟合，得到了两者间的相关关系.最后，测定了表达纯化得到的非球形蛋白SARS冠状病毒主蛋白酶C端结构域（Mpro-C）相对于DSS的$ {D_r} $，并计算了得到了与文献结果一致的Mprotein，进一步验证了拟合公式的准确性和实用性.

1 实验部分 1.1 NMR样品准备

肌红蛋白和卵清蛋白购买于北京欣经科生物技术有限公司，分子量分别为17.1 kDa和43.1 kDa.细胞色素C和碳酸酐酶购买于Sigma-Aldrich Inc.，分子量分别为12.3 kDa和29.0 kDa.其他化学试剂购买于北京化学试剂公司，均为分析纯. Mpro-C的表达纯化方法与文献[18]一致，Mpro-C存在稳定的单体和二聚体，实验中使用的是二聚体样品，分子量为26.8 kDa.

NMR样品的制备方法：标准蛋白质样品是将蛋白质粉末溶于400 μL 50 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.0）中，不同的样品的PBS缓冲溶液中加入有一定量的氯化钠和甘油，具体见表 1和表 2，Mpro-C纯化后交换到50 mmol/L PBS（pH 7.0）缓冲溶液，然后所有样品加入40 μL重水用于锁场和10 μL DSS（2%）作为内标物质.

表 1 不同测试体系下卵清蛋自扩散系数和相对扩散系数的测定 Table 1 Dt-protein and Dr determination for albumin egg obtained with different conditional experiments
表 2 不同分子量标准蛋白和Mpro-C蛋白自扩散系数和相对扩散系数的测定（700 MHz，100 mmol/L NaCl） Table 2 Dt-protein and Dr determination for standard proteins with different molecular weight and Mpro-C (700 MHz, 100 mmol/L NaCl)
1.2 DOSY实验

DOSY实验在配备QCI超低温探头的Bruker AVANCE Ⅲ 700型和配备TCI超低温探头的Bruker AVANCE Ⅲ 500型NMR谱仪上完成，实验温度为298 K，所使用的脉冲程序为stebpgp1s19，该脉冲采用stimulated-echo的方式测定$ {D_t}$，使用3-9-19的脉冲程序进行水峰压制.实验中扩散时间和脉冲梯度场时间等实验参数均进行了优化，实验结果使用Bruker TopSpin 3.2软件的T1/T2模块进行拟合分析.具体实验参数和$ {D_t} $拟合参数详见文后附录表 S1.

表 S1 DOSY实验采样参数和Dt拟合参数 Table S1 Acquisition parameters of DOSY experiments and parameters used for Dt fitting
2 结果与讨论 2.1 不同缓冲体系中Dr的测定

卵清蛋白是单体球状蛋白质，分子量为43.1 kDa，常用来进行分子量校准.我们分别在700 MHz和500 MHz NMR谱仪上测定了不同浓度、不同盐离子浓度和不同粘度的卵清蛋白样品（表 1的1~6号样品和表 2的10号样品）的${D_{t{\rm{ - protein}}}} $和对应样品中DSS的$ {D_{t{\rm{ - DSS}}}} $.

同一台仪器不同缓冲体系测得的结果表明，当向蛋白样品中增加200 mmol/L的NaCl（No.1 vs. No.2，No.4 vs. No.5），提高溶液离子强度后，卵清蛋白的$ {D_{t{\rm{ - protein}}}} $分别降低了2.3%和1.0%；再分别向2号和5号样品中增加2%的甘油提高粘度，得到3号和6号样品时，$ {D_{t{\rm{ - protein}}}}$又分别降低了7.8%和1.2%；相比1号和4号样品，3号和6号样品中卵清蛋白$ {D_{t{\rm{ - protein}}}}$分别降低了10.0%和2.3%.对应的DDS随着离子强度和粘度的增加，$ {D_{t{\rm{ - DSS}}}} $也在相应的降低.比较表 1中2号和表 2中10号样品的结果发现，虽然2号样品的盐离子浓度高于10号样品，但由于10号样品的浓度是2号样品的2倍，蛋白质分子量又较大，而蛋白质样品浓度能够明显影响溶液的粘度，所以10号样品中蛋白质样品的$ {D_{t{\rm{ - protein}}}} $比2号样品低6.5%，10号样品中的DSS的$ {D_{t{\rm{ - DSS}}}} $同样低于2号样品.因此，样品浓度、缓冲体系的离子强度和粘度等因素都对$ {D_{t{\rm{ - protein}}}} $有影响，很难直接用测定的$ {D_{t{\rm{ - protein}}}} $来表征蛋白样品分子的Mprotein.然而尽管浓度和缓冲体系有所改变，700 MHz和500 MHz仪器所测得的$ {D_r}$却变化不大，分别为（0.124±0.001）和（0.127±0.001），由此可见缓冲体系对$ {D_r} $的影响显著降低，$ {D_r} $更能表征蛋白质分子本身的性质.

分别比较不同仪器上测得的相同样品的结果发现，相比700 MHz NMR谱仪测得的$ {D_{t{\rm{ - protein}}}} $，同一样品在500 MHz NMR谱仪测得的$ {D_{t{\rm{ - protein}}}} $分别增加了30.2%（No.1 vs. No.4）、31.8%（No.2 vs. No.5）和41.3%（No.3 vs. No.6）, $ {D_{t{\rm{ - protein}}}} $显著的变化表明不同仪器环境对$ {D_{t{\rm{ - protein}}}}$测量的影响更加明显.而不同仪器上相同样品的${D_r} $只分别增加了2.6%、2.6%和2.3%，这表明测试仪器对${D_r} $测量也影响甚微.因此，针对不同的仪器，$ {D_r} $更能直接反映蛋白质分子本身的性质.并且虽然缓冲体系不同，但是两台仪器$ {D_r} $变化的比例很相近，完全可以根据该比例对两台仪器测得的$ {D_r}$进行校准，使得不同仪器测得的$ {D_r} $具有可比性.

总的来说，卵清蛋白在两台仪器上测得的7组数据中，$ {D_{t{\rm{ - protein}}}} $的相对标准偏差为16.9%，而$ {D_r} $的相对标准偏差为1.5%.与${D_{t{\rm{ - protein}}}} $相比，以$ {D_r} $表征蛋白质分子Mprotein更容易抵消仪器、样品浓度和缓冲体系的影响，$ {D_r} $更能够直接反映蛋白质分子本身的性质，使得测定蛋白质分子的Mprotein更加容易和准确.

2.2 Dr与Mprotein相关关系曲线拟合

上述结果显示$ {D_r} $受不同仪器和不同缓冲条件的影响更小，能更加准确地表征蛋白质在溶液中的状态.如(5)式所示，如果能够得到$ \lg {D_r} $与$ \lg {M_{{\rm{protein}}}} $相关关系的拟合曲线，就能够直接根据测得的$ {D_r}$计算出蛋白质在溶液中的Mprotein，从而研究蛋白质在溶液中的存在状态.

我们又在700 MHz NMR谱仪上测定了标准蛋白质细胞色素C（12.3 kDa）、肌红蛋白（17.1 kDa）、碳酸酐酶（29.0 kDa）相对于DSS的$ {D_r} $（表 2中7~9号样品），并与10号样品卵清蛋白相对于DSS的$ {D_r} $一起进行了数据拟合.以$ \lg {D_r} $为横坐标、以$ \lg {M_{{\rm{protein}}}} $为纵坐标进行线性拟合，得到的结果如图 1所示.从图中可以看出，$\lg {D_r} $与$ \lg {M_{{\rm{protein}}}} $呈良好的线性关系$ \lg {M_{{\rm{protein}}}} = - 2.6488\lg {D_r} - 0.7863$，线性相关系数（R2）为0.997.

图 1 四种标准蛋白质在溶液中的表观分子量与相对扩散系数的相关关系曲线 Figure 1 The linear fit of apparent molecular weight and relative diffusion coefficients in solution of four standard proteins
2.3 拟合曲线验证

得到拟合曲线后，我们将卵清蛋白1~6号的数据代入公式，可以计算得到的其分别为40.5 kDa、41.3 kDa、41.0 kDa、37.9kDa、38.6 kDa和38.8 kDa，其中700 MHz NMR谱仪得到的不同缓冲体系的卵清蛋白的Mprotein为（40.9±0.4）kDa，500 MHz NMR谱仪得到的不同缓冲体系的卵清蛋白的Mprotein为（38.4±0.5）kDa.由此可见，同台仪器不同缓冲体系测定的Mprotein值标准偏差较小，不同仪器测定的Mprotein值误差增加到2.5 kDa.虽然在不同仪器上测量时按照$ {D_r} $计算的Mprotein值误差较大，但远小于不同仪器上按$ {D_{t{\rm{ - protein}}}}$计算的影响（相差超过30%），因此以$ {D_r} $代替$ {D_{t{\rm{ - protein}}}} $，仍然大大降低了仪器环境对Mprotein值测定的影响.根据以上结果，相同仪器不同的缓冲体系误差较小，而不同仪器的误差略大，而拟合公式的数据是由700 MHz仪器测得的，700 MHz的数据不存在仪器不同所引入的误差，因此使用该拟合公式更加准确.由于同台仪器测定误差较小，其他仪器测得的数据可以同700 MHz数据校准后再使用拟合性关系的方程公式，会更加准确.如我们可以将500 MHz得到的$ {D_r} $进行矫正，再代入上述线进行计算，得到的Mprotein值为（41.2±0.5）kDa，与700 MHz测得的数据几乎完全一样.因此，在实际使用过程中，如果是进行蛋白质分子的聚集状态等研究，粗略的分子量是可以接受的情况下，那么只需测得$ {D_r} $并直接使用上述拟合公式进行计算即可对表观分子量进行预估.如果需要较为准确的Mprotein，可以先使用标准的卵清蛋白在测定的仪器上测定$ {D_r} $，然后与文中700 MHz的结果进行矫正后再代入公式进行计算.另外，700 MHz测得的卵清蛋白的Mprotein与其真实的分子量相比相差2.2 kDa，造成这种差别的主要原因是所用的标准蛋白质分子在溶液中也并非是一个标准的球形，球形的近似也会引入一些误差.

为了验证拟合公式的实用性，我们表达纯化得到了Mpro-C.已有文献[18]表明，Mpro-C单体是近似球形蛋白，形成二聚体后分子结构会明显偏离球体，凝胶体积排阻色谱测得的Mprotein值为38.2 kDa，与其理论分子量26.8 kDa存在较大的差异.DOSY实验使用二聚体Mpro-C，浓度为0.5 mmol/L，采用浓度为50 mmol/L、pH值为7.0的磷酸钠缓冲体系.DOSY实验测得的$ {D_{t{\rm{ - protein}}}} $和$ {D_r} $分别为9.459×10-11 m2/s和0.1314.将$ {D_r} $代入拟合公式，计算得到的Mprotein为35.2 kDa，介于理论计算值和凝胶体积排阻色谱测量值之间，更接近凝胶体积排阻色谱测量值.因此，该方法可以应用于蛋白质样品Mprotein值的测定，并能够取得较准确的结果.

3 结论

本文使用DOSY方法，证实了$ {D_r} $代替${D_{t{\rm{ - protein}}}} $来表征蛋白质分子Mprotein能够有效的降低仪器、样品浓度、缓冲体系的影响，而仅与蛋白质本身的性质相关.在此基础上建立了$ {D_r} $与Mprotein的拟合关系（700 MHz仪器数据），并且通过Mpro-C的实验结果验证了拟合曲线的准确性和实用性，从而拓展了DOSY实验在蛋白质研究中的应用.


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