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  波谱学杂志   2018, Vol. 35 Issue (2): 204-214.  DOI: 10.11938/cjmr20172595
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姜丹, 王巍, 毕倩楠, 等. 一种1, 4-噻嗪酰胺类FKBPs配体的波谱学数据解析[J]. 波谱学杂志, 2018, 35(2): 204-214. DOI: 10.11938/cjmr20172595.
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JIANG Dan, WANG Wei, BI Qian-nan, et al. Spectral Analysis of a 1, 4-Thiazinamide FKBPs Ligand[J]. Chinese Journal of Magnetic Resonance, 2018, 35(2): 204-214. DOI: 10.11938/cjmr20172595.
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基金项目

国家重大新药创制专项课题资助项目（2009ZX09103-024）；国家高新技术研究计划（“863”计划）资助项目（2012AA020301）

通讯联系人

姜丹, Tel:010-66874667, E-mail:jiangdan@263.net.cn

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收稿日期：2017-11-06
在线发表日期：2017-12-15
Contents              Abstract              Full text              Figures/Tables              PDF
一种1, 4-噻嗪酰胺类FKBPs配体的波谱学数据解析
姜丹1, 王巍2, 毕倩楠1, 苏丹丹1     
1. 军事医学科学院 毒物药物研究所, 北京 100850;
2. 长春中医药大学附属医院, 吉林 长春 130021
收稿日期：2017-11-06; 在线发表日期：2017-12-15
基金项目：国家重大新药创制专项课题资助项目（2009ZX09103-024）；国家高新技术研究计划（“863”计划）资助项目（2012AA020301）
通讯联系人(Corresponding author)：姜丹, Tel:010-66874667, E-mail:jiangdan@263.net.cn
摘要: （3R）-4-[（4-甲基苯磺酰基）]-1，4-噻嗪-3-酰基-[（2R）-2-氨基-4-甲基]-戊酸异丙酯（代号：HD5-6），是一个拥有完全自主知识产权的FK506结合蛋白家族（FKBPs）配体，具有显著的促神经再生作用，有望在临床实现对神经退行性疾病和肌萎缩侧索硬化、脑卒中的有效治疗.本文采用多种核磁共振（NMR）技术，包括1H NMR、13C NMR、DEPT、1D NOESY、1H-1H COSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC等，并结合质谱（MS）、紫外光谱（UV）和红外光谱（IR）等方法对此化合物进行解析，对其1H和13C NMR谱峰进行全归属，通过多种谱学技术确证了该化合物的化学结构.
关键词: 核磁共振(NMR)    结构确证    噻嗪酰胺类衍生物    FKBPs配体    红外光谱(IR)    质谱(MS)    紫外光谱(UV)    
Spectral Analysis of a 1, 4-Thiazinamide FKBPs Ligand
JIANG Dan1, WANG Wei2, BI Qian-nan1, SU Dan-dan1     
1. Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China;
2. The Affiliated Hospital of Changchun University of TMC, Changchun 130021, China
Abstract: (3R)-4-[(4-methylphenylsulfonyl)]-1, 4-thiazine-3-acyl-[(2R)-2-amino-4-methyl]-pentanoic acid isopropyl ester (ID:HD5-6) is a ligand of FK506 binding proteins (FKBPs), which we developed and had proprietary intellectual property rights for. The compound facilitates nerve regeneration, and can potentially developed in drugs for treatment of neurodegenerative diseases such as amyotrophic lateral sclerosis and stroke. In this study, one-dimensional (1D) and two-dimensional nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy (including 1H NMR, 13C NMR, DEPT, 1D NOESY, 1H-1H COSY, 1H-13C HSQC and 1H-13C HMBC), combined with mass spectrometry (MS), ultraviolet spectroscopy (UV) and infrared spectroscopy (IR), were used to elucidate the structure of the compound. All 1H and 13C NMR signals were assigned.
Key words: nuclear magnetic resonance (NMR)    structural elucidation    thiazine amide derivatives    FKBPs ligands    infrared spectroscopy (IR)    mass spectrometry (MS)    ultraviolet spectroscopy (UV)    
引言

神经退行性疾病是一类由神经系统进行性病变所引起的疾病，包括阿尔茨海默氏病（AD）、帕金森氏病（PD）、亨廷顿氏病（HD）及肌萎缩性侧索硬化症（ALS）缺血性或出血性脑卒中等.由于这类疾病的发生原因复杂，致病机制不很明确，目前尚没有找到有效的治疗药物.FK506结合蛋白（FKBPs）是免疫抑制剂FK506在人体内的作用靶蛋白，家族成员包括FKBP12、FKBP52、FKBP38等[1]，其在免疫系统中表达，但生理功能目前并不十分清楚.后续的研究发现FK506结合蛋白在脑组织中的浓度远大于其在免疫组织中的浓度，提示其与神经系统的功能可能存在密切关系[2].1994年，Lyons等人[3]研究发现，免疫抑制剂FK506在体外有显著的促神经生长活性，开创了有机小分子神经生长促进剂研究的先河.其后，大量的高活性化合物不断涌现[4, 5]，使FKBPs成为神经退行性疾病防治药物的重要靶标.

本文涉及的(3R)-4-[(4-甲基苯磺酰基)]-1, 4-噻嗪-3-酰基-[(2R)-2-氨基-4-甲基]-戊酸异丙酯（代号：HD5-6，图 1）是一种拥有完全自主知识产权的、高活性FKBPs配体，具有显著的促神经再生作用[6]，在多种神经退行性疾病动物模型上表现出了显著的药效[7].在快速老化小鼠SAMP8的定位航行模型中HD5-6给药组的潜伏期较痴呆组明显缩短（p < 0.05），与正常对照组无统计学差异（p > 0.05）；在空间探索模型中HD5-6给药组与痴呆组相比，跨平台次数与原平台象限时间比均有统计学差异（p < 0.05），而与正常对照组无统计学差异（p > 0.05），结果表明HD5-6能够显著改善快速老化小鼠SAMP8的学习记忆能力，机制研究的结果表明其能有效改善海马神经元的病理改变，有望用于包括如AD、PD和ALS等与神经退变有关的神经疾病，以及由各种物理损伤（如机械损伤或冲击）或疾病（如糖尿病或自身免疫获得缺陷病）引起的神经病变等相关疾病的临床治疗.目前该化合物作为候选药物分子正在按化药1类的技术规范开展临床前研究.由于HD5-6结构的NMR归属尚未见文献报道，因此本文利用核磁共振（NMR）波谱[8-10]（包括1H NMR、13C NMR、DEPT、1D NOESY、1H-1H COSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC）对该化合物进行了较为全面的结构表征，并对其进行了元素分析，并测定了其质谱（MS）、红外吸收光谱（IR）和紫外吸收光谱（UV），对该化合物的1H和13C NMR信号进行了详细归属，同时讨论了IR特征吸收峰所对应的各官能团的振动形式、UV吸收带位置与该化合物生色团的对应关系，对该化合物的结构及波谱学数据进行了解析，以期对该化合物及衍生物的研究提供更多的波谱信息，为其质量研究提供了较为全面的参考依据.

图 1 HD5-6的化学结构 Figure 1 Molecular structure of HD5-6
1 实验部分 1.1 仪器与试剂 1.1.1 仪器

UV光谱采用岛津UV2450紫外可见分光光度计（日本岛津制作所）测定.IR光谱采用NICOLET 6700型红外光谱仪（美国Nicolet仪器公司）测定，KBr压片.元素分析采用Elementar Vario ELⅢ元素分析仪（德国元素分析系统公司）测定.高分辨液质联用仪为Agilent 1200液相色谱仪-6230A飞行时间质谱（美国Agilent公司），配备电喷雾离子源（ESI）.

1H NMR、13C NMR、1D NOESY、DEPT、1H-1H COSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC谱均采用JEOL JNM-ECA 400型NMR谱仪（JEOL公司）测定，以氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）为溶剂、四甲基硅烷（TMS）为内标，采用5 mm z-轴梯度脉冲多核探头（TH5AT/FG）.1H NMR的工作频率为400.13 MHz，90˚脉冲宽度为11.0 μs，实验谱宽为7 348 Hz；13C NMR的工作频率为100.61 MHz，90˚脉冲宽度为8.8 μs，实验谱宽为25 146Hz；DEPT的工作频率及谱宽同13C NMR；1D NOESY谱采用多频率位移激发双梯度自旋回波方法测定，180˚高斯软脉冲，脉冲宽度为40 ms；1H-1H COSY的F2维（1H）和F1维（1H）谱宽均为9 180 Hz，采样数据点阵t2×t1=1 024×512，零填充后傅里叶变换点阵F2×F1=2 048× 1 024；HSQC的F2（1H）和F1（13C）维的谱宽分别为3 206 Hz和15 977 Hz，采样数据点阵t2×t1=1 024×512；HMBC的F2维（1H）和F1维（13C）谱宽分别为3 206 Hz和15 977 Hz，13C-1H远程偶合常数为6 Hz，采样数据点阵t2×t1=1 024×256.

1.1.2 样品与试剂

HD5-6样品由军事医学科学院毒物药物研究所肖军海制备并提供.经高效液相色谱（HPLC）面积归一化法检测纯度为99.56%.DMSO-d6购自北京百灵威科技有限公司，其中含有用于定标的TMS（δH 0.00、δC 0.0）；其他试剂均为分析纯.

2 结果与讨论 2.1 元素分析

样品的元素分析测定值（ω/%，括号内为理论值）如下：C为55.12（55.24）；H为7.22（7.08）；N为6.28（6.14）；O为17.21（17.52）；S为14.17（14.02）.元素分析实测平均值与理论值误差均小于3‰，由元素分析值可知该样品的元素组成和质量百分比符合HD5-6分子式C21H32N2O5S2.

2.2 MS谱图分析

HD5-6质谱（图 2）采集采用ESI离子源，正离子检测的准分子离子峰质荷比（m/z）为457.182 5 [M+H]+和479.164 4 [M+Na]+、负离子检测的准分子离子峰m/z为455.168 0 [M-H]-和491.144 8[M+Cl]-.与HD5-6（分子式为C21H32N2O5S2）精确分子量（456.175 3）一致.

图 2 HD5-6质谱. (a)正离子检测模式；(b)负离子检测模式 Figure 2 Mass spectra of HD5-6. (a) Positive ion detection mode; (b) Negative ion detection mode
2.3 UV光谱分析

HD5-6甲醇溶液的UV光谱中：207.0 nm为环状共轭体系所形成的π→π*跃迁吸收带，属于E2吸收带，表明该化合物含有苯环或杂芳环；230.0 nm为共轭双键π→π*轨道跃迁所产生的吸收带，属于K吸收带，表明该分子可能含有C=C-C=C或C=C-C=O，与HD5-6结构相符.

2.4 IR光谱分析

HD5-6的IR吸收光谱在3 411.87、2 980.10、2 955.43、2 935.43、2 910.92、2 867.87、1 731.48、1 678.01、1 596.96、1 509.85、1 470.43、1 377.67、1 365.23、1 342.27、1 272.87、1 250.68、1 162.71、1 091.71~1 215.40、998.86~1 044.74 cm–1处显示有吸收峰.3 411.87 cm–1（νN-H CO-NH）为N-H键的伸缩振动，1 678.01 cm–1（νC=O CO-NH）为C=O键的伸缩振动，表明分子中仲酰胺结构片段的存在；2 980.10、2 955.43、2 935.43、2 910.92、2 867.87 cm–1为甲基、亚甲基的伸缩振动吸收峰，1 377.67、1 365.23 cm–1为C-H弯曲振动，表明分子中含甲基（-CH3）、亚甲基（-CH2-）；1 731.48 cm–1（νC=O）为酯键COOR的强伸缩振动吸收峰；1 596.96、1 509.85、1 470.43 cm–1为苯环骨架C=C伸缩振动，表明分子中存在苯环；1 342.27、1 162.71 cm–1为S=O的对称和不对称伸缩振动，表明分子中含有-SO2基团；1 272.87、1 250.68 cm–1为C-O-C的变角振动与酯基C-C的伸缩振动，表明分子中含酯基（C-O-C）；1 091.71~1 215.40 cm–1吸收峰为C-N-C伸缩振动；998.86~1 044.74 cm–1为环烷烃中C-C键的伸缩振动，表明分子中含有环烷烃基团.具体的红外吸收光谱数据及归属见表 1.

表 1 HD5-6的红外吸收光谱数据及其归属 Table 1 IR data analysis of HD5-6
2.5 NMR谱图分析

13C NMR谱和DEPT谱（图 3）表明，该分子结构中含5个伯碳，即δC 21.5（包含2个碳原子）、22.0、22.1、23.4；4个仲碳，即δC 26.0、29.3、39.9、43.5；8个叔碳，即δC 24.8、50.9、54.7、68.5、127.6（包含2个碳原子）、130.2（包含2个碳原子）；4个季碳，即δC 137.5、143.7、168.4、172.4.

图 3 HD5-6的DEPT谱和13C NMR谱 Figure 3 DEPT and 13C NMR spectra of HD5-6

结合1H-1H COSY（图 4）、1H-13C HSQC（图 5）和1H-13C HMBC（图 6）谱图分析，1H NMR谱（图 7）中δH 1.20（3H, d, J=6.5 Hz）和δH 1.21（3H, d, J=6.5 Hz）归属为与次甲基相连的2个甲基质子H-19或H-20，受次甲基质子的偶合影响，均裂分为双重峰.在1H-1H COSY谱中，δH 4.93（1H, m）与H-19、H-20相关，归属为H-18，受邻位H-19、H-20的偶合作用，裂分为多重峰.δC 22.0、22.1在HSQC谱中与H-19、H-20直接相关，HMBC谱显示其与H-18有远程相关，归属为C-19、C-20. dC 68.5在HSQC谱中与H-18相关，HMBC谱显示其与H-19、H-20有远程相关，归属为C-18.

图 4 HD5-6的1H-1H COSY谱 Figure 4 1H-1H COSY spectrum of HD5-6
图 5 HD5-6的1H-13C HSQC谱 Figure 5 1H-13C HSQC spectrum of HD5-6
图 6 HD5-6的1H-13C HMBC谱. (a)全谱；(b)为(a)中方框所示部分放大图 Figure 6 1H-13C HMBC spectra of HD5-6. (a) Full spectrum; (b) Local amplified spectra in box of (a)

δH 8.12（1H, d, J=8.0 Hz）进行重水交换后，信号消失，归属为活泼的酰胺质子H-15.在COSY谱中，δH 4.19（1H, m）与H-15相关，归属为H-16；δH 1.46（2H, m）与H-16相关，归属为H-21.δC 50.9在HSQC谱中与H-16相关，HMBC谱显示其与H-21有远程相关，归属为C-16.δH 1.56（1H, m）在COSY谱中与H-21相关，归属为H-22.高场区δH 0.80（3H, d, J=6.3 Hz）和δH 0.87（3H, d, J=6.3 Hz）在COSY谱中与H-22相关，归属为2组甲基质子H-23或H-24，受邻位次甲基质子的偶合影响，均裂分为双重峰.δC 21.5、23.4在HSQC谱中与H-23（或H-24）相关，HMBC谱显示其与H-21、H-22有远程相关，归属为C-23或C-24.δC 24.8在HSQC谱中与H-22相关，HMBC谱显示其与H-16、H-21、H-23（或H-24）远程相关，归属为C-22.δC 39.9在HSQC谱中与H-21相关，HMBC谱显示其与H-16、H-22、H-23（或H-24）远程相关，归属为C-21.δC 172.4在HSQC谱中无相关信号，HMBC谱显示其与H-15、H-16、H-18、H-21有远程相关，归属为C-17.δC 168.4在HSQC谱无相关信号，HMBC谱显示其与H-16有远程相关，归属为C-14.

在1H-1H COSY谱中，δH 7.36（2H, d, J = 8.2 Hz）与δH 7.70（2H, d, J = 8.2 Hz）构成一个质子偶合体系，根据化学位移、峰型、质子个数，归属为苯环上的质子（H-8、H-9、H-11、H-12），其中H-8与H-12是磁等价质子，H-9与H-11是磁等价质子.δH 7.36（2H, d, J = 8.2 Hz）还与δH 2.38（3H）处的单峰弱相关，归属为H-9和H-11，因此δH 2.38归属为H-13，δH7.70归属为H-8、H-12.受H-8、H-12的影响，H-9、H-11均裂分为双重峰；受H-9、H-11的影响，H-8、H-12也裂分为双重峰.δC 127.6在HSQC谱中与H-8（H-12）相关，HMBC谱显示其分别与H-12、H-8有远程相关，由于取代基在苯环上的对称性，两个13C核化学位移相同，归属为C-8和C-12.δC 130.2在HSQC谱中与H-9（H-11）相关，HMBC谱显示其与H-13有远程相关，由于取代苯环对称性，两个13C核化学位移相同，归属为C-9和C-11.δC 21.5在HSQC谱与H-13相关，HMBC谱显示其与H-9、H-10、H-11远程相关，归属为C-13.δC 143.7在HSQC谱中无相关信号，HMBC谱显示其与H-13远程相关，归属为C-10.δC 137.5在HSQC谱无相关信号，HMBC谱显示其与H-9、H-11远程相关，由于受邻位硫原子的影响，13C NMR信号峰较弱，归属为C-7.

在1H-1H COSY谱中，δH 2.73（1H, dd, J2a, 2b = 14.5 Hz, J2a, 3 = 4.0 Hz）、δH 2.93（1H, dd, J2b, 2a = -14.5 Hz, J2b, 3 = 2.3 Hz）、δH 4.79（1H, dd, J3, 2a = -4.0 Hz, J3, 2b = -2.3 Hz）构成了一个质子偶合体系，根据化学位移、峰型、质子个数，归属为噻嗪环上的质子H-2a、H-2b、H-3，其中δH 2.73和δH 2.93在HSQC谱中同时与δC 29.3相关，归属为亚甲基中两个磁不等价的质子H-2a、H-2b，因此δC 29.3归属位C-2，δH 4.79归属为H-3.δC 54.7在HSQC谱与H-3相关，HMBC谱显示其与H-2a有远程相关，归属为C-3.同理，在1H-1H COSY谱中，δH 3.60（1H, m）、δH 3.91（1H, dt）、δH 2.43（2H, br）构成的质子偶合体系，根据化学位移、峰型、质子个数分别归属为H-5a、H-5b、H-6.δC 43.5在HSQC谱显示与H-5a和H-5b相关，HMBC谱显示其与H-3、H-6有远程相关，归属为C-5.δC 26.0在HSQC谱中显示与H-6直接相关，HMBC谱显示其与H-2b、H-5a有远程相关，归属为C-6.

对于HD5-6中被季碳及杂原子分隔的结构体系研究采用HMBC和1D NOESY谱（图 7）结合的方法可以得到满意结果.图 7(b)、(c)的1D NOESY谱显示，选择激发H-3（δH 4.79）信号，产生4个较强的NOE信号，分别出现在H-2a（δH 2.73）、H-2b（δH 2.93）、H-8和H-12（δH 7.70）、H-15（δH 8.12）.选择激发H-5b（δH 3.91）信号，产生3个NOE信号，其中H-8和H-12（δH 7.70）信号强度最大，由此可知H-3与H-8、H-5b与H-12之间存在较强的质子间空间效应，且二者在A、B片段（图 8）中相距最近，可确定A、B片段连接方式.图 7(d)的1D NOESY谱显示，选择激发H-15（δH 8.12）信号，产生7个NOE信号，其中H-3（δH 4.79）信号强度最大，由此可知H-15与H-3之间存在较强的质子间空间效应，且二者在A、C片段（图 8）中相距最近，另外HMBC谱也显示其与H-2、H-3、H-16有远程相关，可确定A、C片段连接方式.

图 7 HD5-6的NMR谱. (a) 1H NMR谱；(b)~(d) 1D NOESY谱，分别选择激发H-3、H-5b和H-15 Figure 7 NMR spectra of HD5-6. (a) 1H NMR spectrum; (b)~(d) 1D NOESY spectra with selective excitation of the H-3, H-5b, H-15
图 8 HD5-6的结构片段及NOE相关信号（） Figure 8 Fragments structure and NOE correlations of HD5-6

HD5-6的1H NMR、13C NMR归属见表 2、表 3.

表 2 HD5-6 1H NMR数据分析（DMSO-d6） Table 2 1H NMR data analysis of HD5-6 (DMSO-d6)
表 3 HD5-6 13C NMR数据分析（DMSO-d6） Table 3 13C NMR data analysis of HD5-6 (DMSO-d6)
3 结论

本文通过UV、IR、ESI-MS和NMR谱图（包括1H NMR、13C NMR、DEPT、1D NOESY、1H-1H COSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC）的测定和解析，对HD5-6的化学结构进行了全面地分析和验证.通过ESI-MS、元素分析测定值确定了HD5-6的分子式；UV光谱显示出该化合物的特征官能团；IR光谱进一步显示出该化合物的各官能团的特征吸收；同时，根据1D NMR和2D NMR数据，对HD5-6的1H NMR和13C NMR信号进行了全归属，综合确证了HD5-6的化学结构.


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