2018, Vol. 35 
2. 南方医科大学南方医院, 创伤骨科, 广东 广州 510515;
3. 波谱与原子分子物理国家重点实验室, 武汉磁共振中心(中国科学院 武汉物理与数学研究所), 湖北 武汉 430071
2. Department of Orthopaedics and Traumatology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China;
3. State Key Laboratory of Magnetic Resonance and Atomic and Molecular Physics, National Center for Magnetic Resonance in Wuhan(Wuhan Institute of Physics and Mathematics, Chinese Academy of Sciences), Wuhan 430071, China
哺乳类动物和人类的Janus kinase（JAK）家族主要在造血细胞中表达，激活后将信号转导子和转录激活子（signal transducer and activator of transcription, STAT）因子磷酸化，进而形成二聚体并转位至核内调控基因表达.JAK/STAT是细胞内的主要信号转导通路之一，也是介导多种激素和细胞因子如瘦素（leptin）、生长激素、白介素、干扰素等信号转导的重要通路[1, 2].JAK/STAT参与调节机体一系列生物过程，如细胞凋亡、增殖、免疫反应和炎症发生[3].研究表明，JAK/STAT功能失衡与机体代谢性疾病，如代谢综合症、肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗、炎症等密切相关[2].
JAK/STAT信号通路在骨骼肌、肝脏、脂肪组织和胰脏等代谢活跃器官中发挥重要作用.在小鼠组织特异性敲除JAK/STAT后，可引起多种代谢紊乱，如肝脏特异性敲除STAT3可引起胰岛素抵抗，并激活葡萄糖异生基因表达[4]；脂肪组织特异性敲除JAK2或STAT3或STAT5均可引起小鼠胰岛素抵抗、体重增加、肥胖和脂肪分解障碍[5-7].目前，JAK/STAT抑制剂已被应用于多种疾病的临床试验，如糖尿病肾病、风湿性关节炎、慢性溃疡性结肠炎[8, 9].但是，JAK/STAT抑制剂全身性用药对机体组织细胞功能活动的影响目前尚不明确.
作为细胞生物活动的终产物，组织和体液中的代谢产物改变可以综合反应细胞生物信号活动的变化，也可进一步影响细胞的功能活动.基于核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技术的的代谢组学研究在不需要对标本进行复杂处理的情况下，可提供疾病发生过程中全面、有效及稳定的代谢组数据，为早期诊断、治疗监测和疾病的病理发生提供重要参考[10].本研究以JAK/STAT通路抑制剂WP1066处理小鼠2周，利用1H NMR检测了小鼠血清中代谢产物的改变，以期阐述JAK/STAT抑制剂全身性用药对小鼠血清代谢组的影响，为临床JAK/STAT通路抑制剂的应用监测提供重要参考.
1 实验部分 1.1 试剂D2O（99.9%氘代）购自Sigma-Aldrich公司；JAK/STAT通路抑制剂WP1066购自Selleck公司（S2796）.
1.2 动物分组及处理此研究的所有动物实验均遵照南方医科大学实验动物伦理委员会发布的实验动物使用规则.清洁级C57BL/6小鼠（9周龄，雌性）从南方医科大学实验动物中心购得，室温控制在（25±3）℃，12 h交替照明，常规饲料自由饮食.将小鼠随机分为2组（每组n=8），适应性饲养一周后开始给予药物处理.根据WP1066临床试验用量（6 mg/kg，2天一次），基于小鼠与人用药剂量比例（1:0.08）换算[11]，且参照小鼠实验用药量（15 mg/kg，2天一次）[12]，将药物处理组小鼠以腹腔注射WP1066（20 mg/kg，2天一次，持续2周），将对照组小鼠腹腔注射同等体积磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution, PBS）.2周后处死小鼠，采用眼球取血法收集血液.将所收集的血液标本置于冰上静置30 min后，3 000 rpm离心10 min，取上清保存于-80 ℃冰箱，直到进行NMR检测.
1.3 小鼠血清1H NMR检测将血清样本解冻，取250 μL置于离心管中，加入200 μL浓度为100 mmol/L的PBS缓冲液（pH 7.4）和50 μL D2O，于4 ℃静置10 min，3 000 rpm离心5 min.然后取550 μL样品转移到直径为5 mm的NMR样品管中.血清样本的1H NMR谱采集在Bruker AVANCE Ⅲ 800 NMR谱仪上进行，对应质子共振频率为800.20 MHz，采用cpmgpr1d脉冲序列采集信号，累加次数为64，采样间隔时间为2.0 s，采样时间为2.55 s，谱宽为12 820 Hz.2D TOCSY和NOESY实验两维采样点分别为2 048和256，累加次数为32，采样间隔时间为2 s.TOCSY混合时间为80 ms，混合采用DIPSI2组合脉冲.NOESY谱的混合时间为1 s.
1.4 数据处理将采集的1H NMR谱依次进行加指数窗函数（1 Hz）、傅里叶变换、定标、基线和相位调整处理.定标以肌酸（creatine）甲基峰（δ 3.03）为标准.采用Bruker Topspin软件对代谢谱图有变化的区域进行手动积分.为消除样本间的浓度差异，将所得积分数据以肌酸的甲基峰（δ 3.03）的积分面积为内标归一化的方式进行归一化处理，再将所得数据导入SIMCA 14软件包中先自标度化（mean-centering and scaled to unit variance, UV）然后进行多变量统计分析，包括主成分分析（principal component analysis, PCA）和正交偏最小二乘法分析（orthogonal partial least squares analysis, OPLS）.肌酸是磷酸肌酸在体内的最终代谢产物，也是代谢组学数据处理常用于归一化处理的参照因子[13].因此，在本实验中，我们将肌酸甲基峰积分面积作为内标将数据进行归一化处理.此外，为了消除所加入试剂本身的影响，WP1066试剂本身的信号（图 1中*所标示的即为该物质的特征信号）没有做进一步分析.
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图 1 (a) 对照组和(b) WP1066处理组小鼠血清的1H NMR谱图（*WP1066本身信号） Figure 1 1H NMR spectra of serum from control (a) and WP1066 treated (b) mice (*signal of WP1066) |
发现的潜在生物标志物应用SPSS Statistics软件进行统计分析，归一化后的积分强度以均值±标准差（mean±SD）方式表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），在F值显示方差齐性检验成立时进行组间差异比较，p < 0.05表明存在显著差异.
2 结果与讨论 2.1 血清1H NMR谱图归属我们根据谱峰的化学位移、裂分情况和耦合常数等信息，结合2D TOCSY（见第268页附录图S1）和NOESY（见第268页附录图S2）谱，以及文献[14]所报道的小分子代谢物化学位移，将血清中的部分特征性代谢物峰进行了归属（对照和WP1066处理小鼠血清的1H NMR谱图如图 1所示，部分有代表性的代谢物特征谱峰归属信息见表 1）.主要代谢物多集中在高场区，如乳酸（lactate）、乙酸（acetate）、肌酸（creatine）、胆碱（choline）等，且两组小鼠的谱图中主要化合物基本相同.
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图 S1 用于信号归属的小鼠血清的2D 1H-1H TOCSY谱 Figure S1 2D 1H-1H TOCSY spectrum of serum from mice |
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图 S2 用于信号归属的小鼠血清的2D 1H-1H NOESY谱 Figure S2 2D 1H-1H NOESY spectrum of serum from mice |
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表 1 部分有代表性的小鼠血清代谢物特征峰的归属 Table 1 Characteristic NMR peak assignment of typical metabolites in mice serum |
为了提取WP1066处理组与对照组中的差异代谢物，本研究对血清1H NMR数据进行了PCA和OPLS分析.PCA和OPLS得分图如图 2所示，WP1066处理组与对照组的血清代谢组间存在显著差异.OPLS相关的统计参数R2=0.998和Q2=0.889均提示模型的有效性，并且CV-ANOVA的p值（p < 0.05）进一步确认了统计分析的有效性，说明WP1066处理引起小鼠血清代谢组发生显著性改变.相应的核载结果（S-plot相关系数详见附录表S1）显示主要差异可能来自于N-甲基烟酰胺（N-methylnicotinamide）、顺式乌头酸（cis-aconitate）、草酰乙酸（oxaloacetate）或乙酰胺（acetamide）.
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图 2 对照和WP1066处理小鼠血清的PCA (a)和OPLS得分图(b).■对照组，●WP1066处理组 Figure 2 Scores plot of PCA and OPLS based on 1H NMR spectra of all serum samples of control and WP1066 treated mice. ■control group, ●WP1066 treated group |
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表 S1 OPLS分析结果的荷载相关系数 Table S1 Results of S-plot from OPLS analysis |
为了确定两组小鼠已鉴定的代谢物之间是否存在明显差异，我们对上述发现的潜在标志代谢物的相对积分强度进行了进一步统计分析（图 3）.结果发现，相比对照组血清，WP1066处理小鼠血清的N-甲基烟酰胺显著下调，而顺式乌头酸、草酰乙酸和乙酰胺明显上调.
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图 3 对照和WP1066处理小鼠血清差异代谢物相对积分强度的统计分析.结果以平均值±标准差表示，* p < 0.05 Figure 3 Relative integral values of metabolites in serum of control and WP1066 treated mice. Results expressed as mean±SD, * p < 0.05 |
N-甲基烟酰胺为烟酰胺的初级代谢产物，是由外源的烟酸（niacin）和色氨酸（tryptophan）由烟酰胺在烟酰胺N-甲基转移酶（nicotinamide N-methyltransferase）的作用下，在肝脏中催化生成[15]. N-甲基烟酰胺具有抗炎和抗血栓形成的效应，可以降低局部和全身炎症反应[16, 17].新近研究发现，N-甲基烟酰胺可直接刺激脂肪分解，促进储备能量的动用[18].本研究中JAK/STAT通路抑制引起的N-甲基烟酰胺下调，也表明小鼠能量消耗下降，提示其可能为机体代谢失衡的早期标志物.
草酰乙酸可由丙酮酸盐（pyruvate）通过三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle）的回补反应转化而来.在三羧酸循环的上游部分，在顺乌头酸酶（aconitase）的作用下，柠檬酸盐转化为异柠檬酸盐，顺式乌头酸为此过程的中间产物[19].本研究发现，抑制JAK/STAT通路可引起血清顺乌头酸水平显著上升，推测可能是过度激活顺乌头酸酶的结果.研究表明，线粒体顺乌头酸酶的激活和积聚可导致线粒体功能失衡[20]，提示JAK/STAT通路过度抑制可能影响机体能量代谢.此外，三羧酸循环为细胞代谢促进生物合成和细胞能量产生的关键过程[19]，顺式乌头酸和草酰乙酸均为三羧酸循环的产物.本研究中这两种物质在血清中的水平显著上调，提示抑制JAK/STAT通路可促进三羧酸循环和能量生成.
3 结论本实验应用1H NMR研究了JAK/STAT通路抑制剂对小鼠血清代谢组的影响，在1H NMR谱图中鉴定出系列代谢物，使用多变量数据分析鉴定出的差异代谢物改变均与能量合成分解代谢密切相关，表明过度抑制JAK/STAT通路可能引起代谢失衡，包括能量合成增加、脂肪分解代谢减少.
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