2018, Vol. 35 
2. 中国科学院大学, 北京 100049
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
脑是动物体内最复杂的器官，由数目庞大、形态及功能各异的神经元和其他细胞组成，通过不同的神经元和神经网络主导着情感、节律、认知、记忆、想象和意识等活动[1].研究和认识大脑是治疗神经精神疾病，模拟大脑功能，优化人工智能等工作的基础.随着尼氏染色[2, 3]、乙酰胆碱酯酶染色[4, 5]和免疫组织化学染色[6, 7]等神经组织显色方法的出现和成熟应用，人们已经对大鼠、小鼠等多种模式动物的大脑区域结构有了比较详细的了解，并且绘制完成了这些动物较为精准和详细的标准图谱[8, 9].目前其他物种包括树鼩[10]、猕猴、甚至人脑在内的图谱绘制工作也在不断的完善.脑图谱的建立为脑科学研究提供了极大的便利，随着神经染色技术的进一步发展和新一代神经环路标记技术[11-18]以及磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)技术[19, 20]的大量应用，人们通常需要研究不同的分子表达水平、细胞数目以及荧光信号强度等在不同脑区的分布情况，并对其进行量化和比较，从而了解大脑的组成结构和细胞的分布特性.
对已有脑片图像进行精确区域划分的效果非常关键，其直接影响着细胞或信号在不同脑区分布强度的统计结果，进而可能影响整体的研究结论，但是在实际研究中，这一操作过程也存在一些技术难点.目前常用的手段之一就是参照标准图谱，在脑片图像上人工识别各个脑区结构，并对各个脑区的轮廓进行手动描绘，这种方法适应性较强也较为准确，可用于处理具有不同成像效果和存在不同形变的样本图片.但手工绘制需要依靠个人经验进行判断，标准不一且存在主观差异，同时耗时耗力，只能适用于少量样本的操作，不适应于对大量样本的规模化处理.目前，人们也发展出了利用专业软件对脑片图像的各个区域进行自动识别和分割的方法[21-23]，这极大的方便了对大规模样本的批量处理和分析，但是这些方法或者需要购买比较昂贵的商业化软件，或者需要自己编写比较复杂的算法程序，对于大多数神经科学研究者而言不太容易直接获取.此外，实际情况中大部分的脑片图像由于动物个体差异或者样本制作过程中的误差和形变等原因，其结构通常存在较大的差别，很难与标准图谱进行直接匹配，一些变形较大的脑片样本在利用软件进行自动化批量处理时通常存在难度，或者容易导致匹配准确度不高.因此，目前仍然缺乏比较简便易行的规模化的脑区划分和信号量化分析方法.
基于以上的研究需求，我们利用Paxinos和Franklin[24]的第二版小鼠图谱和常用的图像处理软件Photoshop(Adobe Systems Incorporated)和ImageJ(National Institutes of Health)等，发展了一种简易的脑片图像的半自动区域划分及细胞计数方法，并且结合神经工具病毒标记小鼠神经网络的实际案例，展示了利用该方法实现对荧光标记的小鼠脑切片图像进行脑区划分和亚区细胞计数的详细过程.该方法操作简单、精准快速、可半自动化地进行脑片配准，可为脑科学研究工作提供极大的便利.
1 实验部分 1.1 嗜神经工具病毒注射所有的动物实验程序均由中国科学院武汉物理与数学研究所动物护理和使用委员会批准.实验动物采用8周龄成年C57BL/6小鼠(湖南斯莱克景达实验动物有限公司).实验前先麻醉小鼠，麻药采用5%水合氯醛，并按400 mg/kg.bw的比例给药.待小鼠完全麻醉后(轻掐小鼠尾尖无反应)，将其固定于小鼠适配器，并最终连接在脑立体定位仪(RWD，68030，68025)上.用75%酒精对小鼠头皮进行消毒，随后用手术刀片在小鼠头顶皮肤切开一条长约1 cm的创口，用卫生棉球擦掉头骨表面软组织，完全暴露头骨.准备一支10 μL的微量进样器和一根拉制好的玻璃电极，分别灌注并充满液体石蜡，将玻璃电极缓慢套在微量进样器的尖端并用热熔胶密封接口处.将注射针连接在注射泵(Stoelting)上，设置参数，吸取1 μL的日本脑炎病毒[25](Japanese Encephalitis Virus，JEV)，参照小鼠脑图谱中查到的三维坐标(A-P：1.70；M-L：1.10；D-V：-3.80)，并以恒定的速度(50 nL/min)将病毒注射到目标脑区丘脑腹后内侧核(Ventral Posteromedial Thalamic Nucleus，VPM)处.注射完成后，停针10 min(防止病毒倒吸)，然后将注射针缓慢拔出.最后对小鼠头部创面进行酒精消毒，缝合伤口后放回笼中饲养.
1.2 取材及样本制备待病毒在小鼠脑内表达7.5天后，将小鼠过量麻醉(5%水合氯醛，600 mg/kg.bw)，然后分别用0.9%的生理盐水和4%的多聚甲醛溶液对小鼠进行心脏灌流.取出小鼠脑组织，用4%的多聚甲醛溶液浸泡过夜.利用振荡切片机(Leica V1000)对小鼠脑组织进行切片，每片厚度为30 μm.将切好的脑片收集并转入在装有磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution，PBS)的24孔板中保存.
1.3 免疫组化及共聚焦成像挑取目标脑片，用PBS清洗3遍，每遍5 min，然后加入10%的羊血清并在37 ℃恒温培养箱中孵育.1 h后取出，吸去羊血清，加入兔来源的一抗(抗JEV病毒蛋白)，4 ℃冰箱孵育.24 h后，用PBS清洗脑片3遍，每遍5 min，然后加入二抗(羊抗兔cy3)，37 ℃恒温培养箱中孵育1 h.完成后用4', 6-二脒基-2-苯基吲哚(4', 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色，后用PBS清洗脑片3遍，每遍5 min.将脑片贴于载波片上，70%甘油封片.利用共聚焦显微镜(Leica SP8)对脑片分别进行蓝绿红三色通道荧光成像，并按Tiff格式导出图片.
2 结果与讨论 2.1 嗜神经工具病毒JEV标记小鼠大脑神经网络JEV是一种能感染神经元并沿着神经环路增殖传播的嗜神经工具病毒，利用其可以标记大脑神经网络的特性，将可表达荧光蛋白的JEV病毒注射到小鼠大脑VPM区域，随着病毒在脑内的增殖和传播，其携带的荧光蛋白可特异性的标记出小鼠大脑内与VPM有关的神经网络如图 1(a)所示.
|
图 1 工具病毒标记大脑神经网络及脑片分区.(a)嗜神经病毒JEV标记大脑神经网络，红色(病毒信号)，绿色(病毒蛋白免疫组化信号)，蓝色(DAPI染色)；(b) Photoshop导入标准模板与脑片图像；(c)和(d)脑片图像半自动配准及分割 Figure 1 Virus label the brain neuron circuits and brain image divison.(a) Neurotropic JEV labels the brain neuron circuits: red (virus signal), green (IHC signal of virus protein), blue (DAPI stain); (b) Photoshop imports standard template and brain image; (c) and (d) are Brain image semi-automatic registion and division |
JEV标记的小鼠脑片图像清楚地展示了与VPM相连的神经元的形态和分布，但若要进一步了解与VPM接收、处理和发送信息相关的大脑神经网络和功能亚区，则需要对被标记的神经元在各个功能亚区的分布情况进行分析.利用Paxinos和Franklin的第二版小鼠图谱和常用的图像处理软件Photoshop，可以实现对荧光标记的小鼠脑切片图片进行简易快速的半自动区域划分.
2.2.1 Photoshop导入标准模板与脑片图像(1) 根据脑片图像的轮廓特征选取小鼠脑立体定位图谱中与之对应位置的标准模板.依次在Photoshop中打开(打开标准模板时可以选取较高的分辨率，利于图像在放大时还能保持较高的清晰度).
(2) 裁剪脑片图像和标准模板周围多余的部分，并利用魔棒工具删除标准模板外围多余的线条(可将经此步骤处理后的标准模板另存下来，下次可直接套用).
(3) 依次点击“图像-图像大小”，对比标准模板和脑片图像的大小，并调整标准模板使其和脑片图像大小保持一致[图 1(b)].
2.2.2 脑片图像半自动配准及分割(1) 选中标准模板，使用魔棒工具点击图上任意一处空白处，此时图上显示为虚线框，然后依次“右键-选取相似-右键-选择反向-‘Ctrl + C’”，复制标准模板的线条轮廓.
(2) 选中脑片图像，“Ctrl + V”粘贴标准模板到脑片图像上.
(3) 此时可以看到脑片图像上出现黑色线条轮廓的标准模板，依次点击“图像-调整-反相”，黑色的标准模板转为白色，如图 1(c)和1(d)所示.
2.2.3 匹配和局部调整(1) 微调配准，依次点击“编辑-变换-变形”，鼠标左键小幅拖动并调整脑片图像与标准模板的契合度，重点调节需要进行统计的感兴趣区域，然后应用变形.注意，该步骤只能在确保整体轮廓大幅匹配的情况下，对小区域进行小幅度调整，不可过大改变标准模板的形状，避免引入误差.
(2) 应用变形模式，拼合图层图像(也可不拼合图层，直接另存，方便下次修改)，根据需要另存格式，如图 2(a)所示.
|
图 2 局部调整及脑片分区效果.(a)局部调整；(b)脑片分区效果 Figure 2 Local adjustment and brain image divison effect. (a) Local adjustment; (b) Brain image divison effect |
由图中可见，脑片图像与标准模板的配准程度较高，基本轮廓形状重叠，且标准模板将脑片图像自动分为若干亚区，每个亚区之间界限清晰，且可以改变分隔线条的颜色及粗细，并不会影响细胞信号的识别及统计，如图 2(b)所示.
2.3 脑片图像多区域细胞计数通过对大脑内不同脑区的分子表达水平、细胞数目以及荧光信号强度等进行量化分析和比较，可以了解大脑的基本组成结构和某些细胞的分布特性.利用数据图像处理软件ImageJ对经过脑区划分后的脑片图像进行细胞计数，可准确快速高效的对脑片图像的多个区域，多种类型的细胞或信号进行统计及分析.
多区域细胞计数的具体步骤如下：
(1) ImageJ软件打开配准及分割后的脑片图像.
(2) 依次点击“Plugins-Analyze-Cell Counter-Cell Counter-Initialize”，选择“Type1”，将图片拖至需要统计的目标区域，放大，然后选择吸管工具点选目标区域中的细胞，此时软件自动完成对选中的细胞完成计数并标记颜色.依次“Type2”点击细胞，“Type3”点击细胞(若需计数的区域太多，可通过点击“Add”来增加“Type”数量)……直至将所需统计的区域或细胞类型统计完.
(3) 当所有需要统计的区域或细胞点击完之后，点击“Results”(或可直接观察相应“Type”后面的数字)，即可展示统计结果，如图 3(a)~(e)所示.
|
图 3 多区域细胞计数.(a)~(e)分别为步骤演示 Figure 3 Popyzonal cell counting. (a)~(e) Steps show |
(4) 点击“Save Makers”进行保存，即可将计数后的脑片图像中的各项参数(信号的位置、数量等)信息以“Makers”的形式保存下来.后期复查时，只需打开相应的脑片图像，点击“Initialize-Load Makers”，然后选中相应的“Makers”文件，并“打开”，即可显示最初计数后的各项参数(有时会出现打开“Makers”后脑片图像没有变化的现象，这是因为“Cell Counter”操作面板上的“Type”数量不足，只需点击“Add”来增加“Type”数量，即可显示参数).
2.4 讨论在脑科学的研究中，对脑组织切片图像进行规模化的脑区划分和信号量化分析是了解大脑的组成结构和细胞的分布特性的关键步骤之一.我们基于Paxinos和Franklin的第二版小鼠图谱以及Photoshop和ImageJ等图像处理软件，发展了一种简易的脑片图像的半自动区域划分及细胞计数方法，并且结合神经工具病毒标记小鼠神经网络的实际案例，展示了利用该方法实现对荧光标记的小鼠脑切片图像进行脑区划分和亚区细胞计数的详细过程.此方法适用于脑片免疫组织化学分析、神经元分布模式检测及神经环路标记等研究，其操作简便、易于获取、并且不依赖于其他昂贵的商业化的神经图像分析软件，能为条件有限的科研工作者提供极大便利.
2.4.1 与其他脑区分割方法的优劣对比目前常用的脑片区域划分方法主要包括直接手工绘制和利用专业软件自动识别及划分等.本文发展的这种脑片图像的半自动区域划分及细胞计数方法，相较于手工划分区域的方法具有以下特点：更高效且省时省力，可规模化处理脑区划分工作，配准一张脑片的同时可实现对包含的所有脑区的划分；同时不依赖操作者的经验，只需其对大脑结构中的一些地标性结构有所了解即可，能极大的减少主观误差.但是这种方法没有手工划分方法精确.
本文发展的方法与现有的软件自动配准划分方法相比则更易于获取，不依赖于专业的编程知识，而且不需要购买昂贵的商业化软件，可以节约成本；同时该方法可对形变较为严重的脑片样本进行比较精确的配准.但是这种方法没有利用软件自动配准划分方法处理快捷，后者可做大量样本的批量处理.
2.4.2 应用展望这种简易的脑片图像的半自动区域划分及细胞计数方法在处理和分析动物脑组织样本上具有广泛的应用性，除用于分析利用工具病毒示踪神经环路的脑片样本中各个脑区被标记神经元的分布情况之外，还可用于研究转基因动物显色、免疫组化、化学染色等显色结果的各个脑区细胞数量以及荧光强度和密度的分析等.
本文展示了该方法在小鼠脑片样本区域划分和计数中的应用，但是基于已有的大鼠及其它动物的大脑切片图谱，通过同样方式制备这些动物的标准模版，该方法也可用于其他动物脑片图像的脑区划分.
同样的，虽然我们展示的是对冠状切片脑片样本的区域划分，矢状切片脑片样本也可基于矢状切片脑图谱利用此方法实现脑区划分.
2.4.3 应用限制及策略完整脑片样本的区域划分对样本的切片质量有要求，样本切片需尽量保证与标准图谱在同一个冠状切面或者矢状切面水平.如果样本的切片角度与标准冠状面或矢状面差异较大，会导致一张标准脑片模版无法完全覆盖对应脑片图像包含的所有脑区，每个特定脑片图像所包含的脑区可能分别位于不同标准脑片模版的不同区域.这种情况下如果直接对脑片进行区域划分可能会引入误差，此时可通过分别截取不同的标准模版的部分区域，利用此方法对脑片样本的相应区域分别进行配准和划分.
另外，当脑片样本形变比较严重、与标准图谱存在较大差异时，全局匹配的情况下可能某些部分的亚区划分不够精确.同样的，利用此方法对脑片图像进行配准时，对于较大或者结构特征明显的脑区或核团具有较高的准确性及重复性，但是对于较小的脑区或核团，则可能会有一定的误差，因此研究中如果存在比较感兴趣的关注区域或者信号只集中于特定位置时，这种情况下也可只截取标准图谱中的关注区域，对脑片样本的感兴趣区域进行重点匹配、增加脑区划分的精确度.
3 结论综上所述，本文基于Paxinos和Franklin的第二版小鼠图谱，以及Photoshop和ImageJ等图像处理软件，所发展的这一脑片图像区域划分及细胞计数方法，不仅能较为准确地、规模化地配准和划分脑片图像的各个亚区，而且操作简单、易于获取，后期还可在此基础上对各个脑区开展自动或半自动地计数处理，从而对实验数据进行深入地分析和挖掘，可为脑科学研究提供极大的便利.
| [1] |
ZHANG Z J, JIN S, ZHU X T, et al. Advancement in neurotropic virus-mediated trans-synaptic neural circuit tracing[J].
Chinese Bulletin of Life Sciences, 2014, 26(6): 634-644.
张志建, 靳森, 朱续涛, 等. 利用嗜神经病毒跨突触追踪神经网络研究进展[J]. 生命科学, 2014, 26(6): 634-644. |
| [2] | LINDROOS O. Short Nissl staining for incubated cryostat sections of the brain[J]. Biotech Histochem, 1991, 66(4): 208-209. DOI: 10.3109/10520299109109971. |
| [3] | KIERNAN J A, MACPHERSON C M, PRICE A, et al. A histochemical examination of the staining of kainate-induced neuronal degeneration by anionic dyes[J]. Biotech Histochem, 1998, 73(5): 244-254. DOI: 10.3109/10520299809141118. |
| [4] | PAXINOS G, WATSON C R, EMSON P C. AChE-stained horizontal sections of the rat brain in stereotaxic coordinates[J]. J Neurosci Methods, 1980, 3(2): 129-149. DOI: 10.1016/0165-0270(80)90021-7. |
| [5] | OSEN K, MUGNAINI E, DAHL A, et al. Histochemical localization of acetylcholinesterase in the cochlear and superior olivary nuclei. A reappraisal with emphasis on the cochlear granule cell system[J]. Arch Ital Biol, 1984, 122(3): 169-212. |
| [6] | COONS A H, CREECH H J, JONES R N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group[J]. P Soc Exp Biol Med, 1941, 47(2): 200-202. DOI: 10.3181/00379727-47-13084P. |
| [7] | STERNBERGER L A, HARDY JR P H, CUCULIS J J, et al. The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry preparation and properties of soluble antigen-antibody complex (horseradish peroxidase-antihorseradish peroxidase) and its use in identification of spirochetes[J]. J Histochem Cytochem, 1970, 18(5): 315-333. DOI: 10.1177/18.5.315. |
| [8] | PAXINOS G, WATSON C. The rat brain in stereotaxic coordinates[M]. San Diego: Academic Press, 1998. |
| [9] | FRANKLIN K B, PAXINOS G. The mouse brain in stereotaxic coordinates[M]. 3rd ed. San Diego: Academic Press, 2007. |
| [10] | ZHOU J N, NI R J. The tree shrew (tupaia belangeri chinensis) brain in stereotaxic coordinates[M]. Singapore: Springer, 2016. |
| [11] | BETLEY J N, STERNSON S M. Adeno-associated viral vectors for mapping, monitoring, and manipulating neural circuits[J]. Hum Gene Ther, 2011, 22(6): 669-677. DOI: 10.1089/hum.2010.204. |
| [12] | BEIER K T, SAUNDERS A, OLDENBURG I A, et al. Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(37): 15414-15419. DOI: 10.1073/pnas.1110854108. |
| [13] | WICKERSHAM I R, FINKE S, CONZELMANN K K, et al. Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus[J]. Nat Methods, 2007, 4(1): 47-49. DOI: 10.1038/nmeth999. |
| [14] | TERVO D G, HWANG B Y, VISWANATHAN S, et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons[J]. Neuron, 2016, 92(2): 372-382. DOI: 10.1016/j.neuron.2016.09.021. |
| [15] | RINAMAN L, SCHWARTZ G. Anterograde transneuronal viral tracing of central viscerosensory pathways in rats[J]. J Neurosci, 2004, 24(11): 2782-2786. DOI: 10.1523/JNEUROSCI.5329-03.2004. |
| [16] | POMERANZ L E, REYNOLDS A E, HENGARTNER C J. Molecular biology of pseudorabies virus:impact on neurovirology and veterinary medicine[J]. Microbiol Mol Biol R, 2005, 69(3): 462-500. DOI: 10.1128/MMBR.69.3.462-500.2005. |
| [17] | ARENKIEL B R, EHLERS M D. Molecular genetics and imaging technologies for circuit-based neuroanatomy[J]. Nature, 2009, 461(7266): 900-907. DOI: 10.1038/nature08536. |
| [18] | SUN N, CASSELL M, PERLMAN S. Anterograde, transneuronal transport of herpes simplex virus type 1 strain H129 in the murine visual system[J]. J Virol, 1996, 70(8): 5405-5413. |
| [19] |
WU R Q, LI B, LIU Y, et al. Current state and future of optogenetic functional magnetic resonance imaging[J].
Chinese J Magn Reson, 2014, 31(2): 295-305.
吴瑞琪, 李博, 刘悦, 等. 光激活磁共振脑功能成像的研究现状及前景[J]. 波谱学杂志, 2014, 31(2): 295-305. |
| [20] |
YANG L Q, LIN F C, LEI H. Resting state functional connectivity in brain studied by fMRI approach[J].
Chinese J Magn Reson, 2010, 27(3): 326-340.
杨丽琴, 林富春, 雷皓. 静息状态下脑功能连接的磁共振成像研究[J]. 波谱学杂志, 2010, 27(3): 326-340. |
| [21] | WEISSBOURD B, REN J, DELOACH K E, et al. Presynaptic partners of dorsal raphe serotonergic and GABAergic neurons[J]. Neuron, 2014, 83(3): 645-662. DOI: 10.1016/j.neuron.2014.06.024. |
| [22] | POLLAK DOROCIC I, FURTH D, XUAN Y, et al. A whole-brain atlas of inputs to serotonergic neurons of the dorsal and median raphe nuclei[J]. Neuron, 2014, 83(3): 663-678. DOI: 10.1016/j.neuron.2014.07.002. |
| [23] | OGAWA S K, COHEN J Y, HWANG D, et al. Organization of monosynaptic inputs to the serotonin and dopamine neuromodulatory systems[J]. Cell Rep, 2014, 8(4): 1105-1118. DOI: 10.1016/j.celrep.2014.06.042. |
| [24] | PAXINOS G, FRANKLIN K B. The mouse brain in stereotaxic coordinates[M]. 2nd ed. San Diego: Academic press, 2001. |
| [25] | JIA F, ZHU X T, XU F Q. A single adaptive point mutation in Japanese encephalitis virus capsid is sufficient to render the virus as a stable vector for gene delivery[J]. Virology, 2016, 490: 109-118. DOI: 10.1016/j.virol.2016.01.001. |