2018, Vol. 35 
药品的安全性、药物的效能及不良反应等与药物及药物杂质的结构都密不可分.药物及药物杂质结构的确定对其合成机理、合成工艺、规避副反应、药性、副作用等一系列相关研究的重要性不言自明[1].核磁共振（NMR）技术在有机化合物结构分析鉴定中具有不可替代的重要位置，化学位移、峰型、峰面积、偶合常数、氢-氢（1H-1H）和碳-氢（1H-13C）二维相关谱可提供药物及药物杂质构象等有效信息，对于关联、理解、解释药物及药物杂质的药物活性及副作用大有帮助[2, 3].药物分子通常化学结构较为复杂，化学位移较为相近，同时构象也会对化学位移产生不同程度的影响.因而，要做到对药物化合物1H和13C NMR数据的详尽归属，不仅需要1D NMR谱图，也需要2D NMR数据[4-7].
二氢苯并呋喃的衍生物和5-H4受体拮抗剂——普卡必利（prucalopride），又名4-氨基-5-氯-2, 3-二氢-N-[1-(3-甲氧基丙基)-4-哌啶基]-7-苯并呋喃甲酰胺[8, 9]，能够显著改善肠道运转.普卡必利作为治疗慢性便秘药物，于2009年在欧盟获批上市[10, 11].目前，关于普卡必利的合成及药理研究报道[12-17]较多；多数文献只将其1H和13C NMR数据进行罗列，或者对其特征信号峰进行标注[18-22]，并没有对其1H和13C NMR信号进行详尽归属.本文首先以4-氨基-5-氯-2, 3-二氢苯并呋喃-7-羧酸和1-(3-甲氧基丙基)-4-哌啶胺为原料，通过酰胺缩合反应合成了普卡必利；然后应用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）和液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）对其元素组成进行了确认；继而利用液体1D和2D NMR谱（包括1H NMR、13C NMR、DEPT135、DEPT90、1H-1H COSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC），对普卡必利的1H和13C NMR信号进行了详尽的归属，确定了其结构.
1 实验部分 1.1 仪器与试剂UPLC-MS/MS测试是在QTRAP 5500型串联四极杆质谱系统上完成的. LC-HRMS在H-Class/Xevo G2-S QTof型超高效液相色谱/四极杆飞行时间串联质谱仪上进行测试. 1H NMR、13C NMR、DEPT、1H-1H COSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC谱图均在Bruker Avance Ⅲ-400型超导NMR谱仪测定，使用PABBO-5 mm多核宽带探头.
普卡必利经改进文献[20]和[22]方法合成，4-氨基-5-氯-2, 3-二氢苯并呋喃-7-羧酸、1-(3-甲氧基丙基)-4-哌啶胺和N, N'-羰基二咪唑及四氢呋喃等试剂均购于Sigma-Aldrich公司.直径5 mm的NMR样品管（ST-500，NORELL）、CDCl3（99.8%氘代）、D2O（99.8%氘代）和DMSO-d6（99.8%氘代）均购于青岛腾龙微波科技有限公司.
1.2 实验条件NMR测试温度为（293.0±0.1）℃，分别使用CDCl3、D2O和DMSO-d6为溶剂，以四甲基硅烷（TMS）为内标. 1H NMR和13C NMR的工作频率分别为400.13和100.76 MHz. 1H NMR的谱宽为9.18 kHz，采样点数为32 768，90˚脉冲宽度为11 μs，弛豫延迟为1.2 s；13C NMR的谱宽为25 kHz，采样点数为16 384，90˚脉冲宽度为8.8 μs，弛豫延迟为1.2 s. DEPT135、DEPT90采用仪器自带的标准脉冲序列，谱宽为16 129.0 Hz，采样累加次数为256. 1H-1H COSY、1H-13C HSQC及1H-13C HMBC谱的采集均采用标准脉冲程序，采用反向检测探头. 1H-1H COSY的F2（1H）和F1（1H）维的谱宽均为6 009.61 Hz，采样数据点阵t2×t1=2 048×256，每个t1增量累加2次，弛豫延迟为1.0 s；HSQC的F2（1H）和F1（13C）维的谱宽分别为6 398.86 Hz和22 136.58 Hz，采样数据点阵t2×t1=2 048×256，d2=1/(2JCH)=3.45 ms（JCH为一键碳-氢偶合常数），每个t1增量累加2次，弛豫延迟为1.2 s；HMBC的F2（1H）和F1（13C）维的谱宽分别为6 393.86 Hz和22 138.80 Hz，采样数据点阵t2×t1=4 096×256，d6=1/(2nJCH)=62.5 ms（nJCH为远程碳-氢偶合常数），每个t1增量累加12次，弛豫延迟为1.2 s.
2 结果与讨论 2.1 普卡必利的合成[20, 22]改进参考文献方法，室温下，氮气保护，向250 mL三口烧瓶中加入4-氨基-5-氯-2, 3-二氢苯并呋喃-7-羧酸（2.0 g，9.36 mmol），经过三次抽真空和置换氮气，再注入30 mL现蒸的干燥四氢呋喃（THF），搅拌0.5 h，加入N, N'-羰基二咪唑（2.0 g，12.17 mmol），继续搅拌反应0.5 h.滴加1-(3-甲氧基丙基)-4-哌啶胺（2.08 g，12.16 mmol）的THF溶液（20 mL），用50 ℃水浴加热反应5.0 h.真空蒸去有机溶剂，加入50 mL蒸馏水，室温下搅拌1.0 h，过滤，滤饼用蒸馏水洗（3×20 mL），真空干燥至恒重，得2.9 g白色固体普卡必利，产率为82%，熔点（mp.）为90~92 ℃.
2.2 普卡必利的质谱分析在正离子检测模式下，经UPLC分离和电喷雾离子源电离后的普卡必利MS/MS质谱图显示检测得到质荷比（m/z）为367.99的离子峰[图 2(a)]，推测其为[M+H]+；同时得到m/z=195.89的主要碎片峰，根据普卡必利化合物结构中存在酰胺键，相对其它化学键，酰胺键作用力比较弱，在高温和水存在时均容易断裂，推测其为4-氨基-5-氯-2, 3-二氢苯并呋喃-7-羰基正离子.普卡必利的HRMS谱图[图 2(b)]显示在正离子检测模式下得到m/z=368.173 8的离子峰，推测其为[M+H]+，与普卡必利（分子式为C18H26ClN3O3）的理论分子量367.874 0一致.
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图 1 普卡必利的化学合成 Figure 1 Synthesis of prucalopride |
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图 2 普卡必利的(a)超高效液相色谱-串联质谱和(b)液相色谱-高分辨质谱 Figure 2 UPLC-MS/MS (a) and LC-HRMS (b) spectra of prucalopride |
化合物普卡必利结构中存在两种活泼氢，为了判断酰胺NH和芳环上NH2两种活泼氢的信号峰.首先以CDCl3和DMSO-d6为溶剂分别进行1H NMR测试（图 3），同时对DMSO-d6为溶剂的1H NMR进行重水交换实验.当以CDCl3为溶剂时，通过分析信号峰的化学位移、峰型及其对应的积分面积，推测δH 7.29（1H, s）和δH 4.28（2H, s）分别为酰胺NH和芳环上的NH2.在DMSO-d6为溶剂的1H NMR谱图中，推测δH 5.88（2H, s）和δH 7.30（1H, d, J=8.0 Hz）分别对应芳环上NH2和酰胺NH；当向DMSO-d6为溶剂样品中加入D2O后，δH 5.88（2H, s）处NH2的信号基本消失，同时酰胺NH的化学位移往低场移动，出现在δH 7.39（1H, d, J=8.0 Hz）.上述结果也说明在不同氘代溶剂中，活泼氢的化学位移具有不确定性（图 3），在接下来文中所述的化学位移均以CDCl3为溶剂测试所得，包括所有二维谱.
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图 3 普卡必利在CDCl3、DMSO-d6和DMSO-d6+D2O中的1H NMR谱 Figure 3 1H NMR spectra of prucalopride in CDCl3, DMSO-d6 and DMSO-d6+D2O |
根据化学位移、积分面积和谱峰裂分情况，δH 3.33（3H, s）归属为H-15；H-9与酰胺氮原子相连，受到去屏蔽效应的作用，其化学位移向低场移动，δH 3.99（1H, m）归属为H-9；由于2, 3-二氢苯并呋喃环的存在，呋喃环上OCH2（H-2）化学位移应向低场移动，即δH 4.76（2H, t, J=8.8 Hz）归属为H-2，与文献[13, 18, 22]相符；由于氯原子的吸电子效应，苯环H-6的化学位移值向低场移动，δH 7.84（1H, s）归属为苯环H-6.
由普卡必利13C NMR和DEPT谱（图 4），可确定它含1个伯碳（δC 58.6）、7个仲碳（δC 27.1、27.3、33.2、52.4、55.5、71.2、72.8）、2个叔碳（δC 46.2、130.0）和6个季碳（δC 107.5、110.8、112.0、142.8、157.2、163.1）.结构复杂时需借助HSQC和HMBC谱进行归属[23]，在此亦然.
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图 4 普卡必利的13C NMR和DEPT谱（CDCl3） Figure 4 13C NMR and DEPT spectra of prucalopride (CDCl3) |
所有2D NMR谱均以CDCl3为溶剂测试所得.从普卡必利的1H-1H COSY谱（图 5）得知，δH 3.05（2H, t, J=8.8 Hz）与H-2存在交叉峰，归属为H-3.由于分子内刚性哌啶环结构的存在，导致H-10a与H-10b、H-11a与H-11b质子不等价，δH 1.57（2H, m）和δH 1.99（2H, m）与H-9在COSY谱中存在交叉峰，归属为H-10a和H-10b. δH 2.16（2H, t, J=11.2 Hz）和δH 2.83（2H, d, J=10.8 Hz）与H-10存在交叉峰，归属为H-11a和H-11b.通过上述解析，对普卡必利质子的化学位移进行了部分归属，尚余H-12、H-13和H-14未归属，要借助HMBC谱.
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图 5 普卡必利的1H-1H COSY NMR谱（CDCl3） Figure 5 1H-1H COSY NMR spectrum of prucalopride (CDCl3) |
由普卡必利的HSQC谱（图 6）可以看到δC 72.8与H-2相关，归属为C-2；δC 27.1与H-3相关，归属为C-3；δC 130.0与H-6相关，归属为C-6；δC 46.2与H-9相关，归属为C-9；δC 33.2与H-10a、H-10b均有相关，归属为C-10；δC 52.4与H-11a、H-11b均有相关，归属为C-11；δC 58.6与H-15相关，归属为C-15.余下3个仲碳（δC 27.3、55.5、71.2）和6个季碳（δC 107.5、110.8、112.0、142.8、157.2、163.1）未归属，还需要借助于HMBC谱.
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图 6 普卡必利的1H-13C HSQC谱（CDCl3） Figure 6 1H-13C HSQC spectrum of prucalopride (CDCl3) |
普卡必利的1H-13C HMBC谱（图 7）中，δC 110.8与H-2、H-3和NH2均有交叉峰，归属为C-3a；δC 142.8与H-6和H-3均有交叉峰，归属为C-4；δC 112.0与H-6和NH2均有交叉峰，归属为C-5，δC 107.5处信号峰与H-6相关，归属为C-7；δC 157.2处信号峰与H-2，H-3和H-6相关，归属为C-7a；而C-8是羰基碳，是体系中所有化学位移最低场的，因此δC 163.1归属为C-8.
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图 7 普卡必利的1H-13C HMBC局部放大谱（CDCl3） Figure 7 Partial enlarged 1H-13C HMBC spectrum of prucalopride (CDCl3) |
HMBC谱上C-15仅与δH 3.42（2H, t, J=6.4 Hz）存在交叉峰，因此将δH 3.42（2H, t, J=6.4 Hz）归属为H-14，HSQC谱上δC 71.2与H-14相关，归属为C-14；C-14与H-12和H-13均存在交叉峰，C-12直接与氮原子相连，受到去屏蔽效应的作用，与C-13相比化学位移处于低场，同时，C-12与H-11、H-13和H-14均存在交叉峰，因此将δH 2.42（2H, t, J=7.2 Hz）归属为H-12，δH 1.78（2H, m）归属为H-13.从HSQC谱上可以看出，δC 27.3与H-13相关，归属为C-13；δC 55.5与H-12相关，归属为C-12；再看COSY谱，H-13与H-12和H-14均存在交叉峰，H-14与H-13存在交叉峰，H-12与H-13存在交叉峰，进一步验证了上述归属的正确性.
通过对普卡必利的1H NMR、13C NMR、DEPT135、DEPT90、1H-1H COSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC谱的分析，并且结合文献[13, 18, 22]，对普卡必利的已见报道但未进行分析归属的1H NMR和13C NMR信号进行了全部指认归属，结果见表 1.
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表 1 普卡必利的1H NMR和13C NMR归属（CDCl3） Table 1 The 1H NMR and 13C NMR assignment of prucalopride (CDCl3) |
首先改进文献方法合成了普卡必利，然后综合运用UPLC-MS/MS和LC-HRMS对普卡必利进行了元素组成分析，进而运用液体1D和2D NMR技术，特别是1H-13C HMBC谱有效的呈现了碳-氢远程偶合的信息，揭示了不同的屏蔽效应，对普卡必利的1H和13C NMR信号进行了分析和准确的归属，确定了其结构.本工作对苯并呋喃衍生物及相关下游药物合成工艺的进一步优化，以及相关衍生药物的研究具有参考价值.
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