2018, Vol. 35 
2. 辽宁省中药单体原料及制剂工程技术研究中心, 辽宁 大连 116000
2. Liaoning API and Formulation of Traditional Chinese Medicine Monomer Engineering Technology Research Center, Dalian 116000, China
连翘脂素（phillygenin），又称连翘苷元，主要存在于木犀科（Oleaceae）连翘属（Forsythia）的植物连翘[Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl]中，为含双骈四氢呋喃环的木脂素类化合物，具有清除自由基、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等药理活性.例如连翘脂素可强力清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH）[1]；抑制低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的氧化作用[2, 3]；抑制脂多糖诱导小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW 264.7）产生一氧化氮[4]；抑制环腺苷磷酸二酯酶的活性[5]；减轻亚硝酸盐诱导的猪肾近曲小管上皮细胞（LLC-PK1）损伤，预防过氧亚硝酸盐阴离子引发的相关疾病[6]；保护由四氯化碳诱导的大鼠急性肝损伤[7]；治疗牛血清蛋白诱导的大鼠免疫性肝纤维化[8]；对人肝癌细胞（SMMC-7721）和小鼠黑色素肉瘤细胞B16均有体外抑制活性[9, 10].
非甾体抗炎药（NSAID）布洛芬（ibuprofen）通过抑制环氧合酶-2（COX-2）进而抑制前列腺素的合成，缓解炎症反应和疼痛；通过作用于下视丘体温调节中枢引起外周血管扩张，皮肤血流增加出汗，起到解热作用.由于布洛芬还会抑制环氧合酶-1（COX-1），长期服用会产生恶心、呕吐、胃溃疡、胃出血、肾损伤等不良反应.因此将布洛芬制成前药不但会增加布洛芬的治疗指数，也会提高患者顺应性.
本文以连翘脂素和布洛芬为原料，通过Schotten-Baumann酯化反应合成了布洛芬酯类前药——连翘脂素-布洛芬酯（图 1）.有文献[11, 12]显示布洛芬酯类前药在体内分解为原药后，既降低了布洛芬的副作用，又起到协同治疗作用.通过SciFinder数据库检索，未发现其结构，由此判定为新的未报道的化合物.
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图 1 连翘脂素-布洛芬酯的结构 Figure 1 The structure of ibuprofen-phillygenin ester |
本文测定了连翘脂素-布洛芬酯的紫外吸收光谱（UV）、红外吸收光谱（IR）、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS），以及多种1D和2D核磁共振（NMR）波谱（包括1H NMR、13C NMR、DEPT135、DEPT90、1H-1H COSY、1H-1H NOESY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC），对其进行了结构确证，并对其1H和13C NMR数据进行了全归属.
1 实验部分 1.1 仪器与试剂IR光谱用PE Spectrum-100傅里叶变换红外光谱仪（PerkinElmer Inc.，美国）测定，KBr压片；UV光谱用PE.Lambda35紫外分光光度计（PerkinElmer Inc.，美国）测定；高分辨质谱用IonSpec 7.0 T傅里叶变换离子回旋共振质谱仪（FT-ICR-MS，Varian, Inc.，美国）测定；NMR实验在Bruker Avance Ⅲ HD 600型超导NMR谱仪（Bruker，瑞士）上测定，配备5 mm z梯度三共振反式低温探头.
1.2 样品合成 1.2.1 布洛芬酰氯的合成称取布洛芬（2.06 g，0.01 mol）置于三口瓶内，溶于40 mL二氯甲烷；向三口瓶内加入酰基化试剂氯化亚砜（11.9 g，0.1 mol），室温（20 ℃）下反应15 h；减压蒸发去除二氯甲烷，即得到布洛芬酰氯.
1.2.2 连翘脂素-布洛芬酯的合成称取连翘脂素（3.72 g，0.01 mol）于装有200 mL丙酮溶剂的三口瓶中，加入碳酸钾（1.5 g，0.01 mol），然后向三口瓶中滴加制备的布洛芬酰氯（2.24 g，0.01 mol）；在搅拌状态下加热至60 ℃，并在60 ℃温度下进行酯化反应15 h；将酯化反应后的反应混合物降温至室温（20~25 ℃），过滤，去除固体残渣，滤液进行减压回收丙酮溶剂；将回收溶剂后得到的固体溶于二氯甲烷，用水洗涤溶液至中性；用无水硫酸钠进行干燥，减压蒸发去除二氯甲烷溶剂，得到白色固体.所得固体采用石油醚进行重结晶处理，即得连翘脂素-布洛芬酯纯品5.49 g，产率为98%，熔点为110 ℃.利用高效液相色谱（HPLC）测试样品纯度为99.78%，符合结构鉴定所需纯度.合成路线见图 2.
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图 2 连翘脂素-布洛芬酯的合成路线 Figure 2 The synthesis of ibuprofen-phillygenin ester |
样品溶于CDCl3，以四甲基硅烷（TMS）为内标，实验温度为297.9 K.1H和13C NMR的工作频率分别为600.13 MHz和150.92 MHz，谱宽分别为12 335.5 Hz和36 057.7 Hz.DEPT的工作频率为150.92 MHz，谱宽为36 057.7 Hz.2D NMR谱包括1H-1H COSY、1H-1H NOESY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC谱，均采用标准脉冲程序.1H-1H COSY的F2维（1H）和F1维（1H）谱宽均为8 012.8 Hz，采样数据点阵t2×t1=1 024×512；1H-1H NOESY的F2维（1H）和F1维（1H）谱宽均为8 012.8 Hz，采样数据点阵t2×t1=1 024×512；HSQC谱的F2维（1H）和F1维（13C）谱宽分别为8 012.8 Hz和24 998.9 Hz，采样数据点阵t2×t1=1 024×512；HMBC谱的F2维（1H）和F1维（13C）谱宽分别为8 012.8 Hz和24 998.9 Hz，采样数据点阵t2×t1=1 024×512.
2 结果与讨论 2.1 UV光谱分析UV光谱中，203 nm为π→π*反键轨道跃迁特征吸收峰，属于E2吸收带；275 nm为n→π*反键轨道跃迁特征吸收峰，属于R吸收带，符合连翘脂素-布洛芬酯分子结构的特征.
2.2 IR光谱分析IR光谱中，2 867.21 cm-1（-CH2-）表明分子中存在芳环；2 953.73 cm-1（Ar-OCH3）表明分子中含有甲氧基苯结构片段；1 760.11 cm-1（C=O）表明分子中存在羰基；1 606.25 cm-1、1 591.38 cm-1、1 514.46 cm-1（Ar-CH）为苯环骨架振动吸收峰；1 270.57 cm-1、1 042.86 cm-1（Ar-O-C）表明分子中含有为芳基烷基醚，符合连翘脂素-布洛芬酯分子结构的特征.
2.3 高分辨MS谱图分析高分辨MS谱图（图 3）采用MALDI-TOF-MS数据：测得的加钠离子峰[M+Na]+质荷比（m/z）为583.265 40，与理论值（583.266 63）一致，误差为1.23‰.
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图 3 连翘脂素-布洛芬酯的基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱图 Figure 3 MALDI-TOF-MS spectrum of ibuprofen-phillygenin ester |
由13C NMR和DEPT谱图（图 4）表明，该分子结构中含有6个伯碳——δC 18.8、22.5（2C）、56.0、55.9、55.8；3个仲碳——δC 69.8、71.1和45.1；16个叔碳——δC 129.3（2C）、127.5（2C）、122.6、118.1、117.8、111.1、110.0、109.0、87.3、82.0、54.7、50.1、45.0和30.3；9个季碳——δC 172.9、151.4、148.9、148.1、140.6、140.2、139.5、137.4、131.0.
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图 4 连翘脂素-布洛芬酯的DEPT和13C NMR谱图. (a)高场区域；(b)低场区域 Figure 4 DEPT and 13C NMR spectra of ibuprofen-phillygenin ester at (a) high field and (b) low field regions |
连翘脂素布洛芬酯的1H NMR谱中共显示40组质子信号（见图 5），参照Pelter等[13, 14]归属的epi-isomers型木脂素1H NMR信号，δH 4.47（1H, d, J=6 Hz）被归属为H-4.δH 4.86（1H, d, J=4.2 Hz）被归属为H-6.根据COSY谱（见图 6）相关可知，δH 2.88~2.89（1H，m）与H-4相关，被归属为H-3. δH 4.14（1H, d, J=9.6 Hz）在COSY谱中与H-3相关，可能为H-2或H-8ax，因为H-2不可能是双峰，所以被归属为H-8ax.根据NOESY谱（见图 7）相关可知，δH 3.86~3.88（2H, m）与H-6有两个空间相关峰，且在COSY谱中与H-8ax有相关峰，被归属为H-1eq和H-8eq.在COSY谱中，δH 3.32~3.35（2H, m）既与H-3和H-6有相关；又与δH 3.86~3.88（2H, m）有两个相关峰，因此其中一个质子被归属为H-2，另一个质子被归属为H-1ax.
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图 5 连翘脂素-布洛芬酯的1H NMR谱图 Figure 5 1H NMR spectra of ibuprofen-phillygenin ester |
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图 6 连翘脂素-布洛芬酯的1H-1H COSY谱图 Figure 6 1H-1H COSY spectrum of ibuprofen-phillygenin ester |
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图 7 连翘脂素-布洛芬酯的1H-1H NOESY谱图 Figure 7 1H-1H NOESY spectra of ibuprofen-phillygenin ester |
δC 87.4在HSQC谱（图 8）中与H-4相关，HMBC谱（图 9）显示其与H-1和H-8有远程相关，归属为C-4. δC 82.0在HSQC谱中与H-6相关，归属为C-6. δC 71.1在HSQC谱中与H-8相关，归属为C-8. δC 69.8在HSQC谱中与H-1ax和H-1eq相关，HMBC谱显示其与H-6有远程相关，归属为C-1. δC 54.7在HSQC谱中与H-3相关，HMBC谱显示其与H-1有远程相关，归属为C-3.δC 50.1与H-2相关，HMBC谱显示其与H-3、H-4和H-6有远程相关，归属为C-2.
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图 8 连翘脂素-布洛芬酯的HSQC谱图 Figure 8 HSQC spectrum of ibuprofen-phillygenin ester |
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图 9 连翘脂素-布洛芬酯的HMBC谱图 Figure 9 HMBC spectra of ibuprofen-phillygenin ester |
结合文献[15, 16]，δC 172.9为羰基碳，归属为C-27.由于羰基氧γ位的甲基碳化学位移会向高场移动，δC 18.8归属为C-30.δH 1.62（3H, d, J=6.6 Hz）在HSQC谱中与C-30相关，被归属为H-30.δH 3.98（1H, q, J=7.2 Hz）在COSY谱中与H-30相关，被归属为H-28.δC 45.0在HSQC谱中与H-28相关，归属为C-28. δH 7.33（2H, d, J=8.0 Hz）和δH 7.14（2H, d, J=8.0 Hz）构成AA'BB'体系，为对位二取代苯上的质子，应为H-32、H-33、H-35和H-36，由于羧基的吸电子效应降低苯环电子密度，δH 7.33（2H, d, J=8.0 Hz）理论上更靠近低场，暂时被归属为苯环上磁等价质子H-32和H-36.δC 127.5在HSQC谱中与δH 7.33相关，在HMBC谱中与H-28有远程相关，被归属为C-32和C-36，这进一步证明了δH 7.33 (2H, d, J=8.0 Hz)为H-32和H-36.因此，δH 7.14（2H, d, J=8.0 Hz）被归属为H-33和H-35.δC 129.3在HSQC谱中与H-33和H-35相关，被归属为C-33和C-35.δC 137.4在HSQC谱中无相关峰，在HMBC谱中显示其与H-28、H-30、H-33和H-35有远程相关，归属为C-31.δC 140.6在HSQC谱中无相关峰，在HMBC谱中显示其与H-32和H-36有远程相关，归属为C-34.仲碳δC 45.1在HMBC谱中显示其与H-33和H-35有远程相关，归属为C-37.高场区δH 2.48（2H, d, J=6.6 Hz）受邻位质子耦合影响，均裂为双峰，在HSQC中与C-37相关，因此归属为H-37.
δH 1.87（1H，dp, J=13.5/6.8 Hz）在COSY谱中与H-37相关，因此被归属为H-38. δC 30.3在HSQC谱中与H-38相关，归属为C-38. δH 0.92（6H, d, J=6.4 Hz）归属为两组甲基质子H-39和H-40，为磁等价质子. δC 22.5与H-39和H-40直接相关，在HMBC谱中显示其与H-37有远程相关，被归属为C-39、C-40.
低场区谱峰重叠，但是仍能看出δH 6.98（1H, br. s）、δH 6.93（1H, dd, J=2.4/8.0 Hz）、δH 6.96（1H, br. s）、δH 6.89（1H, dd, J=1.6/7.2 Hz），δH 6.84（2H, br. m）构成两组部分重合的ABX偶合体系，为连翘脂素核上的芳香氢，由于羧基的吸电子效应，H-16、H-19和H-20在理论上更靠近低场，因此δH 6.98（1H, br. s）归属为H-16，δH 6.93（1H, dd, J=2.4/8.0 Hz）归属为H-19，δH 6.96（1H, br. s）归属为H-11，δH 6.89（1H, dd, J=1.6/7.2 Hz）归属为H-14，δH 6.84（2H, br. m）则归属为为H-15和H-20.
参考千叶真理子等[17-22]对连翘脂素类化合物芳香区碳原子信号的归属，并结合2D NMR谱图，对部分碳原子归属分析如下：δC 122.6在HSQC谱中与H-19相关，归属为C-19；δC 111.1在HSQC谱中与H-14有相关，又在HMBC谱中与H-15远程相关，归属为C-14，δC 139.5在HSQC谱中无相关峰，HMBC谱显示其与H-4、H-3和H-16有远程相关，可以归属为C-9；δC 131.0在HSQC谱中无相关峰，HMBC谱显示其与H-11和H-15有远程相关，可以归属为C-10；δC 118.1在HMBC谱中与H-4和H-16有远程相关，归属为C-20；δC 110.0在HMBC谱中与H-4和H-20远程相关，归属为C-16；季碳δC 140.2在HMBC谱中与H-16和H-19有远程相关，可以归属为C-18；δC 151.4在HMBC谱中与H-16、H-19和H-20远程相关，归属为C-17；叔碳δC 117.8在HMBC谱中与H-14远程相关，归属为C-15；H-6在HMBC谱中除与C-15相关外，还与δC 109.0远程相关，则δC109.0归属为C-11；季碳δC 148.1在HMBC谱中与H-14和H-15远程相关，归属为C-13；剩余季碳δC 148.9则归属为C-12.
δH 3.72（3H, s）、δH 3.90（3H, s）和δH 3.93（3H, s）为连翘脂素核的三组甲基峰质子，在NOESY谱中，H-16与δH 3.72（3H, s）有空间相关，H-11与δH 3.93（3H, s）有空间相关，H-14与δH 3.90（3H, s）有空间相关，因此归属δH 3.72（3H, s）为H-41，δH 3.93（3H, s）为H-25，δH 3.90（3H, s）为H-26，在HSQC谱中δC 55.8与H-41相关，归属为C-41，而C-25和C-26则不能确切区分.
具体的1H和13C NMR归属见表 1.
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表 1 连翘脂素-布洛芬酯的NMR数据分析（CDCl3, 600 MHz） Table 1 The NMR data analysis of ibuprofen-phillygenin ester (CDCl3, 600 MHz) |
本文以连翘脂素、布洛芬为原料，通过Schotten-Baumann酯化反应合成了连翘脂素-布洛芬酯.运用UV、IR、MALDI-TOF-MS及NMR（包括1H NMR、13C NMR、DEPT、1H-1H COSY、1H-1H NOESY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC）等一系列技术，对连翘脂素-布洛芬酯的结构进行了解析，并对其1H和13C NMR信号进行了归属.
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