2017, Vol. 34 
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 苏州大学附属第二医院, 江苏 苏州 215000
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. The Second Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, China
嗅觉系统在人类和动物感测环境变化，以及对环境做出适当的生理反应等方面起到了很重要的作用，有研究[1]表明，美国至少有300万人患有一定程度的嗅觉损伤，这种嗅觉功能受损通常会由开始的嗅觉功能减弱直至最后完全不能闻到气味.引发嗅觉功能受损的主要原因有：头部创伤、鼻腔或者窦腔疾病、上呼吸道疾病、中风、吸烟和衰老等.近期有报道[2]指出，一些神经退行性疾病，如阿尔兹海默症（AD）、精神分裂症、多发性硬化（MS）、癫痫、帕金森（PD）和强迫症等，在发病早期会伴随嗅觉功能减退的症状.一些研究也在探索使用嗅觉功能障碍作为这些神经疾病的早期诊断标记的可能性，例如阿尔兹海默症、帕金森和强迫症[3].
近年来，针对嗅觉系统的功能性神经成像的研究不断增加，其中功能磁共振成像（fMRI）也逐渐发展为研究热点.随着研究的深入，该方法已经被研究者公认为是研究大脑功能激活的最佳工具，具有不需要向人体注入放射性材料和对人体无伤害性等优点，目前已经广泛用于量化脑激活和嗅觉刺激成像的相关研究[4].在嗅觉系统的研究中，对被试进行嗅觉刺激的方案设计成为研究者们关注的重点.目前市场上成熟的嗅觉刺激器较少，且一般价格高昂，如德国Burghart公司[5]生产的可用于磁共振环境下的OL022型嗅觉刺激器的价格有4.5~24万美元不等，对于很多实验室来说无法承受.所以用于fMRI研究的嗅觉刺激器主要以实验室自制为主，Sobel等[6]在1997年提出了一种适用于磁共振环境的基于空气稀释法的嗅觉刺激装置搭建方案：由气泵产生洁净空气，空气经由控制室内设定好流速的流量计通过装有一定浓度的洗气瓶，最后将刺激气体通入被试鼻腔，此方案使用了刺激气体与洁净空气相互切换的刺激模式，并且实现了部分无磁化，可用于磁共振环境下.除此之外，Vigouroux（2005）[7]、Johnson（2007）[8]、Lundstrom（2010）[9]、Sommer（2012）[10]和Bestgen（2016）[11]等对空气稀释法中气体的产生环节和输送方式进行了优化，提出了改进版的嗅觉刺激装置设计方案.
国内较成熟的刺激装置是由有慧等[12]于2009年搭建完成，该装置在国产OEP-98C型嗅觉诱发电位仪的基础上进行了部分改进，采用开放式气路设计，并使用呼吸带监测被试呼吸状态.在充分调研国内外嗅觉刺激器搭建方案后，本课题组王骁冠等[13]在2014年搭建了一台可用于磁共振环境下且可实现自动控制的嗅觉刺激器，控制系统上位机软件使用LabVIEW编写，下位机控制部分使用电磁阀、继电器等，并通过fMRI实验验证了系统搭建方案的可行性.但是与大多数实验室自制嗅觉刺激器类似，此装置存在以下问题：（1）未对气体流动稳定性进行测量，仅实现了气体输送任务；（2）不同气路之间切换的响应时间不明确，进行刺激实验的过程中可能会引入冲击响应等无关刺激.本文在已验证的设计方案的基础上对支路扩展、优化刺激序列等方面进行了改进，测量了气体流量波动率及气路切换时间等稳定性指标，并通过fMRI嗅觉刺激实验对装置适用性进行了验证.
1 嗅觉刺激装置搭建 1.1 设计方案要求用于fMRI研究的嗅觉刺装置首先应满足以下基本要求[13, 14]：（1）电磁兼容性：MRI仪器工作时会对周围环境造成非常强烈的电磁干扰，而外界对它的轻微电磁干扰也会使其成像质量下降，所以刺激装置处于屏蔽室的部分应采用无磁设计，以避免相互干扰；（2）多路刺激：在1个刺激任务中可实现多种气味刺激，并且具备刺激物种类的扩展性；（3）不引入无关刺激：实验过程中在进行刺激气体切换时，气流的突变往往会引起三叉神经的触觉刺激，同时磁共振扫描环境下噪音较大，也要避免引起听觉刺激；（4）可调节刺激气体强度：现有刺激装置大多使用的是空气稀释法的设计方案，采用空气稀释法搭建的嗅觉刺激器是使用连续流动的洁净空气通入一定浓度的刺激液体中，再将流出的带有气味的气体与洁净空气以某一比例混合，从而实现气味刺激的目的，基于此原理，刺激装置可以通过改变刺激气体与洁净空气混合的比例调节输出气体刺激强度.
除以上基本要求外，在实验室已有装置的基础上[15]，本文提出了以下改进要求：（1）升级附属模块：原有装置使用的是适用于气体流量较大的场合的气路配件，国内适用于小流量气路的电磁阀、流量计等模块较少，所以改进方案将选用美国Cole-Parmer公司的专业气路解决方案；（2）测量系统指标：在实现刺激功能的基础上，对刺激装置提出可量化的系统稳定性指标，为装置后续改进与优化提供参考依据；（3）增加被试数量：功能实验验证部分原有装置仅对1名被试进行刺激实验，结果可信度较低，本次验证将进行8名被试的刺激实验；（4）优化刺激序列：原有装置刺激序列单一气味刺激持续时间较长，实际应用中发现被试会对气味产生一定的适应性，降低对气味的敏感度，故提出间隔式组块设计，避免出现气味适应性的问题.
1.2 装置搭建 1.2.1 整体设计装置采用模块化设计，方案如图 1所示，分为控制系统与气体输送系统两部分.其中控制系统包括信号控制系统与气路控制系统两部分，主要由PC机、继电器、电磁阀等电气元件组成，放置于控制室内.气体输送系统包括洗气瓶、汇流管和鼻氧管等气路配件，其主要作用为进行洁净空气的着味并将生成的刺激气体通向被试鼻腔.洗气瓶1、2、3分别装有乙醇、吡啶、乙酸戊酯，洗气瓶4、5装有纯水.其中，1、2、3、4四条支路为可变支路，主要作用是实现气味刺激与对照刺激；洗气瓶5所在支路为恒流支路.气体输送系统放置于屏蔽室内，方案满足电磁兼容的要求，而且装有刺激液体的洗气瓶距离被试较近，可以保证气路的稳定性，减少气体损失.
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图 1 嗅觉刺激装置整体设计方案 Figure 1 Integrate design of the proposed olfactory stimulator |
实验开始时，手动同时点击MRI仪开始扫描按钮与刺激器启动按钮，下达开启指令后，上位机控制软件运行，电磁阀将按照数据采集卡及继电器传输的刺激序列控制某一气路的开闭.气泵产生的洁净空气将通过设置好流速值的流量计及电磁阀开启的支路进入相应的洗气瓶，经过装有特定刺激溶液的洗气瓶洗气后，刺激支路与恒流支路由汇流管汇合传输至被试鼻腔附近.
1.2.2 控制系统信号控制系统上位机软件是在实验室已有软件基础上使用LabVIEW软件编写[12]，LabVIEW采用图形化编程的G语言，与下位机控制单元中的USB6008数据采集卡均由美国国家仪器公司（NI）开发.与其他控制台相比，LabVIEW软件编程简单、交互方便，与NI公司的数据采集卡配套使用可完成对常规仪器的控制需求，同时LabVIEW还具有快速开发、跨平台的特点，增加了装置的可移动性.上位机软件界面如2所示，主要包括两部分：刺激序列设计界面和刺激序列呈现界面.其中刺激序列设计界面用于输入刺激序列参数，如刺激物种类、刺激开始及持续时间，同时具有刺激信息文件保存功能，可将具体刺激序列信息以.txt文档形式存储；刺激序列呈现界面主要用于显示当前刺激物种类、当前刺激物刺激进度和刺激序列总进度，通过刺激序列呈现界面可查看当前刺激物刺激剩余时间和所有刺激剩余时间.控制软件设计满足了刺激序列输入和刺激序列查看的需求.
信号控制系统下位机主要由采集卡、继电器和滤波电路组成.下位机是刺激序列的具体执行部分，主要实现气路按照刺激序列设计进行开闭，进而实现刺激气体的输送.USB6008数据采集卡可提供12个数字输入/输出（DIO）通道，本装置仅使用了数据采集卡的4个DIO通道，将其连接至4路继电器模块的控制端，继电器输出端连接电磁阀4路控制端.在已有装置[12]的基础上，增加1路可变支路，即共有3路刺激气体和1路对照气体在内的4路控制信号.装置运行过程中，继电器的输出信号产生毛刺，需要光电耦合部件进行隔离，本装置使用滤波电路去除输出信号噪声，即将1个电容和1个电阻串联至继电器输出电路中来减少毛刺信号，进而提高电路的抗干扰能力.刺激序列控制刺激通道的开闭状态和开启时间，当刺激序列被发送至采集卡后，采集卡改变数字口高低电平状态进而控制4路继电器的开闭状态，继电器的输出电平进一步控制电磁阀开闭状态，这一系列动作完成了对上位机刺激序列的执行.
气路控制系统主要由气泵、电磁阀、流量计和其他气路配件组成.其中气泵的主要作用是产生一定流量的洁净空气，作为后续着味支路和恒流支路的气源.电磁阀由继电器控制，按照刺激序列实现对某一路的开闭.除此之外，刺激装置在着味支路与恒流支路分别安装1个可调流量计，用于调节两路气体流速，从而改变着味气体与洁净空气的混合比例，实现刺激气体浓度可调的目的.经过原有装置方案验证及不同支路流速测试，恒流支路流速设为1 L/min、其他支路流速设为1.5 L/min时，被试反馈气味接收效果最好，且未出现明显的气流冲击.本方案中选用的是12 V一进二出电磁阀，流量计为0~5 L带阀可调流量计，电磁阀与流量计均选用Cole-Parmer公司产品，气路元件均由标准气路连接配件相连，在一定程度上保证装置的气密性与时间精度.
1.2.3 气体输送系统气体输送系统包括洗气瓶、汇流管和鼻氧管.其中洗气瓶作为刺激装置的核心部件，其容积和气密性都会直接影响到刺激效果，目前实验室标准洗气瓶容积较大，均在100 mL以上，通过多次实验验证，每种刺激溶液为15~20 mL便可满足要求，所以选择定制容积为30 mL的洗气瓶.除此之外，目前部分自制刺激器选用U形管固体刺激物着味的方式，考虑到固体刺激物刺激浓度不易确定，故没有选用.气路管材及汇流管均采用Cole-Parmer公司标准气路解决方案，搭建过程中发现汇流管的不同组合方案对装置稳定性影响较大，具体分析见后文所述.
被试刺激气体接收方案主要由以下两种：面罩式和鼻氧管式.面罩式气体接收效果较好，但是需要定制气体面罩，而且由于面罩内空间较小，易造成气体堆积，此外还需要真空泵进行废气处理，成本较高[2].鼻氧管式一般是将鼻氧管插入被试鼻腔，这种方式可以保证刺激气体最大化的被被试接收，但是由于气流末端与鼻腔距离过短，气路切换时会有瞬时的气体流量增减，对鼻腔形成冲击响应，影响被试对气味的感知.综合考虑以上气体接收方案，我们选择半开放式接收方案，即将鼻氧管固定至头部线圈上，气体释放端距离被试约3~4 cm，这种方式既避免了气流对被试鼻腔带来的冲击响应又可以保证刺激气体由被试自然吸入.
1.3 装置稳定性测量针对系统稳定性测量提出以下两个可计算指标：（1）气体流量波动率，即刺激任务实施过程中，气体流量波动均值与流量均值的比值；（2）切换响应时间，即从气路切换指令下达至目标刺激气流到达稳定的时间.气体流量波动率反映了装置在刺激任务过程中的整体稳定性，切换响应时间代表了刺激序列时间精度的大小.两个指标越小，说明装置越稳定，对实验带来的干扰因素越少.
为满足以上测量要求，选用了霍尼韦尔AWM43600流量传感器对系统指标进行间接测量.AWM43600传感器可测量流速范围是0~6 L/min，与刺激器输出气体流量范围相符.使用安捷伦N6705B电源分析仪对传感器输出电压测量，并将采样频率为10 Hz的测试结果保存为excel文件用于后续指标计算.
测量过程选取刺激序列中的1个周期，具体时间分布为：30 s纯水+14 s乙醇+30 s纯水+14 s吡啶+30 s纯水+14 s乙酸戊酯.测量位置为汇流管的输出端.对于汇流管的连接方式，最初使用的是图 3所示方案：3个刺激气体支路使用四通相连，纯水与恒流支路使用三通连接，末端使用三通汇流，结果发现输出气体流量呈现周期性波动，且整体波动较大，波动点出现在气路切换点上.经过分析，问题出现在纯水与恒流支路连接处，由于三通接头1处存在两条输入支路，但其内容积较小，所以当切换到纯水支路时，会造成输出流量的衰减.
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图 2 信号控制系统上位机软件界面. (a)刺激序列设计功能界面；(b)刺激序列执行功能界面 Figure 2 Interface of the sign control system software. (a) Interface of stimulation paradigm design; (b) Interface of stimulation control |
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图 3 最初使用的(a)汇流管的连接方案及(b)流量曲线 Figure 3 The connection scheme (a) and flow curve (b) designed firstly |
针对以上问题提出改进方案，连接方案与测量结果如图 4所示：刺激气体支路与纯水支路两两相连，末端使用四通进行汇流，恒流支路单独接入四通，这样便可以解决气路切换时由恒流支路带来的冲击响应问题.
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图 4 改进后的(a)汇流管的连接方案及(b)流量曲线 Figure 4 The connection scheme (a) and flow curve (b) after improvement |
气体流量波动率：t0~tn时间段内，共有n个采样点，手动选择流量值突变前的第一个谷值点为刺激开始时间t0，按照刺激序列持续时间计算出结束时间tn，对应流量值分别为v0与vn，t0~tn时间段流量均值为vaver，流量波动率为α，则计算公式如下：
| $ {{v}_{\rm{aver}}}=\frac{\sum\nolimits_{t=1}^{n}{{{v}_{t}}}}{n} $ | (1) |
| $ \alpha =\frac{\sum\nolimits_{t=1}^{n}{|{{v}_{t}}-{{v}_{\rm{aver}}}|}}{n*{{v}_{\rm{aver}}}} $ | (2) |
图 4(b)已标记切换时间点，具体时间点选择如图 5所示，切换开始时间点t0为流量突变起始点，切换结束时间t1选择距离开始时间最近的第2个峰值点，第2个峰值点说明气路已经过最大波动，趋于稳定.因本次测试切换点较少，且采样频率较高，所以手动选择切换起始点与切换结束点不会带来较大误差.
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图 5 切换响应时间 Figure 5 Response time of switch |
为了验证嗅觉刺激装置的可用性，使用其对8名被试进行嗅觉fMRI实验.其中男性4名，女性4名；均为右利手、且无嗅觉障碍；平均年龄45岁.实验前签署“被试知情同意书”.扫描设备为Philips 3.0 T Achieva MRI扫描仪，扫描序列为EPI序列，脉冲重复间隔时间（TR）为2 000 ms，回波时间（TE）为30 ms，层厚为4 mm，共36层覆盖全脑，扫描矩阵为64×64，视野（FOV）为22 cm×22 cm.
实验试剂采用乙醇、吡啶和乙酸戊酯（上海国药集团化学试剂有限公司）.乙醇与吡啶使用纯净水稀释，体积分数分别为10%与0.05%；乙酸戊酯使用石蜡稀释，体积分数为0.2%.3种溶液都具有挥发性：乙醇为酒香气味，乙酸异戊酯为果香气味，属愉快气体；吡啶为刺激性臭味，属于非愉快气体.人体极少量吸入这3种气体时无毒害反应[13].
2.2 实验设计实验设计采用组块设计[16]，刺激序列如图 6所示.方案如下：刺激装置洗气瓶中分别装装入纯水、乙醇、吡啶、乙酸戊酯和纯水，体积均为15 mL.图中“纯水刺激”、“乙醇刺激”、“吡啶刺激”、“乙酸戊酯刺激”分别导通相应气路，为了避免长时间刺激导致嗅觉适应[17]并减少刺激气体的可预测性，每种刺激气体持续时间14 s，并采取间隔刺激的方式，中间纯水对照30 s.每一组刺激由3段纯水和3种刺激气体组成，持续时间132 s，共循环5次，时间总计660 s.
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图 6 实验刺激序列图 Figure 6 Experimental stimulation paradigm |
实验时让被试采取仰卧位，闭上眼睛，戴隔音耳罩，尽量保持静止和均匀呼吸，不主动嗅探刺激气体，不刻意辨别刺激气体的种类；实验后对被试进行问卷调查，记录被试对于刺激任务的主观反应.采集到的图像数据首先使用Matlab软件中基于SPM12工具包的DPARSFA工具进行数据预处理，具体包括图像格式转换、时间层校正、头动校正、空间标准化和高斯平滑（半高宽= 4 mm），然后根据刺激序列使用SPM12分别对8名被试进行气味组与纯水组的对照统计分析.
3 结果与讨论 3.1 系统稳定性指标计算得出本装置的气体流量波动率为0.3%，针对气路流动性提出的气流波动率指标反映了装置运行过程中的气路稳定性，具体而言就是气流波动越小，不同支路刺激过程中被试感知到的差异性就越小，排除气体流动稳定时不同支路除刺激气味外的其它刺激干扰.
本装置气路切换平均响应时间为1.07 s，切换时间主要是关注不同支路切换状态的瞬时时间，切换时间越短，气味刺激和设计序列的吻合度越好，后续数据处理结果可信度越高，从而保证刺激序列具有较高的时间精度.单次测量的切换时间点数据见表 1，气路切换平均响应时间1.07 s，小于1个脉冲重复间隔时间（2 s），可以实现某些嗅觉研究的时间相关的实验设计，即在1个脉冲重复间隔时间内对被进行短时嗅觉刺激.
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表 1 气路切换时间点 Table 1 Time point of gas paths switch |
根据2.3所述数据分析步骤得到如图 7所示的8名被试进行气味组与纯水组的对照脑激活图，p < 0.001，体素值 > 5.嗅觉刺激脑区的激活点主要分布在(a)丘脑、(b)杏仁核、(c)眶额皮层和(d)梨状皮质[14].如图所示，以上脑区均存有激活，验证了该设计装置在脑fMRI实验中的可行性.
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图 7 嗅觉fMRI实验结果. (a)丘脑；(b)杏仁核；(c)眶额皮层；(d)梨状皮质 Figure 7 Results of olfactory fMRI experiment. (a) Thalamus; (b) Amygdala; (c) Orbital frontal cortex; (d) Piriform cortex |
本文设计的嗅觉刺激装置可以根据输入的实验刺激序列自动地对被试在fMRI实验中进行3路气味的嗅觉刺激，满足刺激强度可调、实现多路刺激、具有磁兼容性的通用要求.测得系统气流波动率和切换响应时间分别为0.3%与1.07 s，装置在达到较高气体流动稳定性的同时还具有较高的时间精度，提出的指标测量方法具有可推广性，降低了系统指标测量难度.通过脑fMRI实验所得的脑区激活结果证明了装置在嗅觉刺激实验中的可用性.
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