2017, Vol. 34 
2. 中国科学院大学, 北京 100049
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
帕金森症（PD）是常见的神经退行性疾病，主要病理学特征为患者脑部出现路易小体，路易小体的主要蛋白成分则是异常聚集的α-synuclein[1].α-synuclein是1个含有140个氨基酸的天然无结构蛋白.根据α-synuclein各个部分的特点，可以分为3个区域：N端的1~60位残基，含有4个不完全重复的保守片段（KTKEGV）[2]；NAC区域61~95位残基，含有3个重复的保守片段（KTKEGV）；C端96~140位残基，含有无结构蛋白特有的大量酸性氨基酸和脯氨酸.N端和NAC端是与生物膜相互作用的主要区域[3]，而酸性C端则被认为是与其他蛋白质相互作用的主要位置[4].研究[5, 6]表明α-synuclein在细胞内质网中的浓度大大高于细胞质，高浓度的α-synuclein可损害内质网的正常生理功能，导致内质网压力变化.
在细胞内质网的压力应对机制中，蛋白质二硫键异构酶（PDI）发挥着重要作用[7].PDI主要存在于细胞内质网中，是一种多功能蛋白.PDI负责氧化还原内质网中新生肽链二硫键的形成和断裂，酶催化分子中错误链接的二硫键重排形成正确的二硫键[8]；而且通过分子伴侣功能防止无结构蛋白发生聚集，并最终使无结构蛋白被运输出内质网[9].PDI通过控制内质网中的无结构蛋白应答来调节内质网的压力平衡[10].PDI的结构整体呈马蹄型[11]，含有4个类似硫氧还原蛋白的结构域ABB´A´：A和A´分别含有1个二硫键酶活性位点CXXC，A和A´两个活性结构域由结构相对刚性的B和B´连接，B´上有1个疏水口袋，是主要的底物结合位点[12]；在A´和B´之间有一段灵活性很强的X linker，强酸性的C末端含有29个残基，带有1个KDEL内质网定位信号[13].然而，在PD患者的脑细胞中，大量PDI酶活性位点的半胱氨酸被亚硝基化，从而失去了调控α-synuclein等无结构蛋白聚集和运输的功能[14, 15].Cheng等人[16]的研究表明，野生型PDI能够抑制α-synuclein的纤维化聚集.但是目前关于PDI与α-synuclein的相互作用，及其对α-synuclein纤维化聚集的调节机制尚不清楚，这些机制的揭示将有助于了解α-synuclein的纤维化聚集过程.
核磁共振（NMR）方法是研究不同蛋白之间相互作用的有力手段，NMR在α-synuclein的结构及相互作用研究中已经取得了许多研究成果[17].本文通过NMR方法研究了α-synuclein与PDI的相互作用，发现α-synuclein与PDI的结合位点主要位于α-synuclein的N端，但是与半胱氨酸突变为丝氨酸的突变体——PDI C-S的结合位点则位于α-synuclein的C末端.硫磺素T（ThT）是能与淀粉样纤维特异性结合的荧光染料，可以利用ThT荧光实验来检测纤维结构的形成，蛋白纤维化聚集程度越大，测得的荧光强度越强[18].通过ThT荧光实验我们发现，相对于野生型PDI，PDI C-S突变体抑制α-synuclein的纤维化聚集作用明显减弱.结合NMR和ThT荧光实验结果可知，PDI通过与α-synuclein的N端残基结合抑制其纤维化聚集，并且PDI的半胱氨酸残基在这个过程中起到重要的作用.
1 实验部分 1.1 样品制备 1.1.1 野生型PDI及其突变体PDI C-S的表达与纯化首先挑取已转入野生型或突变型PDI重组质粒（His6-PDI-pET-28a）的大肠杆菌BL21（DE3）单克隆于LB培养基中，37 ℃条件下培养至在600 nm处的光密度值（OD600）为0.8，然后加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为1.0 mmol/L，37 ℃继续诱导表达5 h；6 000 rpm离心10 min，去上清收集细胞；将细胞重悬后超声裂解至透亮，20 000 rpm离心收集上清.收集的上清液首先用Ni亲和层析柱（GE Healthcare Life Sciences China，北京）纯化，然后洗脱液再用Superdex S-75（GE Healthcare Life Sciences China，北京）分子筛纯化，最后经阴离子交换柱Source Q（GE Healthcare Life Sciences China，北京）纯化，得到纯度达标的样品，冻干封存备用.
1.1.2 α-synuclein的表达与纯化α-synuclein的表达和纯化方法参考戴晨晔等人[19]文章.
1.2 NMR实验 1.2.1 NMR样品制备将冻存的α-synuclein蛋白样品溶解于450 μL NMR缓冲液（含20 mmol/L Tris和100 mmol/L NaCl，pH 7.0）中，加入50 μL D2O，α-synuclein的最终浓度为0.125 mmol/L.
1.2.2 1H-15N HSQC实验1H-15N HSQC实验均在Bruker 600 MHz谱仪上完成，实验温度为298 K.谱宽为7 240 Hz（1H）×1 580 Hz（15N），采样数据点阵为t2×t1 = 2 048×256，累加次数（ns）为20，弛豫等待时间（d1）为1.0 s.谱图化学位移归属根据BioMagResBank（BMRB entry number 16543）.
1.3 ThT荧光实验70 μmol/L的α-synuclein溶于1 mL的缓冲溶液中（含20 mmol/L Tris-Hcl和100 mmol/L NaCl，pH 7.0），加入PDI或突变体PDI C-S使其终浓度为35 μmol/L（对照组不加PDI或突变体PDI C-S），在37 ℃、220 rpm的条件下进行纤维化诱导.间隔一定时间，取样10 μL加入1 mL的ThT（浓度为50 μmol/L）混合均匀.使用FS5荧光仪（Edinburgh Instruments Ltd.，英国）进行荧光测定，选择5 nm的狭缝带宽，在450 nm处进行激发，发射光谱记录范围为470~600 nm，记录步长为1 nm.纤维生长情况在482 nm下进行评估.
2 结果与讨论 2.1 α-synuclein与PDI及其突变体PDI C-S结合位点的研究PDI抑制α-synuclein纤维化聚集的功能已有报道[16]，但具体的作用机制并不清楚.为了研究α-synuclein与PDI相互作用的结合位点，我们采集了15N标记的α-synuclein的1H-15N HSQC谱图[图 1(a)中的蓝色谱图所示]，谱峰集中出现在δH 7.5~8.5之间，表明α-synuclein呈现无结构状态；向α-synuclein中加入终浓度为0.2 mmol/L PDI，在同样的实验条件下再次采集α-synuclein的1H-15N HSQC谱图[图 1(a)中的红色谱图所示]，发现α-synuclein的部分氨基酸残基出现化学位移变化.通过(1) 式计算各个残基的化学位移变化，得到滴定后各个残基的化学位移变化柱状图[图 1(b)].
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图 1 (a) 0.125 mmol/L 15N标记的α-synuclein加入终浓度为0.2 mmol/L野生型PDI前（蓝色）后（红色）的1H-15N HSQC谱图；(b)加入PDI后，α-synuclein各个氨基酸残基的化学位移变化柱状图 Figure 1 (a) 1H-15N HSQC spectra of 15N-labeled α-synuclein (0.125 mmol/L) in the absence (blue) and presence (red) of wild type PDI (0.2 mmol/L); (b) Chemical shift changes of the amino acid residues in α-synuclein upon interaction with PDI |
| $ \Delta {\delta _{{\rm{combined}}}} = 0.25\sqrt {{{\left[ {\delta \left( {^1{{\rm{H}}_{{\rm{free}}}}} \right) - \delta \left( {^1{{\rm{H}}_{{\rm{bound}}}}} \right)} \right]}^2} + {{\left\{ {1/5\left[ {\delta \left( {^{15}{{\rm{N}}_{{\rm{free}}}}} \right) - \delta \left( {^{15}{{\rm{N}}_{{\rm{bound}}}}} \right)} \right]} \right\}}^2}} $ | (1) |
图 1显示发生化学位移变化的残基主要位于α-synuclein的N端，特别是V3、F4、M5、K6等残基[图 1(b)]，表明α-synuclein主要是通过这些位点与PDI相互作用.
为了研究PDI的半胱氨酸对α-synuclein与其结合的影响，我们将PDI的6个半胱氨酸突变为丝氨酸，得到突变体PDI C-S，并分别采集加入突变体PDI C-S前后α-synuclein的1H-15N HSQC谱图[图 2(a)]，发现加入突变体PDI C-S后α-synuclein C末端的Q134、D135、Y136、E137等信号消失[图 2(b)]，表明C端残基是α-synuclein与PDI C-S结合的主要位点.
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图 2 (a) 0.125 mmol/L 15N标记的α-synuclein加入终浓度为0.2 mmol/L PDI C-S前（蓝色）后（红色）的1H-15N HSQC谱图；(b)加入PDI C-S后，α-synuclein各个残基的化学位移变化柱状图，黄色部分表示消失的峰 Figure 2 (a) 1H-15N HSQC spectra of 15N-labeled α-synuclein in the absence (blue) and presence (red) of PDI C-S (0.2 mmol/L); (b) Chemical shift changes of amino acid residues in α-synuclein upon interaction with PDI C-S, yellow part represents the NMR peaks disappeared |
从NMR实验结果得到野生型PDI与α-synuclein的N端残基结合，而突变体PDI C-S与α-synuclein的C端结合.为了比较野生型PDI和突变体PDI C-S对α-synuclein纤维化聚集过程是否也会有不同影响，我们采用ThT荧光实验进行研究.从图 3可以看到，野生型PDI几乎完全抑制了α-synuclein的纤维化聚集，而突变体PDI C-S的抑制作用减弱，这可能是由于α-synuclein的N端和C端在纤维化聚集的过程中起着不同的作用.
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图 3 硫磺素T（ThT）荧光实验监测PDI及其突变体PDI C-S对α-synuclein纤维化聚集的影响 Figure 3 Influence of PDI or PDI C-S to the fibrillation of α-synuclein monitoring by thioflavin T(ThT) fluorescence |
Rao等人[20]发现许多抑制α-synuclein聚集的小分子与α-synuclein的接触位点主要位于N端的3~18和38~51之间，与C端基本没有相互作用；同时突触前蛋白synphilin-1与α-synuclein的N端结合，抑制了α-synuclein聚集[21]；α-synuclein的N端乙酰化破坏了其N端与其他部位的相互作用，使得α-synuclein的聚集减缓[22]；此外，α-synuclein主要通过N端接触形成二聚体，而二聚体比单体α-synuclein更稳定，因而N端在α-synuclein纤维化聚集过程中起到重要作用[23].Cheng等人[16]的研究表明，PDI的A´结构域在抑制α-synuclein纤维化聚集的过程中发挥着重要作用.A´结构域对于PDI与无结构蛋白的结合至关重要[12]，所以PDI可能通过A´结构域与α-synuclein的N端结合，破坏α-synuclein分子间相互作用，阻碍α-synuclein二聚的形成，从而进一步抑制了α-synuclein的纤维化聚集.
α-synuclein的C端有分子伴侣的功能，能够与α-synuclein的N端和NAC端接触，防止α-synuclein的纤维化聚集[24]；同时负电荷富集的C端结合钙离子或者被截去，都会使α-synuclein的纤维化聚集大大加快[25, 26].因此，突变体PDI C-S与α-synuclein的C端结合，可能使得α-synuclein的疏水区暴露，导致PDI C-S抑制α-synuclein聚集的功能减弱，这表明PDI上的半胱氨酸对PDI抑制α-synuclein纤维化聚集至关重要，半胱氨酸在这个过程中的具体作用有待进一步研究.对于PD患者，影响PDI与α-synuclein N端相互作用，可能是由于患者脑细胞中PDI的二硫键位点半胱氨酸被亚硝基化从而失去抑制α-synuclein纤维化聚集功能的作用机制[14].
3 结论通过结合NMR和ThT荧光实验研究了PDI抑制α-synuclein纤维化的作用机制，发现PDI主要是通过结合α-synuclein的N端残基，抑制α-synuclein纤维化聚集，并且半胱氨酸对于PDI抑制α-synuclein纤维化聚集的功能至关重要.
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