2017, Vol. 34文章信息
- 冯小虎, 于水涛, 夏正君, 陈再新
- FENG Xiao-hu, YU Shui-tao, XIA Zheng-jun, CHEN Zai-xin
- 硼替佐米的波谱学数据解析
- Spectral Analysis of Bortezomib
- 波谱学杂志, 2017, 34(1): 43-51
- Chinese Journal of Magnetic Resonance, 2017, 34(1): 43-51
- http://dx.doi.org/10.11938/cjmr20170106
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文章历史
收稿日期: 2015-11-27
收修改稿日期: 2017-01-04
DOI:10.11938/cjmr20170106
硼替佐米（bortezomib），商品名万珂（Velcade），是由美国Millennium制药公司研发的新型抗肿瘤药物.该药是26S蛋白酶体抑制剂，通过阻断细胞内多种调控细胞凋亡及信号传导的蛋白质的降解，导致肿瘤细胞死亡.2003年5月，硼替佐米获得美国药品与食品管理局（FDA）批准在美国上市，用于难治性、复发性多发性骨髓瘤（MM）的治疗.由于硼替佐米对初治多发性骨髓瘤也具有显著疗效，目前已成为多发性骨髓瘤的首选治疗药物.硼替佐米具有两个手性中心，化学式为C19H25BN4O4，化学名为[(1R)-3-甲基-1-[[(2S)-1-氧-3-苯基-2-[(吡嗪羧基) 氨基]丙基]氨基]丁基]硼酸，其结构式如图 1所示.
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| 图 1 硼替佐米的化学结构 Fig. 1 The structure of bortezomib |
目前关于硼替佐米的合成、药理及临床研究方面的文献报道较多[1-11]，但未见有文献对其核磁共振氢谱（1H NMR）和核磁共振碳谱（13C NMR）信号进行全归属，并且没有文献结合二维NMR波谱进一步验证1H和13C NMR信号归属的正确性[12-18].本文测定了硼替佐米的紫外吸收光谱（UV）、红外吸收光谱（IR）、NMR波谱（包括1H NMR、13C NMR、DEPT、1H-1H COSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC）、电喷雾离子源-质谱（ESI-MS），对其所有的1H和13C NMR信号进行了归属，讨论了红外特征吸收峰所对应的官能团的振动形式，从而较完整提供了的硼替佐米的波谱数据和结构信息，为其进一步研究提供参考依据[19, 20].
1 实验部分 1.1 仪器及试剂 1.1.1 仪器紫外光谱采用岛津UV1601（日本岛津）测定.红外光谱采用NICOLET Impact 410型红外光谱仪（美国Nicolet公司）测定，KBr压片.质谱仪为Agilent 1100（美国Agilent公司）.1H NMR、13C NMR、DEPT、1H-1H COSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC谱均采用Bruker Avance AV 500型NMR谱仪（Bruker公司）测定，以DMSO-d6为溶剂，TMS为内标，二维谱采用反向检测探头.1H NMR的工作频率为500.13 MHz，90˚脉冲宽度为9.8 μs，实验谱宽为6 009.6 Hz；13C NMR的工作频率为125.77 MHz，90˚脉冲宽度为8.0 μs，实验谱宽为30 303.0 Hz；DEPT的工作频率及谱宽同13C NMR；1H-1H COSY的F2（1H）和F1（1H）维的谱宽均为6 009.6 Hz，采样数据点阵t2×t1=1 024×512，零填充后傅里叶变换点阵F2×F1=2 048×1 042；HSQC的F2（1H）和F1（13C）维的谱宽分别为6 009.6 Hz和30 303.0 Hz，采样数据点阵t2×t1=1 024×512；HMBC的F2（1H）和F1（13C）维的谱宽分别为6 009.6 Hz和30 303.0 Hz，JCH=3.45 ms（JCH为一键碳氢偶合常数），采样数据点阵t2×t1=1 024×256.
1.1.2 试剂所用试剂均购自上海国药集团化学试剂有限公司，为分析纯.所有试剂均未经进一步提纯，直接使用.
1.2 样品制备实验中的硼替佐米原料由亚邦医药研究院制备并提供.具体以3-甲基丁醛和R-(+)-1-苯乙胺为起始原料，通过缩合、选择性硼酸酯加成、氢化脱保护、与L-苯丙氨酸手性缩合、与2-羧基-吡嗪缩合和硼酸化等反应得到硼替佐米.利用高效液相色谱（HPLC）测试样品纯度为99.56%，符合结构鉴定所需的纯度.
2 结果与讨论 2.1 UV光谱分析样品分别以水溶液、0.1 mol/L盐酸（HCl）溶液、0.1 mol/L氢氧化钠（NaOH）溶液和甲醇为溶剂，其在中性水溶液中最大紫外吸收在270.0 nm，吸收带强度（摩尔吸收系数）为4 987.86，是由共轭π-π*或n→π*跃迁产生，表明分子中有芳环、羰基或共轭羰基存在；同时杂环中氮原子的未成键n电子的n→π*共轭作用产生的跃迁在270.0 nm附近也存在吸收.其酸性（0.1 mol/L HCl溶液）、碱性溶液（0.1 mol/L NaOH溶液）以及甲醇溶液中的紫外光谱与中性水溶液紫外光谱基本一致，表明硼替佐米分子中的生色团与助色团在不同pH环境中比较稳定.
2.2 IR光谱分析红外吸收光谱中，3 574 cm-1（νO-H）表明分子中存在羟基.3 461 cm-1、3 299 cm-1（νN-H CO-NH）、1 656 cm-1（νC=O CO-NH）、1 523 cm-1（δN-H CO-NH）表明分子中仲酰胺结构片段的存在；3 009 cm-1、3 015 cm-1、3 034 cm-1（νC-HArH）（注：Ar表示芳环，下同）3个较弱的特征吸收峰，表明分子中存在芳环，可能是苯环和或芳杂环；1 600 cm-1、1 585 cm-1、1 500 cm-1、1 450 cm-1（νC=C Ph）（注：Ph表示苯环，下同）是典型的苯环骨架振动吸收峰；702 cm-1（δC-H Ph）进一步表明单取代苯环的存在；1 610 cm-1（νC=N Py）（注：Py表示吡嗪环，下同）表明分子中可能存在吡嗪环结构；2 955 cm-1（νC-H CH3）、2 928 cm-1（νC-H CH2）、1 467 cm-1（δC-H CH2）、1 397 cm-1（δC-H CH3）表明分子中存在CH3和CH2.具体的红外光谱数据及归属见表 1.
| Absorption band/cm-1 | Mode of ibration | Group* | Intensity** |
| 3574 | νO-H | B (OH)2 | s |
| 3461, 3299 | νN-H | -CO-NH- | s |
| 3009, 3015, 3034 | νC-H | ArH | w |
| 2955 | νC-H | -CH3 | s |
| 2928 | νC-H | -CH2- | s |
| 1656 | νC=O | -CO-NH- | vs |
| 1610 | νC=N | Py | s |
| 1600, 1585, 1500, 1450 | νC=C | Ph | s |
| 1523 | δN-H | -CO-NH- | vs |
| 1467 | δC-H | -CH2- | s |
| 1397 | δC-H | -CH3 | vs |
| 702 | δC-H | Ph | vs |
| *Ar表示芳环，Ph表示苯环，Py表示吡嗪环；**s, w, vs表示吸收强度，分别为强、弱、非常强. | |||
硼替佐米质谱采用ESI电离源，正离子检测的准分子离子峰质荷比（m/z）为407.4 [M+Na]+，负离子检测的准分子离子峰m/z为383.5[M-H]-.硼替佐米分子式为C19H25BN4O4，精确分子量为384.196 9，因此实际测量值与理论分子量一致.
2.4 NMR谱图分析 2.4.1 1H NMR和1H-1H COSY谱图分析结合1H-1H COSY谱图（图 2）和文献[17, 18]，1H NMR谱中给出14组质子信号分析如下：高场区δH0.75（3H, d, J=2.2 Hz）和δH0.77（3H, d, J=2.2 Hz）被归属为两组甲基质子，受邻位次甲基质子的偶合影响，均裂分为双重峰，由于受到邻近的硼酸羟基范德华力的弱去屏蔽效应影响，距离羟基较近的甲基略移向低场，因此δH0.75归属为H-10，δH0.77归属为H-11.δH1.20（1H, m）和δH1.31（1H, m）被归属为H-8a或H-8b，由于受邻位手性碳原子的影响，产生较大的同碳偶合，同时受邻近位即2位和9位质子的偶合作用，均裂分为多重峰.在1H-1H COSY谱中，δH1.55（1H, m）与H-8a、H-8b、H-10和H-11相关，因此被归属为H-9，受邻近位H-8a、H-8b、H-10和H-11的偶合作用，裂分为多重峰.在1H-1H COSY谱中，δH2.65（1H, m）与H-3、H-8a和H-8b相关，被归属为H-2，受邻位H-8a、H-8b以及H-3的偶合作用，裂分为多重峰.δH 8.84（1H, br）在1H-1H COSY中与H-2相关，加D2O进行氢-氘（H-D）交换后，信号消失，因此被归属为活泼的酰胺质子H-3.δH3.08~3.18（2H, m）由于受到邻位手性碳原子的影响，产生较大的同碳偶合，同时受邻近位质子的偶合作用，裂分为多重峰，被归属为H-12.在1H-1H COSY谱中，δH4.93（1H, dd, J=14.0, 8.4 Hz）与H-12相关，被归属为H-5.同时，δH4.93在1H-1H COSY中与δH8.87（1H, br）相关，而且在加入D2O进行H-D交换后，δH8.87信号消失，因此δH8.87（1H, br）被归属为活泼的酰胺质子H-6.在1H-1H COSY谱中，δH7.13（1H, t, J=7.0 Hz）、δH 7.19（2H, dd, J=7.0, 7.2 Hz）和δH7.23（2H, d, J=7.2 Hz）构成了一个质子偶合体系，根据化学位移和质子个数，被归属为苯环上的质子（H-14~18），其中H-14与H-18是磁等价质子，H-15与H-17是磁等价质子；受H-15与H-17的共同影响，H-16被裂分为三重峰，因此δH7.13（1H, t, J=7.0 Hz）被归属为H-16；受H-15和H-17的影响，H-14或H-18裂分为双重峰，因此δH7.23（2H, d, J=7.2 Hz）被归属为H-14或H-18；受H-16与H-14或H-18的影响，H-15或H-17被裂分为两个双重峰，因此δH 7.19（2H, dd, J=7.0, 7.2 Hz）被归属为H-15或H-17.在1H-1H COSY谱中，δH8.85（1H, br）与δH8.71（1H, br）强相关，而与δH9.09（1H, br）弱相关，因此δH8.85（1H, br）被归属为H-22；根据与H-22相关信号的强弱，δH8.71（1H, br）被归属为H-21，δH9.09（1H, br）被归属为H-24.具体的1H NMR和1H-1H COSY数据及归属见图 2与表 2.
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| 图 2 硼替佐米的1H-1H COSY谱图 Fig. 2 1H-1H COSY spectrum of bortezomib |
| position | δH | Multiplicity* | Proton number | 1H-1H COSY |
| 24 | 9.09 | br | 1H | H-22 |
| 6 | 8.87 | br | 1H（加D2O后消失） | H-5 |
| 22 | 8.85 | br | 1H | H-21, H-24 |
| 3 | 8.84 | br | 1H（加D2O后消失） | H-2 |
| 21 | 8.71 | br | 1H | H-22 |
| 14(18) | 7.23 | d, J=7.2 Hz | 2H | H-15(H-17) |
| 15(17) | 7.19 | dd, J=7.0, 7.2 Hz | 2H | H-14(H-18), H-16 |
| 16 | 7.13 | t, J=7.0 Hz | 1H | H-15(H-17) |
| 5 | 4.93 | dd, J=14.0, 8.4 Hz | 1H | H-12, H-6 |
| 12 | 3.08~3.18 | m | 2H | H-5 |
| 2 | 2.65 | m | 1H | H-8a (H-8b), H-3 |
| 9 | 1.55 | m | 1H | H-8a (H-8b), H-10, H-11 |
| 8a (8b) | 1.20（或1.31） | m | 2H | H-2, H-8b (H-8a), H-9 |
| 11 | 0.77 | d, J=2.2 Hz | 3H | H-9 |
| 10 | 0.75 | d, J=2.2 Hz | 3H | H-9 |
| *br、m、d、dd和t分别表示宽峰、多重峰、双峰、两个双重峰和三重峰. | ||||
13C NMR和DEPT图谱（图 3）表明，该分子结构中含2个伯碳--δC 22.4和δC 22.8，2个仲碳--δC 37.2和δC 39.8，11个叔碳--δC24.9、δC 42.8、δC 51.6、δC 126.4、δC 128.0（包含2个碳原子）、δC 129.2（包含2个碳原子）、δC 143.2、δC 143.4和δC 147.6，4个季碳--δC 136.8、δC 144.0、δC 162.4和δC 172.7.δC 22.4在1H-13C HSQC谱（图 4）中与H-10直接相关，1H-13C HMBC谱（图 5）显示其与H-8、H-9、H-11有远程相关，被归属为C-10.δC22.8在HSQC谱中与H-11直接相关，HMBC谱显示其与H-8、H-9、H-10有远程相关，被归属为C-11.δC24.9在HSQC谱中与H-9直接相关，HMBC谱显示其与H-2、H-8、H-10、H-11有远程相关，被归属为C-9.δC37.2在HSQC谱中显示与H-12相关，该亚甲基中两个质子为磁不等价核，HMBC谱显示其与H-5、H-6、H-14（或H-18）有远程相关，被归属为C-12.δC39.8在HSQC谱显示与H-8a和H-8b相关，该亚甲基中两个质子也为磁不等价核，HMBC谱显示其与H-2、H-9、H-10、H-11有远程相关，归属为C-8.δC42.8在HSQC谱中显示与H-2相关，HMBC谱显示其与H-3、H-8、H-9有远程相关，由于受邻位硼原子的影响，13C NMR信号峰较弱，被归属为C-2.δC51.6在HSQC谱显示与H-5相关，HMBC谱显示其与H-6和H-12有远程相关，被归属为C-5.δC126.4在HSQC谱中显示与H-16直接相关，HMBC谱显示其与H-14（H-18）和H-15（H-17）有远程相关，被归属为C-16.δC128.0在HSQC谱中显示与H-15（H-17）直接相关，HMBC谱显示其与H-14（H-18）、H-16有远程相关，由于取代苯环对称性，两个13C核化学位移相同，被归属为C-15和C-17.δC129.2在HSQC谱中显示与H-14（H-18）直接相关，HMBC谱显示其与H-12、H-15（H-17）、H-16有远程相关，被归属为C-14和C-18.δC136.8在HSQC谱中无相关信号，HMBC谱显示其与H-5、H-12、H-14（H-18）、H-15（H-17）有远程相关，被归属为C-13.δC143.2在HSQC谱中与H-21直接相关，HMBC谱显示其与邻位H-22有远程相关，与对位H-24没有远程相关，被归属为C-21.δC143.4在HSQC谱中与H-24相关，HMBC谱显示其与间位H-22有远程相关，与对位H-21没有远程相关，被归属为C-24.δC144.0在HSQC谱中无相关信号，HMBC谱显示其与H-21、H-24有远程相关，被归属为C-19.δC147.6在HSQC谱中与H-22相关，HMBC谱显示其与邻位H-21，间位H-24有远程相关，被归属为C-22.δ 162.4在HSQC谱中无相关信号，HMBC谱显示其与H-5、H-6、H-24有远程相关，被归属为C-7.δC 172.7在HSQC谱中无相关信号，HMBC谱显示与H-2、H-3、H-5、H-6、H-12有远程相关，被归属为C-4.具体的13C NMR、DEPT、HSQC和HMBC数据及归属见图 3、图 4、图 5与表 3.
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| 图 3 硼替佐米的DEPT谱和13C NMR谱 Fig. 3 DEPT spectra and 13C NMR spectrum of bortezomib |
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| 图 4 硼替佐米的1H-13C HSQC谱 Fig. 4 1H-13C HSQC spectra of bortezomib |
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| 图 5 硼替佐米的1H-13C HMBC谱. (a) 全谱；(b) 和(c) 为(a) 中方框所示部分放大图 Fig. 5 1H-13C HMBC spectra of bortezomib. (a) full spectrum; (b) & (c) are local amplified spectra in box of (a) |
| Position | δC | DEPT | HSQC | HMBC |
| 4 | 172.7 | C | / | H-2, H-3, H-5, H-6, H-12 |
| 7 | 162.4 | C | / | H-5, H-6, H-24 |
| 22 | 147.6 | CH | + | H-21, H-24 |
| 19 | 144.0 | C | / | H-21, H-24 |
| 24 | 143.4 | CH | + | H-22 |
| 21 | 143.2 | CH | + | H-22 |
| 13 | 136.8 | C | / | H-5, H-12, H-14(H-18), H-15(H-17) |
| 14, 18 | 129.2 | CH | + | H-12, H-15(H-17), H-16 |
| 15, 17 | 128.0 | CH | + | H-14(H-18), H-16 |
| 16 | 126.4 | CH | + | H-14(H-18), H-15(H-17) |
| 5 | 51.6 | CH | + | H-6, H-12 |
| 2 | 42.8 | CH | + | H-3, H-8, H-9 |
| 8 | 39.8 | CH2 | + | H-2, H-9, H-10, H-11 |
| 12 | 37.2 | CH2 | + | H-5, H-6, H-14(H-18) |
| 9 | 24.9 | CH | + | H-2, H-8, H-10, H-11 |
| 11 | 22.8 | CH3 | + | H-8, H-9, H-10 |
| 10 | 22.4 | CH3 | + | H-8, H-9, H-11 |
通过UV、IR、ESI-MS、1H NMR、13C NMR、DEPT、1H-1H COSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC等谱图的测定和解析，对硼替佐米的结构进行了全面地分析和验证.通过ESI-MS确定了硼替佐米的分子式；紫外吸收图谱显示出特征官能团；红外光谱给出各基团的特征吸收；通过NMR谱的测定和解析，对硼替佐米的1H和13C NMR信号进行了全归属，从而确证了硼替佐米的结构.
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