引言

复合维生素B片是常用的非处方药物，按照卫生部标准WS1-73(B)-89^[1]，每片含主要成份维生素B1（VB1, 3 mg）、维生素B2（VB2, 1.5 mg）、维生素B6（VB6, 0.2 mg）、烟酰胺（10 mg）和泛酸钙（1 mg），辅料为淀粉、糊精、磷酸氢钙和硬脂酸镁；分别使用重量法测定VB1、分光光度法测VB2、滴定法测烟酰胺，操作麻烦，且其中的VB6和泛酸钙没有定量测定的方法和标准.文献^[2-4]中常利用离子对液相色谱法测定VB1、VB2、VB6和烟酰胺含量；近来有不用离子对试剂的梯度洗脱反相高效液相色谱（RPLC）法测定4种成分的报道^[5]；还有测定其它维生素制剂中更多成分的报道^{[6, 7]}；也有用毛细管电泳法^[8]、计算分光光度法^{[9, 10]}及比色法^[11]测定其中成分的报道.这些方法在测定时均需使用标样，操作复杂，且测定该药中泛酸钙的报道较少.

定量核磁共振波谱（qNMR）方法^[12]简便快捷，实际测定时可以不使用待测组分的对照品.因而先后被美国药典、英国药典^[13]、欧洲药典收录，中国药典2010版也在开始收录^[14].近年来，qNMR方法已被广泛应用于药品^[15-27]、食品^[28-30]等不同样品的定量分析，其中就有测定单组份维生素药品的报道^{[25, 26]}.

本文建立了同时测定复合维生素B片中有效成分VB1、VB2、烟酰胺和泛酸钙的qNMR方法.考察了NMR实验条件对有效成分含量测定的影响，选择内标为对苯二甲醛，溶剂为氘代二甲亚砜（DMSO-d₆），用qNMR方法同时测定了4种成分的含量.

1 实验部分 1.1 仪器及试剂 1.1.1 仪器

Bruker AVANCE Ⅲ 500型NMR谱仪（Bruker）；分析天平（AB204-N型，精度为0.1 mg，上海世义精密仪器有限公司）用于称量700 mg以上的样品；精密天平（M2P型，精度为0.001 mg，德国Startorius公司）用于称量700 mg以下样品；超声波发生器（PS-20型，Jeken公司）；离心机（TGL-16G型，上海安亭科学仪器厂）；电热鼓风恒温干燥箱（HJ101-00型，常州市昊江电热器材制造有限公司）.

1.1.2 试剂与样品

DMSO-d₆（99.9%氘代，化学纯度为99.5%），部分实验中使用的DMSO-d₆中含有0.05%（v/v）的四甲基硅烷（TMS），均购自美国剑桥同位素实验室（CIL）；对苯二甲醛（化学纯）和邻苯二甲酸氢钾（基准试剂）均购自国药集团化学试剂有限公司；VB1、VB2、VB6、烟酰胺和泛酸钙对照品均购自中国药品生物制品检定院；复合维生素B片药品均购于上海零售药房.

1.2 实验方法

取复合维生素B片若干，称量并计算平均片重，置研钵中研成细粉，精密称取25.0 mg左右药片粉末，0.5 mg左右对苯二甲醛作为内标，放于同一塑料管中，加入DMSO-d₆0.5 mL，振荡摇匀，超声10 min.然后把上述溶液转移至NMR样品管，在选定的实验条件下测定，对得到的谱图进行相位调整和基线校正，选定内标峰和定量峰，并进行积分面积测量.

根据内标峰面积与复合维生素B片中4种成分的积分面积比值，用2010版中国药典的qNMR方法计算待测组分的重量：

其中Wr为内标物的重量，As和Ar分别为供试品特征峰和内标峰的峰面积，Es和Er分别为供试品和内标物的质子当量重量（以分子量除以特征峰的质子数计算得到）^[14]，然后根据称样量计算组分在样品中的含量.

2 结果与讨论 2.1 样品中各组分NMR定量峰的选择

复合维生素B片样品的典型NMR谱图见图 1(a).通过比较在同样条件下样品与单一维生素成分的NMR谱图，排除受到干扰的信号，选择可用于定量分析的NMR谱峰位置见表 1.样品中VB1、VB2、烟酰胺和泛酸钙除表 1中的NMR谱峰以及部分活泼氢的谱峰没有相互干扰以外，其它位置均存在干扰. 图 2显示了VB1、VB2、烟酰胺和泛酸钙的结构式及其定量谱峰对应的质子.但实际实验中各成分的化学位移会有轻微的移动.特别是VB1，其定量峰化学位移与含量相关：含量高时化学位移会增大，因此本实验中将VB1用于定量的质子选在δ 9.60~9.90之间.泛酸钙的定量峰积分时容易受到邻近信号的轻微干扰（没有完全基线分离），但影响不大.考虑辅料成分可能会对谱峰积分产生影响，我们选择了将可溶性淀粉和硬脂酸镁加入至实验溶液中进行测试，结果显示它们均对各定量质子的NMR谱图没有干扰（谱图未显示）.另外，为排除溶剂与塑料离心管相互作用可能对NMR信号产生的影响，我们做了空白实验，结果显示：相同的新塑料离心管中加入DMSO-d₆超声10 min后，其NMR谱图中除溶剂峰以外，没有观察到其它信号（谱图未显示）.

VB6在样品中的含量比其它4个成分低一个数量级，而且它的NMR峰（δ 8.12、4.72~4.80、2.62）与样品中其它峰的位置相近，仅δ 2.62处信号受干扰较小，但含量低、信噪比差、无法达到定量的要求，因此本文仅对复合维生素B片中VB1、VB2、烟酰胺和泛酸钙4种成分进行了NMR定量研究.

样品中烟酰胺在δ 9.01和8.69处NMR峰的积分面积值相近，其重复测定峰面积的相对标准偏差（RSD）都小于3%，且都没有受到干扰，用于定量也没有明显差异，因此这两处的峰都可以作为烟酰胺的定量峰.除特别说明外，本文烟酰胺的定量峰都选择在δ 9.01处.

2.2 内标物选择与标定

内标物应不与样品发生反应，且其NMR峰与所测的样品峰之间没有干扰.对苯二甲醛的出峰位置在δ 10.13（醛基上的质子）及δ 8.05（苯环上的质子）附近，与维生素B片成分中的定量峰均互不干扰；该物质在常温下呈白色粉末或晶体状，易于精确称量，且在称量过程中没有吸湿现象；将该内标加入到复合维生素B片溶液中进行定量分析时，对苯二甲醛的稳定性也很好，随时间推移，其出峰位置及峰面积都很稳定.故本试验选择对苯二甲醛作为内标来对样品中的成分进行定量.

由于对苯二甲醛为化学纯试剂，故选取含量为100%的邻苯二甲酸氢钾基准试剂标定内标对苯二甲醛.邻苯二甲酸氢钾的NMR峰位置在δ 8.20和7.49附近（均为苯环上的质子）.由于δ 8.20左右的峰与对苯二甲醛δ 8.05峰很近，容易产生干扰，故选择邻苯二甲酸氢钾的基准峰为δ 7.49（2H，质子当量重量为102.11）.对苯二甲醛的定量峰仍为δ 10.13（2H，质子当量重量为67.07）.

精密称取对苯二甲醛和邻苯二甲酸氢钾，放于同一塑料离心管中，加入DMSO-d₆0.5 mL，振荡摇匀，完全溶解后转移至样品管进行NMR分析.每次实验测定5次，取平均值为对苯二甲醛内标的含量.结果显示重复2次测定的对苯二甲醛百分含量分别为97.91%和97.15%，取平均值97.53%作为其实际含量.

2.3 采样次数对复合维生素B片测定数据重现性的影响

设置脉冲宽度3.0 μs、延迟时间为1 s、采样温度22 ℃，其他参数默认.设定内标峰面积为10，对不同化学位移处各待测峰面积进行相对积分，考察采样次数对相对峰面积比的影响（测定结果见表 2）.

从积分数据可以看出，采样次数少，数据重现性差.当采样次数达到128次以上时，数据重现性变好.由于被测药品为混合物，VB2含量较少，与烟酰胺的含量相差较大，为了确保定量测定数据的重复性，最后选择采样次数为500.

2.4 测试溶液的稳定性

取样品与内标对苯二甲醛按1.2节的方法得到样品溶液并放在样品管中.在6 d时间内，每天按1.2节的方法进行NMR分析，测定复合维生素B片中4种成分定量峰的相对积分面积（见表 3，计算方式与2.3节中所述相同）．

结果显示在6 d以内，复合维生素B片与内标的DMSO-d₆溶液在NMR样品管中具有很好的稳定性，也说明本方法在定量测定4种化合物含量时具有很好的重现性.其中值得注意的是，VB2定量质子在二酰胺中间的氨基上，有一定的活泼性，通常不用做定量峰.但表 3结果显示其相对峰面积稳定性良好，可能与其结构中的大共轭体系和溶液pH有关，这有待进一步研究.

2.5 4种成分的标准曲线

由于VB1暴露在空气中迅速吸水，含水量可达4%，泛酸钙也有引湿性^[14]，这2个成分用对照品直接测定标准曲线时，零截距回归的斜率与理论斜率（样品与内标质子当量数的比值）偏差较大，可达到10%左右，因此需要标定其含量.

实际称重暴露空气中的干燥VB1样品时，会出现天平示数快速增加的现象，但放置0.5 h后再称重则读数稳定，这显示VB1在吸湿饱和后可以准确称量.但以定量NMR方法测定其含量时，重现性较差（RSD为3.3%），因此通过称重法^[14]测定VB1对照品含水量.精密称取一定量的VB1对照品放在铝箔称样舟中，放入烘箱烘干2 h后封闭铝箔舟，取出稍冷却后尽快称重，以两次称重差值与后次称重的比值作为含水量.重复3次的结果分别为4.30%、4.38%和4.32%，重复性很好，与文献^[14]报道接近，取其平均值4.33%作为含水量，VB1对照品实际含量按照95.67%计算.

泛酸钙对照品含水量则通过用已知含量的对苯二甲醛为内标，直接用定量NMR的方法测定（也可以用基准试剂邻苯二甲酸氢钾直接标定），重复四次的结果分别为93.16%、91.87%、92.50%和93.01%，取平均值92.64%（RSD为0.63%）作为泛酸钙对照品的含水量.

分别精密称取5份4种对照品和内标，按1.2节的方法测定不同样品成分与内标的NMR峰面积，以各成分峰面积与内标峰面积比值为X，对照品与内标质量的比值为Y，进行线性拟合，得到各组分的标准曲线（表 4）.标准曲线的相关系数（r）均大于0.999，显示qNMR方法得到的结果线性良好. VB1、烟酰胺和泛酸钙的标准曲线斜率与理论值非常接近，VB2的误差稍大可能与对照品在测定中的不稳定性有关^[14].这些结果表明，本实验测定实际样品时可根据式（1）计算各成分含量，不用对照品.

2.6 回收率测定

取部分样品，分别加入不同量的4种单成份维生素对照品后，与原样品一起按照1.2节的方法分析测定，计算4种成分的加标回收率（见表 5）.结果显示各成分的回收率均接近100%，且重现性很好.这表明该方法准确度高、结果可靠.

2.7 实际样品测定

按1.2节的方法测定不同厂家和批号的复合维生素B片4种成分含量，结果见表 6.对于所测定的成分，4个样品（包括1个过期样品）中VB1、VB2和烟酰胺的含量测定值均在药典规定的标示量范围（90.0%~110.0％）内.泛酸钙的含量测定结果偏低，可能与标准中没有其含量测定的方法和定量指标有关.

3 结论

以对苯二甲醛为内标、DMSO-d₆为溶剂，建立了同时测定复合维生素B片中4种有效成分VB1、VB2、烟酰胺和泛酸钙的¹H qNMR定量方法.通过对（样品/内标）质量比与NMR峰面积比的线性关系考察发现：可以用绝对定量法计算各组分的含量，在实际测定样品时可以不使用容易吸潮的标样.最后，使用该方法实际测定了4种复合维生素B片样品中VB1、VB2、烟酰胺和泛酸钙的含量.本法操作简便，结果可靠.