波谱学杂志  2016, Vol. 33 Issue (1): 133-141

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李远哲, 邱莉, 尹秋月, 毛璞, 肖咏梅, 屈凌波, 袁金伟
LI Yuan-zhe, QIU Li, YIN Qiu-yue, MAO Pu, XIAO Yong-mei, QU Ling-bo, YUAN Jin-wei
31P NMR在二异丙基香豆素-3-膦酸酯合成中的应用研究
Spectroscopy Study on Synthesis of Diisopropyl Coumarin-3-Phosphate by 31P NMR
波谱学杂志, 2016, 33(1): 133-141
Chinese Journal of Magnetic Resonance, 2016, 33(1): 133-141
http://dx.doi.org/10.11938/cjmr20160113

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收稿日期: 2015-08-20
收修改稿日期: 2016-01-22
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李远哲, 邱莉, 尹秋月, 毛璞, 肖咏梅, 屈凌波, 袁金伟. 31P NMR在二异丙基香豆素-3-膦酸酯合成中的应用研究[J]. 波谱学杂志, 2016, 33(1): 133-141.
LI Yuan-zhe, QIU Li, YIN Qiu-yue, MAO Pu, XIAO Yong-mei, QU Ling-bo, YUAN Jin-wei. Spectroscopy Study on Synthesis of Diisopropyl Coumarin-3-Phosphate by 31P NMR[J]. Chinese Journal of Magnetic Resonance, 2016, 33(1): 133-141.
31P NMR在二异丙基香豆素-3-膦酸酯合成中的应用研究
李远哲1, 邱莉1, 尹秋月2, 毛璞2, 肖咏梅2, 屈凌波2, 袁金伟2    
1. 广西医科大学 药学院, 广西 南宁 530021;
2. 河南工业大学 化学化工学院, 河南 郑州 450001
收稿日期: 2015-08-20; 收修改稿日期: 2016-01-22
基金项目: 河南省科技厅自然科学基金资助项目(142102210410),河南省教育厅自然科学研究计划资助项目(12A15007, 14B150053);郑州市科技局自然科学基金资助项目(20130883, 131PCXTD605).
作者简介: 李远哲(1989-),男,河南平顶山人,硕士研究生,主要从事天然产物化学的研究.
*通讯联系人: 邱莉，电话： 13878897164， E-mail： qlydmyyq@163.com；袁金伟，电话： 0371-67756718，E-mail： yuanjinwei@haut.edu.cn.
摘要: 通过核磁共振磷谱(31P NMR)对香豆素-3-二异丙基膦酸酯合成的反应过程进行跟踪,讨论了香豆素与亚磷酸二异丙酯在AgNO3催化下的反应机理,并对反应条件进行了优化,对该反应的区域选择性位点进行了分析.
关键词: 核磁共振磷谱(31P NMR)     香豆素-3-二异丙基膦酸酯     合成    
Spectroscopy Study on Synthesis of Diisopropyl Coumarin-3-Phosphate by 31P NMR
LI Yuan-zhe1, QIU Li1 , YIN Qiu-yue2, MAO Pu2, XIAO Yong-mei2, QU Ling-bo2, YUAN Jin-wei2     
1. Pharmaceutical College, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China;
2. School of Chemistry & Chemical Engineering, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China
Abstract: Synthesis of diisopropyl coumarin-3-phosphate was tracked by 31P NMR, and the reaction mechanism was discussed using the materials of coumarin and diisopropyl H-phosphite and AgNO3 as the catalyst. The reaction conditions are optimized, and the regioselectivity of the reaction site is analyzed.
Key words: 31P NMR     diisopropyl coumarin-3-phosphate     synthesis    
引言

香豆素[图 1(a)]是一类重要的天然产物，其衍生物具有广泛的生物活性，如抗菌抗炎、抗老年痴呆、抗HIV和抗胸腺癌等[1, 2, 3].3-膦酰化香豆素衍生物[图 1(b)]作为香豆素的含磷衍生物，对人类的白血病细胞具有较强的细胞毒性[4]，因此，研究3-膦酰化香豆素衍生物的合成具有重要的实际意义.该类化合物的合成通常采用Knoevenagel反应或Arbuzov反应来实现[5, 6]，但是这些方法需要多步反应，且条件相对比较苛刻，缺乏经济性和实用性.2012年，Zhou等人[7]以Mn(OAc)3为催化剂、脂肪酸为溶剂，使香豆素与亚磷酸酯通过自由基反应得到3-膦酰化香豆素衍生物.2013年，Mi等人[8]以金属Pd为催化剂、2，2¢-联吡啶等为配体、K2S2O8为氧化剂，使香豆素与亚磷酸酯通过金属活化3位质子得到3-膦酰化香豆素衍生物.2014年，Mi等人[9]以Ag2CO3为催化剂，以炔酯与亚磷酸酯通过自由基反应得到3-膦酰化香豆素衍生物.但是这些合成方法或需要酸做溶剂、或需使用贵金属为催化剂、或需用到不易得到的反应前体，因此需要探索一种新的合成3-膦酰化香豆素衍生物的方法.

图 1 香豆素(a)与3-膦酰化香豆素衍生物(b)的结构 Fig. 1 Structures of coumarin(a) and coumarin-3-phosphate derivative(b)
图选项

本文以香豆素与亚磷酸二异丙酯为原料、AgNO3为催化剂、Mg(NO3)2×6H2O为辅助剂，通过自由基反应直接对香豆素3位实现了膦酰化，得到目标产物3-膦酰化香豆素衍生物.但在合成过程中，存在自由基反应副反应多、条件不易控制和选择性差等问题，为了探索反应机理和最佳反应条件，本文通过核磁共振磷谱(31P NMR)跟踪反应过程，准确检测到反应组分中含磷化合物的变化情况，推断出最佳的反应机理与反应条件，并通过二维核磁共振(2D NMR)技术确证了香豆素的反应位点.

1 实验部分 1.1 仪器及试剂

NMR实验在Bruker Avance 400型超导核磁共振谱仪测定，样品采用氘代氯仿(CDCl3)为溶剂，四甲基硅烷(TMS)为内标；质谱(MS)用美国Agilent LC-MSD-Trap-XCT质谱仪测定，配备电喷雾离子源(ESI)，样品采用甲醇(CH3OH)溶解；香豆素(98%)、亚磷酸二异丙酯(98%)、Mg(NO3)2×6H2O(99%)等购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；乙腈、乙酸乙酯、石油醚、AgNO3、碳酸氢钠、氯化钠等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；柱层析硅胶(300~400目)购自青岛海洋化工有限公司.

1.2 实验方法 1.2.1 31P NMR跟踪亚磷酸二异丙酯与AgNO3的反应

在10 mL带有氮气(N2)保护的反应瓶中加入亚磷酸二异丙酯(1.0 mmol，166 mg)、AgNO3(0.025 mmol，4.2 mg)和Mg(NO3)2×6H2O(0.25 mmol，64 mg)，加入干燥的乙腈(1 mL)，N2保护下在油浴中加热搅拌下反应(图 2)，反应温度为100 ℃，通过31P NMR方法跟踪反应的进程.

图 2 亚磷酸二异丙酯与AgNO3的反应 Fig. 2 The reaction of diisopropyl H-phosphite with AgNO3
图选项
1.2.2 二异丙基香豆素-3-膦酸酯的合成

在10 mL带有氮气(N2)保护的反应瓶中加入香豆素(0.5 mmol，73 mg)和亚磷酸二异丙酯(1.0 mmol，166 mg)，溶解在干燥的乙腈(1.0 mL)中，然后加入AgNO3(0.025 mmol，4.2 mg)和Mg(NO3)2×6H2O(0.25 mmol，64 mg)，N2保护下在油浴中加热搅拌下反应(图 3)，反应温度为100 ℃，通过31P NMR方法跟踪反应进程.反应结束后，减压蒸除溶剂，残液中加入10 mL乙酸乙酯，用20 mL饱和的碳酸氢钠溶液洗涤二次，再用10 mL饱和的氯化钠溶液洗涤一次，溶液浓缩后用层析硅胶柱提纯[洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚(V/V)= 1/5]，得到白色固体0.078 g，产率为50.3%，熔点：95~96 ℃(文献报道为94~96 ℃[8]).红外光谱IR(KBr)ν(cm-1)：2 981，2 935(-CH3)，1 738(C=O)，1 614，1 566(Ar-)，1 450(P-C)，1 248(P=O)，1 105(P-O).ESI MS m/z：311.3 [M + H]+(计算值：C15H20O5P+ m/z为311.1).

图 3 二异丙基香豆素-3-膦酸酯的合成路线 Fig. 3 Synthetic pathway of diisopropyl coumarin-3-phosphate
图选项
1.2.3 二异丙基香豆素-3-膦酸酯的NMR测定

将目标化合物二异丙基香豆素-3-膦酸酯溶解于氘代氯仿溶剂中进行NMR测定.1H NMR观测频率是400.13 MHz，90°脉冲宽度为13.6 μs；13C NMR的观测频率是100.62 MHz，90°脉冲宽度为10.3 μs；31P NMR的观测频率是161.98 MHz，90°脉冲宽度为9.0 μs；1H-1H COSY F2维(1H)和F1维(1H)谱宽均为8 223 Hz，累加次数为1，采样数据点阵t2× t1= 1 024 × 512，零填充后FT变换点阵F2× F1 = 1 024 × 1 024；1H-13C HSQC F2维(1H)和F1维(13C)谱宽分别为8 223和24 037 Hz，累加次数为2，采样数据点阵t2× t1= 1 024 × 256；1H-13C HMBC F2维(1H)和F1维(13C)谱宽分别为8 223和24 037 Hz，累加次数为8，d2 = 1/2 JCH = 3.0 ms(JCH为一键碳氢远程偶合常数)，采样数据点阵t2× t1= 1 024 × 512.DEPT谱宽为24 037 Hz，累加次数为1.

2 结果与讨论 2.1 反应机理的推测

根据文献[10, 11]报道，磷自由基能够通过亚磷酸酯与AgNO3反应而得到.对照本文目标化合物二异丙基香豆素-3-膦酸酯的合成方法，推测可能是自由基反应机理.为了进一步验证推测，首先，通过31P NMR方法跟踪亚磷酸二异丙酯与AgNO3的反应如(图 4所示).由图 4可知：随着反应时间的增加，原料亚磷酸二异丙酯(δP 5.44)的积分面积逐渐减小；中间体——((CH3)2CHO)2(O)PAg复合物(δP -7.29)的积分面积逐渐增加；部分副产物(δ P -12.22和δ P -15.23)的积分面积也逐渐增加；当反应时间为4 h时，反应原料与中间体复合物的积分面积基本保持不变，反应达到一个平衡.结果表明：在AgNO3存在下，与亚磷酸二异丙酯能够反应形成中间体——((CH3)2CHO)2(O)PAg复合物.

图 4 31P NMR跟踪亚磷酸二异丙酯与AgNO3的反应 Fig.4 31P NMR tracing on the reaction of diisopropyl H-phosphite with AgNO3
图选项

然后，通过31P NMR跟踪AgNO3催化下亚磷酸二异丙酯与香豆素的反应(如图 5所示).由图 5可知：随着反应时间的增加，亚磷酸二异丙酯(δP 5.44)的积分面积逐渐减小；中间体——((CH3)2CHO)2(O)PAg复合物(δP -7.29)的积分面积先增加后减小；目标产物二异丙基香豆素-3-膦酸酯(δP 8.20)的积分面积逐渐增加；且随着反应时间的增加，部分副产物(δP 7.78、δP 12.48和δP 13.12)的积分面积也逐渐增加.实验结果表明：该反应经过中间体——((CH3)2CHO)2(O)PAg复合物的形成，最终得到目标产物.结合文献[12, 13]报道，推测该反应可能的反应机理如图 6所示：该反应首先经历中间体复合物，再形成磷自由基；然后发生磷自由基的加成；最后通过消去质子得到目标产物.

图 5 31P NMR跟踪亚磷酸二异丙酯与香豆素的反应 Fig.5 31P NMR tracing on the reaction of diisopropyl H-phosphite with coumarin
图选项
图 6 推测的反应机理 Fig.6 The proposed reaction mechanism
图选项
2.2 反应条件的选择

在合成过程中，反应原料的物质的量之比、反应溶剂、温度和时间等因素都会影响产率.考虑到自由基反应副反应多，选择香豆素与亚磷酸酯物质的量之比为1:2；结合相关文献[13]，选择乙腈为反应溶剂，反应温度为100 ℃.且经过初步的条件筛选，发现反应时间对产率影响较大.考虑到31P NMR能准确检测到反应组分中含磷化合物的变化情况，因此，通过31P NMR跟踪该反应过程.随着反应时间的增加，该反应中亚磷酸二异丙酯的转化率、目标产物的产率和部分副产物生成率的变化情况如图 7所示.由图 7可知：亚磷酸二异丙酯的转化率随时间的增加逐渐增加，5 h时转化率达到最高(89.7%)，继续增加时间，转化率变化不大；目标化合物的产率随时间的增加而增加，5 h时达到最高(53.5%)；在0~2 h内几乎无副产物的生成，2 h后随反应时间的增加副产物的生产量逐渐增加，5 h时达到(26.3%).综合考虑，选择5 h为最佳的反应时间.

图 7 反应时间对反应的影响(■亚磷酸二异丙酯的转化率；●目标化合物的产率；▲副产物的生成率；其计算方法均根据31P NMR的积分面积计算得到) Fig.7 The influence of reaction time on the reaction(■The conversion rate of diisopropyl H-phosphite;●The yield of the target compound; ▲The production rate of by-product; and they are obtained by the integral area of 31P NMR respectively)
图选项
2.3 目标化合物的NMR解析

在目标化合物的13C NMR谱中出现了12个信号，分别对应化合物结构中15个碳原子(其中C-11与C-11¢峰重合，C-12¢与C-12¢峰重合，分别包含两个碳原子).依据DEPT谱可以确定12个碳信号中有个2伯碳信号，6个叔碳信号和4个季碳信号.

在1H NMR谱中，根据香豆素衍生物质子化学位移规律和偶合裂分规律[14, 15, 16]，高场区质子峰δH 1.38(6H，d，J = 6.0 Hz)和1.30(6H，d，J = 6.0 Hz)应归属为H-12和H-12¢；δH 4.79~4.87(2H，m)应归属为H-11和H-11¢.低场区质子峰δH 8.49(1H，d，JPH = 6.9 Hz)应归属为H-4.在1H-1H COSY谱中，δH 8.49与δH 7.56~7.63(2H，m)，δH 7.56~7.63(2H，m)与δH 7.28~7.32(2H，m)质子峰相关，δH 7.56~7.63(2H，m)被归属H-5和H-7，δH 7.28~7.32(2H，m)被归属为H-6和H-8；H-11(11¢)与H-12(12¢)相关，进一步证明H-11(11¢)和H-12(12¢)质子峰归属的正确性.在13C NMR谱中，处于最低场的δC 158.0(d，JPC = 22.9 Hz)应归属为2位的C=O中的碳.C-10由于受到氧原子的影响，其化学位移应该在较低场，结合其DEPT谱中为季碳，因此δC 155.2被归属为C-10.

在1H-13C HSQC谱中，δC 152.9(d，JPC = 10.7 Hz)与H-4相关，被归属为C-4；δC 134.0和129.3分别与δH 7.56~7.63(H-5或H-7)相关，被归属为C-5或C-7；δC 124.8和116.8分别与δH 7.28~7.32(H-6或H-8)相关，被归属为C-6或C-8；δC 72.2(d，JPC = 9.8 Hz)与H-11(11¢)相关，被归属为C-11(11¢)；δC 24.0(d，JPC = 6.8 Hz)与23.8(d，JPC = 7.6 Hz)分别与H-12和H-12¢相关，被归属为C-12和C-12¢.在1H-13C HMBC谱中(图 8)，C-2和H-4远程相关，C-10与H-4、H-5、H-7和H-8远程相关，C-4与H-5远程相关，证实了C-2，C-10和C-4归属的正确性.δC 129.3与H-4远程相关，因此被归属为C-5，则δC 134.0应该被归属为C-7；C-7与H-5远程相关，进一步证实归属的正确性.δC 119.9与H-6远程相关，因此被归属为C-9；δC 118.0(d，JP-C = 22.7 Hz)与H-4相关，被归属为C-3.

图 8 二异丙基香豆素-3-膦酸酯的1H-13C HMBC图谱 Fig.8 1H-13C HMBC spectrum of diisopropyl coumarin-3-phosphate
图选项

通过2D NMR对化合物的1H NMR和13C NMR数据进行了全归属(表 1)，可以初步确定NMR数据与其结构一致.目标化合物的31P NMR化学位移为δ 8.20，由于化合物的结构中含有P原子，因此其周围的C和H受P原子影响发生了裂分.如C-2、C-3和C-4均受到P原子的影响而发生了裂分.这个事实同时证明：该反应具有一定的区域选择性，香豆素发生膦酰化反应的位点是3位，而不是4位.因为假设反应位点是4位，则C-9会发生裂分，C-2将不会发生裂分.

表 1 二异丙基香豆素-3-膦酸酯的1H和13C NMR数据 Table 1 1H and 13C NMR data of diisopropyl coumarin-3-phosphate
Position dC(J/Hz) dH(J/Hz) 1H-13C HSQC 1H-1H COSY 1H-13C HMBC
2 158.0(d，22.9) / / / H-4
3 118.0(d，22.7) / / / H-4
4 152.9(d，10.7) 8.49(1H，d，6.9) + H-5 H-5
5 129.3 7.56~7.63(1H，m) + H-6 H-4，7
6 124.8或116.8 7.28~7.32(1H，m) + H-7，5 H-8
7 134.0 7.56~7.63(1H，m) + H-8，6 H-5
8 116.8或124.8 7.28~7.32(1H，m) + H-7 H-6
9 119.9 / / / H-6
10 155.2 / / / H-4，5，7，8
11，11¢ 72.2(d，9.8) 4.79~4.87(2H，m) + H-12，12¢ H-12，12¢
12 24.0或23.8(d，6.8) 1.38或1.30(6H，d，6.0) + H-11 H-11
12¢ 23.8或24.0(d，6.8) 1.30或1.38(6H，d，6.0) + H-11¢ H-11¢
注： m 表示多重峰，d表示双峰，+ 表示存在相关，/表示没有检测到信号
表选项
3 结论

本文利用31P NMR对反应过程进行了跟踪，证实了该反应经历了中间体复合物，形成了磷自由基；而且对反应时间等因素的影响进行了探索，确定了最佳的反应条件；并且通过2D NMR技术确证了香豆素的反应位点，并对其1H和13C NMR数据进行了全归属.

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