波谱学杂志  2016, Vol. 33 Issue (1): 117-124

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韩伟健, 林晓彤, 郭娜, 陈俏, 张婷婷, 许枬
HAN Wei-jian, LIN Xiao-tong, GUO Na, CHEN Qiao, ZHANG Ting-ting, XU Nan
泽泻盐制前后成分转化的1H NMR分析
Changes of Chemical Constitution in Alismatis rhizoma after Saline Processing as Revealed by 1H NMR Analysis
波谱学杂志, 2016, 33(1): 117-124
Chinese Journal of Magnetic Resonance, 2016, 33(1): 117-124
http://dx.doi.org/10.11938/cjmr20160111

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收稿日期: 2015-03-31
收修改稿日期: 2016-01-21
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韩伟健, 林晓彤, 郭娜, 陈俏, 张婷婷, 许枬. 泽泻盐制前后成分转化的1H NMR分析[J]. 波谱学杂志, 2016, 33(1): 117-124.
HAN Wei-jian, LIN Xiao-tong, GUO Na, CHEN Qiao, ZHANG Ting-ting, XU Nan. Changes of Chemical Constitution in Alismatis rhizoma after Saline Processing as Revealed by 1H NMR Analysis[J]. Chinese Journal of Magnetic Resonance, 2016, 33(1): 117-124.
泽泻盐制前后成分转化的1H NMR分析
韩伟健, 林晓彤, 郭娜, 陈俏, 张婷婷, 许枬    
辽宁中医药大学 药学院, 大连 116600
收稿日期: 2015-03-31; 收修改稿日期: 2016-01-21
基金项目: 国家公益性行业专项课题资助项目(200807039).
作者简介: 韩伟健(1991-),男,硕士研究生,研究方向为天然化学成分核磁共振谱学特征的研究,电话:0411-85890191,E-mail:youhwj@foxmail.com.
*通讯联系人: 许枬，电话： 0411-85890191, E-mail: xudanbs@163.com.
摘要: 泽泻为临床常用中药,是五苓散、龙胆泻肝丸及六味地黄丸等经典方剂的主要组成.我国药典收载了泽泻的两种饮片,即生饮片和盐制片.传统理论认为泽泻生饮片和盐制片功效不同,生饮片偏重于利水泄热,盐制后泄热作用缓和,小剂量可用于补益剂,但其物质基础还不清楚,难以有效控制饮片的制备工艺和成品质量.为了深入揭示泽泻生饮片和盐制片的成分差异,以及盐制过程中成分的转化,该研究运用基于核磁共振氢谱(1H NMR)技术的代谢组学方法研究了泽泻生饮片与盐制片的化学成分差异及盐制过程中的成分变化.结果表明,泽泻生饮片与盐制片成分差异较大,而且随着盐制时间的延长成分变化愈加明显.采用偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)显示,δH 1.34信号对泽泻生饮片和盐制饮片在主成分1(t [1])方向的分离贡献最大.不同盐制时间条件下δH 3.82、3.78、3.66、1.34、0.92和1.30处的泽泻醇类成分特征信号变化明显,提示泽泻盐制过程中原萜烷型泽泻醇类成分可能发生脱水、脱乙酰基和氧化反应.该文为深入了解泽泻盐制过程成分转化提供了可靠依据.
关键词: 核磁共振氢谱(1H NMR)     泽泻     代谢组学     炮制     成分转化    
Changes of Chemical Constitution in Alismatis rhizoma after Saline Processing as Revealed by 1H NMR Analysis
HAN Wei-jian, LIN Xiao-tong, GUO Na, CHEN Qiao, ZHANG Ting-ting, XU Nan     
School of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China
Abstract: As a commonly used traditional Chinese medicine (TMC), Alismatis rhizoma is the main ingredient of many classical formulas, such as Wu Ling San, Long Dan Xie Gan Wan and Liu Wei Di Huang Wan. Both the raw slices of Alismatis rhizoma and the slices processed with saline arelisted are prescription drugs in the Pharmacopoeia of People's Republic of China. TMC theory thinks the raw and processed slices of Alismatis rhizoma are different in function. The raw slices are emphasized on its actions of alleviating water retention and dispersing heat, whiles the processed slices are thought ineffective in these respects. The active components in these two types of Alismatis rhizoma slices remained poorly understood, making standardizing the saline processing procedure and quality control difficult. In this paper, we applied 1H NMR based metabonomic approach to investigate the difference of chemical constitution between the raw and salt-processed slices of Alismatis rhizome. The result showed that the chemical constitution of the Alismatis rhizoma slices changed significantly after salt-processing, and such changes were influenced by the length of processing time. In PLS-DA analysis, the signals of alisols at δ 3.82, 3.78, 3.66, 1.34, 0.94, and 1.30 changed significantly under different processing conditions, indicating that alisols were perhaps the chemical fingreprints contributing the different functions of raw and salt-processed Alismatis rhizoma slices.
Key words: 1H NMR     Alismatis rhizoma     metabonomic analysis     processing     chemical constitution    
引言

中药炮制过程不仅发生化学成分量的变化[1]，也发生质的变化[2]．炮制后化学成分含量或降低[3]、或升高[4]，从而造成中药炮制前后主治功能的改变[5]．因此，炮制的实质就是导致中药化学成分转变的过程．因中药成分复杂，炮制前后发生变化的成分含量相对较低，使追踪、识别和捕获生制品和炮制品之间的差异成分缺乏有效手段．故揭示炮制过程中成分的转变是中药炮制基础研究的关键[6].

中药泽泻为泽泻科植物泽泻[Alisma orientalis(Sam.)Juzep]的干燥块茎．市售饮片主要有生饮片(生泽泻)和盐制片(盐泽泻)[7]．传统理论认为，生泽泻利水泄热作用较强，常用于治疗小便不利、水肿、湿热黄疸、浊淋和湿热带下，如伤寒论的《五苓散》中用的是生饮片．盐制后泄热作用缓和，常以小剂量用于补益剂，如用于治疗阴虚火旺症．本课题组前期研究发现，泽泻盐制前后成分发生转变，其中变化显著的是含量较高的23-乙酰泽泻醇B和24-乙酰泽泻醇A[8, 9]．为深入揭示盐制过程对泽泻成分的影响，有必要对其盐制前后成分变化进行整体性的考查，从而为解析盐制前后成分变化规律、及成分转变与功用变化的相关性提供科学依据．核磁共振氢谱(1H NMR)技术可同时检测样品中所有氢核信号，且重现性好、分析时间短，在分析复杂中药成分方面独具优势[10, 11, 12]．因此，本文采用基于1H NMR的代谢组学方法分析了泽泻盐制过程中的化学成分变化，并建立了追踪、识别中药复杂成分在炮制过程中变化的分析方法.

1 实验部分 1.1 仪器与试剂

Bruker Avance 600型核磁共振谱仪(布鲁克公司)；超声波提取器(昆山市超声仪器有限公司，超声频率为250 Hz)；Satorius电子天平(德国赛多利斯公司)．氘代甲醇(上海国药集团化学试剂有限公司).

市售泽泻生饮片(14批)，分别购于沈阳市和北京市的药房，经辽宁中医药大学王冰教授鉴定为植物泽泻[Alisma orientalis(Sam.)Juzep]的根茎.

泽泻盐制片的制备：依据《中国药典》收录的盐炙法[12]，取泽泻生饮片，加质量分数为2%的NaCl水溶液拌匀、闷透，于160 ℃下分别炒制2、5和7 min，制成3种炮制条件的泽泻盐制片(每种盐制片包含14个样本).

1.2 实验方法 1.2.1 供试品的制备

取泽泻生饮片和盐制片各5 g，粉碎，精密称取50 mg，置于5 mL EP管中，加入900 μL氘代甲醇(MeOD)，于35 ℃超声处理30 min，离心10 min(14 000 rpm)，取上清液600 μL至内径为5 mm的NMR样品管中，加入体积分数为3‰的四甲基硅烷(TMS)，进行1H NMR图谱测试.

1.2.2 测试条件

供试品在配备BBO探头的Bruker Avance 600型超导傅里叶变换核磁共振波谱仪上进行分析，采样温度为298.2 K，采用30度单脉冲程序zg30(Avance version：07/04/03)采集图谱．采样时间为5.453 s，谱宽为6 009.6 Hz，采样点数为64 k，累加次数为128，弛豫延迟为1 s．自由感应衰减信号(FID)经过傅立叶变换得到一维NMR图谱；以TMS定标(δ 0.00)；然后手动进行基线和相位校正.

1.2.3 谱图处理和数据分析

采用TOPSPIN V2.1软件处理原始图谱后，用Mnova软件对谱图进行分段积分(24 Hz)，去除溶剂MeOD及水产生的共振信号区域(δH 3.15~3.35及δH 4.40~5.25)，并将所有数据相对于TMS峰面积进行归一化，然后将数据导入SIMCA-p V11.5(Umetrics，Sweden)进行偏最小二乘法判别分析(PLS-DA).

2 结果与讨论 2.1 泽泻生饮片和盐制片的1H NMR谱图分析

泽泻的次生代谢产物主要为C-30骨架的三萜(原萜烷)和C-15骨架的倍半萜．如图 1所示，以MeOD为提取溶剂的1H NMR谱的高场区显示了原萜烷类化合物的特征甲基质子信号δH 0.90、1.04、1.08、1.29和1.33，以及乙酰化物的特征信号δH 2.06[13]；低场区则显示了愈创木烷型倍半萜类化合物烯烃质子H-6的特征信号δH 5.41[13]．这表明以MeOD为提取和测试溶剂的1H NMR指纹图谱可以有效表征泽泻的主要次生代谢物(见图 2)．与生饮片相比，盐制片的1H NMR谱图在高场和低场区都有较明显的变化，这表明盐制过程对泽泻的化学成分产生了较大的影响，而1H NMR技术能够很好地表征这些变化.

图 1 泽泻生制品饮片的1H NMR图谱．(a)泽泻生饮片，(b)泽泻盐制片，与(a)图相比放大20倍 Fig. 1 1H NMR spectra of Alismatis rhizoma and it products processed with saline in CD3OD.(a)raw slices of Alismatis rhizoma，(b)salt-processed slices of Alismatis rhizome，magnifying vertically 20 fold relative to(a)
图选项
图 2 泽泻中主要化学成分的结构及母核 Fig. 2 Structures and carbon skeleton of chemical compound in Alismatis rhizoma
图选项
2.2 泽泻生饮片和盐制片的PLS-DA分析

将归一化处理后的1H NMR数据导入SIMCA进行PLS-DA分析，由得分矢量图(图 3)可以看出：泽泻生饮片和盐制片分别集中在不同区域，说明生饮片和盐制片成分差异较大；盐制5和7 min的两组样品部分重叠，但它们与盐制2 min的样品完全分离，说明盐制时间对成分影响较大，但影响达到一定程度后趋于稳定．该模型的t[1]和t[2]对X变量解释达81.4%；Q2为0.752，表明该模型稳定性很好.

图 3 泽泻生饮片和盐制片1H NMR谱图的PLS-DA得分矢量图 Fig. 3 PLS-DA score plot(t[1] vs. t[2])obtained from the 1H NMR spectra of raw and salt-processed slices of Alismatis rhizoma in CD3OD
图选项

由PLS-DA载荷矢量图(图 4)可以看出：δH 1.34对泽泻盐制片和生饮片在p[1]方向的分离贡献最大；δH 3.74、3.82、3.78、3.66、2.34、1.34、1.30和0.94则使样品在p[2]方向分离．其中，dH 3.78、3.82、3.66、3.74属于脂肪连氧碳上的质子信号，被归属为泽泻醇类化合物的甘油三酯侧链[13, 14]；δH 1.34、0.94、1.30被归属为泽泻醇类化合物的甲基信号(泽泻中含量较高的泽泻醇类成分的部分1H NMR数据见表 1)，由此提示泽泻醇类成分在盐制过程中可能发生了显著变化．综上可见，160 ℃条件下盐制时间的控制对泽泻醇类成分含量的影响至关重要；泽泻盐制过程中发生变化的成分可能包括23-乙酰泽泻醇B、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇G、24-乙酰泽泻醇E、24-乙酰-25脱水泽泻醇A、23-乙酰-25-脱水泽泻醇E、泽泻醇A和24-乙酰-25脱水泽泻醇E.

图 4 泽泻生饮片和盐制片1H NMR谱图的PLS-DA载荷矢量图 Fig. 4 PLS-DA obtained from the 1H NMRspectra of raw and salt-processed slices of Alismatis rhizoma in CD3OD
图选项
表 1 泽泻中主要泽泻醇类成分的部分1H NMR数据[12] Table 1 1H NMR data of alisol compounds of Alismatis rhizoma[12]
化合物 结构中主要氢核的化学位移(dH)
H-11 H-23 H-24 H-26 H-27
23-乙酰泽泻醇B 3.80 4.61 2.73 1.30 1.33
24-乙酰泽泻醇A 3.83 3.83 4.60 1.16 1.34
泽泻醇G 3.86 3.34 3.78 4.93，4.96 1.67
24-乙酰泽泻醇E 3.81 3.51 4.76 1.23 1.30
24-乙酰-25脱水泽泻醇A 3.83 4.72 4.20 4.91，4.94 1.67
23-乙酰-25-脱水泽泻醇E 3.81 4.76 3.52 4.91，4.97 1.67
泽泻醇A 3.88 3.75 3.00 1.22 1.27
24-乙酰-25脱水泽泻醇E 3.81 4.76 3.66 4.97，4.98 1.67
表选项
2.3 讨论

泽泻的化学成分研究表明，泽泻的主要活性成分为原萜烷型三萜和愈创木完型倍半萜．其中三萜类成分的主要活性包括降血脂、利尿和抑制尿结石形成等，倍半萜类成分的主要活性为调节肾脏平滑肌收缩．这些化学成分的活性与泽泻的利水渗湿、降血脂功效基本吻合[13, 14, 15]．因此，这些成分的吸收峰能够在泽泻饮片1H NMR谱图上很好的表征是分析泽泻炮制过程中成分变化的首要条件．本文先后采用多种溶剂作为提取和测试溶剂，因MeOD所得的1H NMR谱图能够较好表征上述两类化合物，故实验中选择MeOD作为提取和测试溶剂.

前期的高效液相色谱(HPLC)分析发现(见图 5)[8]，泽泻市售生饮片与盐制片成分差异较大，而且不同批次市售泽泻盐制片的成分也有较大差异，提示盐制过程对泽泻的化学成分影响较大．深入研究化学成分在泽泻盐制过程中的变化，对泽泻盐制片的质量控制具有重要意义.

图 5 市售泽泻生饮片和盐制片的HPLC色谱图．1、2为泽泻生饮片，3~9为不同批次的市售泽泻盐制片．S：24-乙酰泽泻醇A，S1：23-乙酰泽泻醇B Fig. 5 HPLC spectra of purchased raw(1，2) and salt-processed(3~9)slices of Alismatis rhizoma in CD3OD S: Alisol A 24-acetate; S1: Alisol B 23-acetate
图选项

原萜烷是泽泻的主要活性成分，有调节肾脏Na-K-ATP酶、降血脂和肾脏细胞的活性，与水盐代谢和脂代谢密切相关，其中降血脂代表性成分为23-乙酰泽泻醇B和24-乙酰泽泻醇A，二者盐制后含量有所降低．而其他三萜成分含量所有升高，可能是泽泻盐制后利尿作用增强、降血脂作用降低的主要原因，这与传统中医的“盐入肾”“热从水道而出”药理相吻合.

3 结论

该文采用基于1H NMR的代谢组学方法对泽泻盐制过程中的成分转化进行了分析．揭示了在盐制过程中泽泻成分的变化特征，发现三萜类成分在泽泻盐制过程中变化显著．实验结果表明，1H NMR技术可有效识别、追踪炮制过程中成分转化，为深入解析泽泻盐制过程中成分转化机理提供可靠依据.

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