引言

定量核磁共振方法(QNMR)已经发展成为一种完备的工具，用于药物^[1]、天然产物^[2-4]、代谢组学^{[5, 6]}、食品^[7-10]等物质与材料的结构解析和组成分析.准确的NMR定量要求谱图具有较高的分辨率和无畸变.

¹H和¹³C QNMR是目前使用最广泛的NMR定量方法.¹H NMR谱虽然灵敏度高，但由于谱宽窄、同核异核J裂分、对磁场不均匀性敏感等因素的影响，通常比较拥挤、谱峰难以识辩.特别是对于大分子或复杂混合物，谱峰数目增加，谱线随着分子量的增加而变宽^[11]，因此分析困难.即使引入去卷积的方法，定量结果的准确性仍然难以得到保障.与之相比，¹³C检测的QNMR谱因谱宽较宽、谱线较窄等因素而具有更高的分辨率，故常用于复杂样品的定量分析.但¹³C QNMR极低的灵敏度严重制约了其广泛应用.为提高¹³C QNMR的检测灵敏度，DEPT和INEPT等极化转移技术被引入至¹³C QNMR，并逐渐取代反门控去偶¹³C QNMR技术，成为广受关注的QNMR技术.其中，Q-DEPT方法通过循环选择极化转移时间[Δ]_4x1和读出脉冲角度[θ]_4x1来平均异核J耦合常数(115~220 Hz)和读出脉冲对不同自旋体系的信号强度响应^[11].但该方法近似认为cos(πJΔ)=0，因此忽略了含cos(πJΔ)项的信号强度贡献，造成SI₂，SI₃的定量不完全.针对Q-DEPT中存在的问题，Q-DEPT⁺方法完善了SI₂，SI₃的定量，并将J的范围扩大到90~230 Hz，进一步提高了方法的普适性^[12].然而，Q-DEPT⁺的可观测算符中存在反向单量子相干，可能导致相位畸变和多重峰畸变^[13].对于弱耦合体系而言，谱畸变问题表现不明显，因此Q-DEPT⁺能够满足一般样品定量需求，但对于强耦合体系而言，谱畸变问题表现明显，定量的准确性则难以保障.DEPT⁺⁺方法有效地消除这些反向单量子相干，解决了谱畸变问题^[13].因此，为进一步提高定量的准确性，本文拟将Q-DEPT⁺方法的定量思想扩展到DEPT⁺⁺中，以消除谱峰畸变对定量的影响.在实验之前，我们采用积算符方法^[14]对DEPT⁺⁺的演化过程进行了详细推导，理论分析结果发现观测信号的强度和符号与DEPT以及文献[13]和仪器说明的结果不同.我们对此进行了实验验证和分析，结果显示我们的理论分析正确.进而我们采用Q-DEPT⁺技术中所采用的多极化转移时间和读出脉冲技术，将DEPT⁺⁺用于定量测定.结果表明：所建立的Q-DEPT⁺⁺方法能够有效地消除谱峰畸变问题.

1 理论分析

据文献[13]报道，DEPT可观测的算符中不仅含有同向相干算符，还含有可能产生畸变的反向相干算符S_x，如I_1zS_y、I_2zS _y和4I_2zI_3zS_x等.这些反向相干算符中含的算符可能会产生相位畸变，而4I_2zI_3zS_x等算符可能会产生多重峰畸变.每两次扫描，在DEPT采样之前增加一个180° I_y，然后将两次的FID相加，可以消除DEPT中的相位畸变，该技术被称为DEPT⁺.然而，DEPT⁺中仍然存在多重峰畸变.DEPT⁺⁺充分考虑畸变产生的原因，在脉冲序列设计上巧妙地将I核与S核的化学位移重聚，使得最终可观测的算符中仅含有同向相干算符S_x.因此，DEPT⁺⁺从根本上消除了相位畸变和多重峰畸变的影响.同基于DEPT定量的Q-DEPT⁺一样，采用多极化转移时间和读出脉冲我们可以实现定量Q-DEPT⁺⁺.

在定量应用之前，我们首先利用积算符对DEPT⁺⁺中3种自旋体系的观测算符进行了详细的理论表征.在表征过程中，为了便于表示，我们将DEPT⁺⁺标准脉冲序列分成不同时间单元，如图 1所示.在算符演变中，我们统一采用右旋表示法，即.x→y→-x→-y.

为了便于说明，我们以I₂S（I为高灵敏核，S为低灵敏核）自旋体系为例，假设初始状态I自旋处于平衡态，则密度算符表示为：

$ {\sigma _0} = {I_{1z}} + {I_{2z}} $

(1)

I核的第一个90°_x脉冲将磁化矢量扳转至横向，产生方向的横向相干：

$ {\sigma _1} = - ({I_{1y}} + {I_{2y}}) $

(2)

经过Δ延时，自旋在J耦合作用后：

$ {\sigma _2} =-{c_J}({I_{1y}} + {I_{2y}}) + {s_J}2({I_{1x}} + {I_{2x}}){S_z} $

(3)

其中，${c_J} = \cos (\pi J\Delta ), {s_J} = sin(\pi J\Delta ) $.图 1中1~4期间I核经过Δ-180°_y-Δ的演化，化学位移被重聚，因此无需考虑I核的化学位移演化.由于(3)式中第一项在后续演化过程中不产生自旋的磁化矢量，对FID（自由感应衰减信号）没有贡献，故在随后的分析中被简化为$ {s_J}2({I_{1x}} + {I_{2x}}){S_z} $.经过180°$ ({I_{1y}} + {I_{2y}}) $、90°S_x的脉冲作用后变换为：

$ {\sigma _3} = {s_J}2({I_{1x}} + {I_{2x}}){S_y} $

(4)

由于Δ为毫秒级（约1/2J），远大于脉冲延时，故可近似认为图 1中3~12期间S核经过3Δ/2 -180°_y-3Δ/2的演化，化学位移被重聚.算符σ₃在I-S自旋耦合作用下演化Δ后为：

$ {\sigma _4} = {s_J}[{c_J}2({I_{1x}} + {I_{2x}}){S_y}-{s_J}4({I_{1x}}{I_{2z}} + {I_{1z}}{I_{2x}}){S_x}] $

(5)

σ₄在读出脉冲(θI_y)作用下，演变成σ₅：

$ \begin{array}{l} {\sigma _5} = {s_J}{c_J}{c_\theta }2({I_{1x}} + {I_{2x}}){S_y}-{s_J}{c_J}{s_\theta }2({I_{1z}} + {I_{2z}}){S_y} + {s_J}{s_{2\theta }}4{I_{1z}}{I_{2z}}{S_x}\\ -{s_J}{s_{2\theta }}4{I_{1x}}{I_{2x}}{S_x}-{s_J}{c_{2\theta }}4({I_{1x}}{I_{2z}} + {I_{1z}}{I_{2x}}){S_x} \end{array} $

(6)

(6)式中${c_\theta } = \cos \theta $，${s_\theta } = \sin \theta $，${c_{2\theta }} = \cos (2\theta )$, ${s_{2\theta }} = \sin (2\theta )$.DEPT⁺⁺消除谱峰畸变的关键之一，就是在读出脉冲作用前保持I自旋的化学位移被完全重聚，经过后面的净化脉冲(purging pulse)作用使得异核多量子相干(heteronuclear multiple-quantum coherence)不会被转换成反向相干，从而避免引入新的畸变.

在图 1的5~8过程中，I核的化学位移重聚，保留I-S自旋的J耦合演化，该过程可等价为[180°_y (I, S), Δ].首先，σ₅经过180°_y (I, S)脉冲作用后得到密度算符$ \bar{\bar{\sigma }} $：

$ \begin{align} & \bar{\bar{\sigma }}=-{{s}_{J}}{{c}_{J}}{{c}_{\theta }}2({{I}_{1x}}+{{I}_{2x}}){{S}_{y}}+{{s}_{J}}{{c}_{J}}{{s}_{\theta }}2({{I}_{1z}}+{{I}_{2z}}){{S}_{y}}-{{s}_{J}}^{2}{{s}_{2\theta }}4{{I}_{1z}}{{I}_{2z}}{{S}_{x}} \\ & +{{s}_{J}}^{2}{{s}_{2\theta }}4{{I}_{1x}}{{I}_{2x}}{{S}_{x}}+{{s}_{J}}^{2}{{c}_{2\theta }}4({{I}_{1x}}{{I}_{2z}}+{{I}_{1z}}{{I}_{2x}}){{S}_{x}} \\ \end{align} $

(7)

再在J耦合作用下经过Δ时间的演化，得到σ₈：

$ \begin{array}{l} {\sigma _8} =-{s_J}{c_J}^2{c_\theta }2({I_{1x}} + {I_{2x}}){S_y} + {s_J}^2{c_J}{c_\theta }4({I_{1x}}{I_{2z}} + {I_{1z}}{I_{2x}}){S_x}\\ {\rm{ }} + {s_J}{c_J}^3{s_\theta }2({I_{1z}} + {I_{2z}}){S_y}\underline {-{s_J}^2{c_J}^2{s_\theta }2{S_x}}-{s_J}^2{c_J}^2{s_\theta }8{I_{1z}}{I_{2z}}{S_x}\\ {\rm{ }} - {s_J}^3{c_J}{s_\theta }2({I_{1z}} + {I_{2z}}){S_y} + {s_J}^2{c_J}^2{s_{2\theta }}4{I_{1z}}{I_{2z}}{S_x}\\ {\rm{ }} + {s_J}^3{c_J}{s_{2\theta }}2({I_{1z}} + {I_{2z}}){S_y}\underline { + {s_J}^4{s_{2\theta }}{S_x}} - {s_J}^2{s_{2\theta }}4{I_{1x}}{I_{2x}}{S_x}\\ {\rm{ }} - {s_J}^2{c_J}{c_{2\theta }}4({I_{1x}}{I_{2z}} + {I_{1z}}{I_{2x}}){S_x} - {s_J}^3{c_{2\theta }}2({I_{1x}} + {I_{2x}}){S_y} \end{array} $

(8)

从积算符表达(8)式可以看出，经历了3Δ时间的演化，自旋体系产生了同向单量子相干S_x[(8)式中横线标注]，其中，第二项的表达式与文献报道不符，推测可能是该项引入了错误符号.接下来的I自旋90°_x脉冲为净化脉冲，其为DEPT⁺⁺消除谱畸变的关键，其主要作用是将可能会产生畸变的反向单量子相干算符全部转化为异核多量子相干σ₉：

$ \begin{array}{l} {\sigma _9} =-{s_J}{c_J}^2{c_\theta }2({I_{1x}} + {I_{2x}}){S_y}-{s_J}^2{c_J}{c_\theta }4({I_{1x}}{I_{2y}} + {I_{1y}}{I_{2x}}){S_x}-{s_J}{c_J}^3{s_\theta }2({I_{1y}} + {I_{2y}}){S_y}\\ {\rm{ }} - {s_J}^2{c_J}^2{s_\theta }2{S_x} - {s_J}^2{c_J}^2{s_\theta }8{I_{1y}}{I_{2y}}{S_x} + {s_J}^3{c_J}{s_\theta }2({I_{1y}} + {I_{2y}}){S_y}\\ {\rm{ }} + {s_J}^2{c_J}^2{s_{2\theta }}4{I_{1y}}{I_{2y}}{S_x} - {s_J}^3{c_J}{s_{2\theta }}2({I_{1y}} + {I_{2y}}){S_y} + {s_J}^4{s_{2\theta }}{S_x} - {s_J}^2{s_{2\theta }}4{I_{1x}}{I_{2x}}{S_x}\\ {\rm{ }} + {s_J}^2{c_J}{c_{2\theta }}4({I_{1x}}{I_{2y}} + {I_{1y}}{I_{2x}}){S_x} - {s_J}^3{c_{2\theta }}2({I_{1x}} + {I_{2x}}){S_y} \end{array} $

(9)

算符σ₉中只有两项为可观测算符，均为不产生谱畸变的同向单量子相干(in-phase coherence).其它均为异核多量子相干算符（对FID无贡献），因此σ₉可简化为σ'₉：

$ {\sigma '_9} =-2{s_J}^2{c_J}^2{s_\theta }{S_x} + {s_J}^4{s_{2\theta }}{S_x} $

(10)

在随后的$\tau /2 - 180^\circ {I_x} - \tau /2$作用后σ₉演化成σ₁₂：

$ {\sigma _{12}} =-2{s_J}^2{c_J}^2{s_\theta }{S_x} + {s_J}^4{s_{2\theta }}{S_x} $

(11)

采样之前I自旋与S自旋化学位移都得到了重聚，可观测的算符只有同向单量子相干.我们分析发现σ₁₂中第二项的符号与文献报道的相反，如果将θ替换为(180°-θ)即可得与文献[13]报道相符的算符表达式σ'₁₂：

$ {\sigma '_{12}} = - (2{s_J}^2{c_J}^2{s_\theta }{S_x} + {s_J}^4{s_{2\theta }}{S_x}) $

(12)

与此类似，IS、I₃S自旋体系的可观测算符如下：

$ \sigma (IS) =-{s_J}^2{s_\theta }{S_x} $

(13)

$ \sigma ({I_3}S) =-(3{c_J}^4{s_J}^2{s_\theta }\underline {-2{c_J}^2{s_J}^4{s_{2\theta }}} + {s_J}^63{c_\theta }2{s_\theta }){S_x} $

(14)

(14)式中下划线标注项符号与文献报道的相反.同样地，将(13)、(14)式中θ用180°-θ替代，结果与文献报道相同.由此可见，若将θ设为45°，则DEPT⁺⁺ 45°谱中I₂S与IS、I₃S符号相反；反之，DEPT⁺⁺ 135°谱中I₂S与IS、I₃S同向，这一结果与DEPT以及文献和仪器说明的结果相反.此外，需要说明的是，读出脉冲的相位循环为+y和-y，表现在脉冲的角度上是θ与-θ，其作用结果是产生两个符号相反的FID信号，将两次信号相减即可获得信号累加，该信号为I核向S核极化转移的增强信号，而S核自身产生的信号不受读出脉冲相位的影响，两次信号相减可将其抵消.

2 结果与讨论

为了验证我们的理论分析，以便建立Q-DEPT⁺⁺谱，我们首先对常规的DEPT⁺⁺和DEPT谱进行了对比分析.并以DEPT 45°和135°谱为参照，明确DEPT⁺⁺谱与读出脉冲角度的关系.

所有实验是在自主研发的配有ID探头的500 MHz波谱仪上完成^[15]，选用样品为0.1 mL 2-丁醇D₂O溶液，为了缩短采样恢复时间，在溶液中额外加了0.07 g/L CuSO₄作为弛豫试剂.实验测得¹H和¹³C的90°脉冲宽度分别为5.12 μs和13.60 μs.实验中，¹³C的谱宽均设为δ 80，采样点数为10 k，反门控H-1去耦方式为WALTZ16，弛豫等待时间为5s ( > 5T₁)，极化转移时间Δ=1/2J，对应的耦合常数设为130 Hz，DEPT及DEPT⁺⁺的读出角度分别设为45°和135°.FFT变换选用指数函数，加宽因子为3，所得结果如图 2所示.

图 2显示DEPT⁺⁺ 135°谱与我们的理论分析相符，所有CH₂与CH、CH₃信号均为同相位；与常规的DEPT 45°谱一致.同样地，DEPT⁺⁺ 45°谱与DEPT 135°谱特征相同，CH₂与CH、CH₃符号相反.对上述谱中4个谱峰信号进行归属，归属结果如表 1.

以上理论分析和实验表明，如果要将Q-DEPT⁺技术进行扩展，原来优化的极化转移时间和读出脉冲仍然可用，但是读出脉冲需要进行相应的调整，即需要将原来的读出脉冲调整180°，将Q-DEPT⁺实验所用的读出脉冲θ用180°-θ替代，进而可以采用Q-DEPT⁺⁺实验进行检测，以消除畸变，并保持定量特性.Q-DEPT⁺⁺与Q-DEPT⁺实验所需极化转移时间和读出脉冲等关键参数见表 2.

为了方便对比，我们选用强耦合体系玉米油样品(V_oil:V_CDCl3=1:2)，以Q-DEPT⁺为参照，对Q-DEPT⁺⁺的谱峰畸变抑制效果进行检测.实验测得的¹³C和¹H的90°脉冲宽度分别为14.00 μs和11.25μs，弛豫延时为50 s ( > 5T₁)，采样点数为48 k，谱宽为Δ160，反门控H-1去耦，去耦方式为WALTZ16.谱图处理采用参数如下：填零至128 k，加指数窗，加宽因子lb=1.所得玉米油的Q-DEPT⁺⁺与Q-DEPT⁺谱如图 3所示.

图 3中可明显看出，图 3(a)的Q-DEPT⁺谱中在δ20~35位置的谱线存在明显的畸变，即虚线框部分的谱线，畸变问题导致难以相位校正、基线校正，因此严重影响这些信号的定量分析.而Q-DEPT⁺⁺谱[图 3(b)]中无明显谱峰畸变现象.由此可见，DEPT⁺⁺方法能够用于定量检测过程以消除相关Q-DEPT⁺谱中存在的谱峰畸变问题.然而，在玉米油的Q-DEPT⁺⁺的定量结果分析中我们还发现，一些信号的Q-DEPT⁺⁺的测量误差超出5%，说明Q-DEPT⁺⁺谱用于定量分析还需要进一步优化，造成误差增大的可能原因：频偏效应和T₂弛豫效应的影响.

3 结论

我们对DEPT⁺⁺谱进行了详细理论分析，发现DEPT⁺⁺谱和DEPT具有近乎相反的谱峰特征，该结果与文献报道的表达不同.基于这一特点，我们对Q-DEPT⁺技术进行了扩展，初步建立了Q-DEPT⁺⁺谱技术，并将这一技术用于玉米油的定量检测分析中，结果发现，在Q-DEPT⁺谱中存在严重的谱峰畸变现象，而Q-DEPT⁺⁺谱中无明显谱畸变，表明Q-DEPT⁺⁺技术能够很好地消除Q-DEPT⁺存在的相位畸变和多重峰畸变问题.