引言

目前基于fMRI技术的脑科学研究可分为实验时对被试施加刺激任务的任务态fMRI研究和实验时不对被试施加刺激任务的静息态fMRI研究^[1].在任务态fMRI实验中，对被试施加刺激任务可采用对应人体不同感觉的不同施加方式.由于人体通过视觉接收的外界信息最多，且视觉刺激的可控性最好，故目前主要通过视觉刺激进行人脑视觉系统及其他高级功能的研究.然而，要对人脑有全面的认识，其他感觉刺激（听觉、嗅觉、味觉和触觉^[2]）信息的中枢神经处理机制同样也很重要，亟待深入研究.最近研究表明，人脑的嗅觉功能会在阿尔兹海默病和帕金森病早期出现衰退，通过嗅觉fMRI实验可以进一步揭示其深层次机制，可能对这两种病症的早期预警和诊断提供新的手段^{[3, 4]}.

任务态fMRI研究要求刺激时间点和成像时间点具有精确的对应关系，进行嗅觉fMRI实验时通过简易的给气装置对被试手动进行嗅觉刺激会引入人为随机因素，无法保证刺激时间的精确性和实验的可重复性.为了精确可靠地进行嗅觉fMRI研究，对被试进行嗅觉刺激时必须使用可以兼容MRI环境的自动化嗅觉刺激装置.

目前用于任务态fMRI的视觉、听觉刺激装置已经发展成熟，商业化产品较多，而嗅觉刺激装置却发展缓慢.这主要是因为相对于视觉、听觉刺激，嗅觉刺激属于化学刺激，需要在给定时间点向被试通入一定浓度的特异性气味气体，同时不能引起其他感觉的干扰刺激，控制难度大，且刺激的精确度也受到限制.尤其是在刺激的时间分辨率上，视觉刺激可以将刺激图像的呈现控制在几个ms之内，而嗅觉刺激的过渡时间一般只能控制在1~5 s.此外，人体的嗅觉感受具有和视觉、听觉感受不同的特点，也会限制嗅觉刺激装置的设计，具体表现为人体只有在呼吸的吸气相才能有嗅觉感受和嗅觉适应现象.根据吸气相感受的特点可以将嗅觉刺激装置分为呼吸同步的超短刺激装置和非呼吸同步的持续刺激装置，前者适用于采用事件相关设计模式研究嗅觉与人脑高级功能之间的关系等需要高精度短刺激的场合，后者适用于采用组块设计模式研究特异性气味人脑激活区等需要持续刺激的场合.嗅觉适应现象则限制了持续刺激时的刺激持续时间.

现阶段用于嗅觉fMRI的刺激装置主要由各研究机构根据课题需求自行搭建，方案、性能各异^{[5-8, 11]}，成本普遍较高，不利于实验室之间结果的对比，商用产品更是凤毛麟角.此外，也有研究者将嗅觉诱发电位仪进行适当改装用于嗅觉fMRI的刺激呈现.刘剑锋等人^[8-10]采用无磁化改装的国产OEP-98C型嗅觉诱发电位仪进行嗅觉事件相关fMRI研究，该装置采用的是200 ms超短刺激、刺激末端开放的刺激方式，在被试吸气相手动释放气味刺激.本文所述的刺激装置采用的是非呼吸同步持续刺激、刺激末端气路封闭的刺激方式，刺激时间精度优于2 s.文中探讨了嗅觉fMRI实验设计中的各种影响因素，归纳出嗅觉刺激装置的具体需求，采用相对简单的低成本、模块化方案对其进行设计实现，并通过实验验证了其可用性.

1 实验部分 1.1 刺激装置搭建 1.1.1 需求分析

适用于任务态fMRI的嗅觉刺激装置需要满足的功能包括以下方面^[12].①在一个刺激任务中可以实现多种气味刺激.本文设计的刺激装置可以在一个刺激任务中满足3种不同气味的刺激（包含无味对照刺激），并且可以通过增加气体支路很容易地增加刺激气味的种类.②尽量减少其他的无关刺激.嗅觉刺激在进行气路切换时，气流的突变往往会引起鼻腔内三叉神经的触觉刺激，同时也会引起听觉刺激，需要尽量减轻或避免.另外，刺激气流的流量超过一定范围也可引起触觉刺激，故气流流量需要可调.③刺激气体浓度可以调节，并在一个刺激任务中保持基本不变.④刺激与成像时间同步.fMRI实验得到的每一帧图像都要和当时的刺激条件一一对应，才能进行进一步数据处理和分析.⑤满足电磁兼容要求.MRI仪器工作时会对周围环境造成非常强烈的电磁干扰，而外界对它的轻微电磁干扰也会使其成像质量下降，所以刺激装置处于屏蔽室的部分最好采用无磁设计，以避免相互干扰.

1.1.2 总体设计

整个刺激装置分为气路系统和控制系统.为了满足电磁兼容要求，将控制系统和气路系统的气泵和气流分支部件布置在操作室，气路系统的其余无磁部件布置在屏蔽室，气管透过屏蔽室波导管与气泵及控制系统相连，如图 1所示.

1.1.3 气路设计

气路系统由气泵、过滤器、分支管、流量计、电磁阀、洗气瓶、单向阀、汇流管、呼吸面罩及它们之间的连接管路构成.气泵将无味的空气通入装有特异性气味溶液的洗气瓶后成为特异性气味气体，刺激气体的浓度在刺激过程中不能进行调节，但可以在实验前通过改变洗气瓶中的溶液的浓度定性地改变.

分支管将气泵输出的空气分到4条支路中，其中3条分别对应3种刺激气味，包括一条用于对照组的无味气路和两条用于实验组的特异性气味气路，这3条气路上设置有洗气瓶和电磁阀，同一时间只能有一条打开；剩余一条是通入空气的恒流支路，其上不设置洗气瓶和电磁阀，在刺激过程中保持打开状态，用来消除气味切换时的流量突变.进行无味对照刺激时，气路系统中设置了纯水洗气瓶的气路和恒流支路同时打开；进行特异性气味刺激时，设置了特异性气味气体溶液洗气瓶的气路和恒流支路同时打开，实验过程中不同条件下的总气体流量不变.通过流量计调节流量，使4条支路中设置了洗气瓶的3条支路流量为180 L/h，恒流支路流量可以根据具体被试的感受进行调节，流量范围为30~60 L/h，故总的刺激气体流量为210~240 L/h.经多次实验，在此流量下，可以在不使被试产生触觉感觉的前提下尽量缩短气味切换时的过渡时间.

此外，在洗气瓶前后设置单向阀，可以避免气路中不同气味污染其余支路或在终端生成混合气味气体.为了尽量缩短气路切换后的过渡时间，需要使气路中汇流管后到呼吸面罩之间所有刺激气体都要经过的“公共气路”最短，故将汇流管和用于气味发散的洗气瓶尽量布置得靠近人体鼻端，置于屏蔽室MRI仪器磁体腔内靠近被试头部的位置.为了达到电磁兼容要求，屏蔽室内的部件均采用玻璃或塑料材质.气路系统整体结构及布置如图 2所示.

1.1.4 硬件设计

为了降低成本且易于搭建，控制系统采用模块化的虚拟仪器方案，由PC机、数据采集卡、电源、驱动板及电磁阀组成，如图 3所示.

1.1.5 软件设计

控制系统的软件运行于PC上，基于LabVIEW平台，采用图形化语言编程，简单高效，平台集成了所选用数据采集卡的驱动，开发周期短.软件提供刺激序列设计和刺激序列呈现两个功能.其中刺激序列设计是指实验人员通过PC上该软件的人机界面输入刺激任务，包括刺激气味顺序和刺激呈现的时间等参数，如图 4(a)所示；刺激序列呈现是指实验人员发出“开始刺激”的指令后，软件控制数据采集卡根据设计好的刺激序列实现电磁阀的顺序开闭，进而控制被试端刺激气味的呈现，同时软件在PC上输出包含刺激气味和刺激时间点的刺激记录文件，用于数据处理时和成像时间进行同步^[13]，如图 4(b)所示.

为了保证刺激序列呈现的定时精确性，程序设计采用双循环（while循环）程序架构^[14]，包括“界面循环”和“数字输出循环”，运行于CPU的不同核心之上.其中“界面循环”内采用事件结构处理刺激序列设计时的人机界面交互；“数字输出循环”采用LabVIEW设计模板中的“经典状态机”框架，包含“空闲”、“DO(Digital Output)”、“定时”3个状态，其中“DO”状态按照刺激序列依次输入出控制信号，并保存刺激记录文件，然后转到“定时”状态中按照刺激序列维持相应的时间，达到持续刺激的效果，定时完成后根据刺激序列是否结束转入“空闲”或“DO”状态，如图 5所示.

将嗅觉刺激装置各部分装配调试好后，使用多名正常被试进行模拟刺激实验，刺激装置工作正常，过渡时间很短，被试无不良感受.

1.2 刺激装置验证 1.2.1 实验材料

为了验证嗅觉刺激装置的可用性，使用其对一名被试进行嗅觉fMRI实验.被试为右利手、无嗅觉障碍的健康男性志愿者，27岁，实验前签署“被试知情同意书”.扫描设备为Siemens 3.0T Trio Tim MRI成像仪，扫描序列为EPI序列，TR为2 000 ms，TE为30 ms，层厚为3 mm，共33层覆盖全脑，扫描矩阵为64×64，FOV为22 cm×22 cm.

实验试剂采用乙酸异戊酯和吡啶（国药集团化学试剂有限公司），前者用液体石蜡稀释，体积分数为1.5%，后者用纯水稀释，体积分数为0.1%.两种溶液都具有挥发性，乙酸异戊酯为果香气味，属愉快气体；吡啶为刺激性臭味，属于非愉快气体.人体极少量吸入这两种气体时无毒害反应^[15].

1.2.2 实验设计

实验设计采用组块设计^[16]，刺激序列如图 6所示.刺激装置洗气瓶中分别装入纯水、乙酸异戊酯溶液和吡啶溶液100 mL，在图 6中“纯水刺激”、“乙酸异戊酯刺激”、“吡啶刺激”时分别导通相应气路.为了避免长时间刺激导致嗅觉适应^[17]，Task2和Task3中气味刺激任务采用间断刺激的方式，20 s气味刺激和25 s无味刺激交叉进行.另外，考虑到被试开始时状态不稳，前40 s的数据在后处理时丢弃不用.

实验前在刺激装置软件中输入刺激序列，并将刺激装置PC与MRI仪器的系统时间调整为一致，误差精确到1 s以内.实验时先用MRI仪器开始成像，然后马上用刺激装置开始刺激任务，刺激装置执行完刺激序列后停止MRI成像.检查刺激装置PC中自动生成的刺激记录中的开始时间和结束时间，结合MRI图像中的成像时间，筛选出对应刺激序列的图像集用于数据处理，达到时间同步的目的.

实验时让被试采取仰卧位，闭上眼睛，戴隔音耳罩，尽量保持静止，均匀呼吸，不主动闻刺激气体，不刻意辨别刺激气体的种类.实验过程中使用MRI仪器配套的呼吸监测装置记录被试呼吸情况，如果出现呼吸波不规律或其他异常及时停止实验重新开始.实验结束后要求被试填写实验感受记录以掌握实验过程中真实情况.

1.2.3 数据处理

使用基于Matlab软件的SPM8工具包进行脑激活分析.其中首先进行数据预处理，具体包括图像格式转换、时间层校正、头动校正、空间标准化和高斯平滑（半宽全高=4 mm）；然后根据实验中生成的刺激记录文件和MRI图像成像时间点（由DICOM格式图像附加信息得到）将刺激条件和MRI图像进行匹配得到实验条件，使用SPM8对其进行个体统计分析；最后以图像的形式输出乙酸异戊酯和吡啶的激活结果.

将乙酸异戊酯脑激活区中左侧眶额叶和左侧岛叶中的激活团簇分别作为ROI，使用基于SPM8的MarsBaR工具包提取其激活信号强度数据^[18]，将所有数据点转换为相对于对照刺激时平均激活强度的变化率，并将其绘制成随时间变化的曲线，把它与刺激序列比较以验证刺激装置的可用性.

2 结果与讨论 2.1 实验结果

根据1.2.3节所述步骤得到如图 7(a)所示P < 0.001，体素核团 > 5时的乙酸异戊酯矢状脑激活图。在其中分别选取位于左侧眶额回和左侧岛叶上的激活区（眶额回激活为图中矩形框所示，岛叶激活为图中椭圆形框所示）作为ROI，根据1.2.3节所述步骤得到如图 7(b)和图 7(c)所示的ROI激活信号随时间的变化曲线.

2.2 讨论

从图 7(a)所示的两幅乙酸异戊酯刺激脑激活图可以看出乙酸异戊酯刺激在左侧眶额叶和岛叶中有明显激活，这两个脑区均与嗅觉功能相关^{[15, 17]}.从将这两个区域中脑激活团簇作为ROI得到的图 7(b)和图 7(c)中可以看出，在气味刺激开始的第140 s及400 s处，两个ROI均出现了不同程度的信号突变，表明被试及时感受到了气味刺激.在吡啶刺激时，两个ROI的激活信号强度总体处于上升状态，而在吡啶刺激间隔中，激活信号则先维持稳定，然后趋于下降，信号强度的总体变化趋势与吡啶刺激序列一致.在490~510 s吡啶刺激对应的信号曲线与吡啶刺激序列相比略有延迟，这可能与刺激开始时被试的呼吸状态有关.在乙酸异戊酯刺激过程中，虽然和吡啶一样，插入了无味的25 s纯水刺激，但信号强度没有出现明显的周期性变化，此外乙酸异戊酯刺激引起的激活信号强度明显弱于吡啶刺激引起的激活信号强度.由此可见，在相同的刺激时间和间隔时间下，人脑同一区域对不同刺激气味的激活反应可能不同.总之，ROI激活信号的时间曲线图和刺激序列之间存在较强的对应关系，由此验证了嗅觉刺激装置的可用性.

嗅觉感受会受到呼吸相的影响，一般人平稳状态下的正常呼吸周期约为3~6 s.在非呼吸同步持续刺激的嗅觉fMRI实验设计中，为了保证刺激的有效性，一种刺激的持续时间要比视听觉刺激的持续时间长得多，本次实验采用20 s的刺激持续时间，效果良好.在实验过程中，最好同步监测被试的呼吸状态，如果呼吸不规律，被试对刺激的感受一定不符合刺激序列的设计意图，要及时放弃实验结果.此外，人类存在嗅觉适应现象，即嗅觉感受会随着刺激时间的延长而下降，这就要求在气味刺激中插入一定时间的无味刺激，以保证人脑对一种气味持续敏感，本次实验采用25 s的间隔时间，从ROI激活信号看，可以区隔出激活信号，适当延长间隔时间可能使激活信号更加显著.

3 结论

本文设计的嗅觉刺激装置可以自动地对被试在fMRI实验中进行嗅觉刺激，具有较好的时间精确度，并可以很方便地达到刺激和成像的时间同步，初步满足嗅觉fMRI实验的需求.它的缺点是在刺激过程中气味气体的浓度不可以进行调节，而且随着刺激时间的增长会不断下降，不可以用于超长时间刺激，在每次实验前都要重新在洗气瓶中添加新溶液，以保证每次实验的刺激浓度相同.

通过以上分析可知，为了更好地满足嗅觉fMRI实验的需要，fMRI嗅觉刺激装置可以采取以下更复杂的设计以满足更多功能.①呼吸同步刺激.监测被试呼吸，并在被试吸气相进行刺激，在呼气相停止刺激，这种条件下可以把每次呼吸作为一个事件，采取事件相关设计范式设计实验，进行更精细的研究，但对刺激装置的时间分辨率要求很高.②接收被试反馈信号.在装置中集成键盘等被试反馈系统，可以要求被试针对特定刺激做出反馈，为研究人脑嗅觉功能提供更丰富的数据.

致谢: 感谢华东师范大学上海磁共振重点实验室杜小霞副教授在实验操作和数据处理等方面给予的热心指导.感谢中国科学院“引进海外杰出人才计划”和上海市磁共振重点实验室开放课题的支持.