波谱学杂志  2014, Vol. 31 Issue (3): 407-414

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安志敏, 马二倩, 杨秋青
AN Zhi-min, MA Er-qian, YANG Qiu-qing
2-酮基-L-古龙酸结构发生改变的核磁共振研究
Structural Changes of 2-Keto-L-Gulonic Acid Studied by NMR Spectroscopy
波谱学杂志, 2014, 31(3): 407-414
Chinese Journal of Magnetic Resonance, 2014, 31(3): 407-414

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收稿日期: 2013-10-11
收修改稿日期: 2014-07-20
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安志敏, 马二倩, 杨秋青. 2-酮基-L-古龙酸结构发生改变的核磁共振研究[J].波谱学杂志, 2014, 31(3): 407-414.
AN Zhi-min, MA Er-qian, YANG Qiu-qing . Structural Changes of 2-Keto-L-Gulonic Acid Studied by NMR Spectroscopy[J]. Chinese Journal of Magnetic Resonance, 2014, 31(3): 407-414.
2-酮基-L-古龙酸结构发生改变的核磁共振研究
安志敏, 马二倩, 杨秋青     
河北师范大学 化学与材料科学学院，分析测试中心，河北 石家庄 050024
收稿日期: 2013-10-11 ; 收修改稿日期: 2014-07-20
基金项目: 河北师范大学自然科学基金资助项目(L2011Y09)
作者简介: 安志敏(1988-)，女，河北张家口人，硕士研究生，主要从事有机化学及波谱分析研究
*通讯联系人: 杨秋青，电话：0311-80786318，E-mail: qiuqingyang@sina.com
摘要: 发现并揭示了2-酮基-L-古龙酸在许多种溶剂中发生了结构改变，该物质在室温条件下，无需施加任何外力因素，分子中极易发生分子内成环结构变化：分子中的羰基(-C=O)双键断开变单键，形成了2, 5位半缩醛五元环衍生物，使分子内出现了O-C-O基团，其标题化合物的核磁共振碳谱(13C NMR)羰基特征峰的化学位移(约200)变到了96，核磁共振2D HMBC异核相关谱，充分证明了2-酮基-L-古龙酸发生的分子内环合成衍生物的主要产物是五元环的2, 5位半缩醛衍生物，而非六元环的2, 6位半缩醛衍生物.
关键词： 液体核磁共振(liquid NMR)     结构变化     2D NMR     2-酮基-L-古龙酸    
Structural Changes of 2-Keto-L-Gulonic Acid Studied by NMR Spectroscopy
AN Zhi-min, MA Er-qian, YANG Qiu-qing     
College of Chemistry and Material Science, Analysis and Testing Center, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050024, China
* Corresponding author: YANG Qiu-qing, Tel: 0311-80786318, E-mail: qiuqingyang@sina.com
Abstract: 2-keto-L-gulonic acid (2-KLG) changes its molecular structure in many solvents at room temperature. A five-membered intramolecular ring structure can easily be formed by the 2, 5-hemiacetal reaction after the opening of the carbonyl group in 2-KLG (-C=O) to form a O-C-O interlinkage. In this study, we showed that the 13C chemical shift of the carbonyl changed from δ200 towards high field to about δ96 after forming the intramolecular ring. Two-dimensional HMBC experiments revealed that 2-keto-L-gulonic acid formed five-membered ring 2, 5-hemiacetal derivates in seven solvents, instead of six-membered 2, 6-hemiacetal derivates.
Key words: liquid NMR     structure changes     2D NMR     2-keto-L-gulonic acid[1] Boudrant J. Microbial processes for ascorbic acid biosynthesis[J]. Enzyme Microb Technol, 1990, 2(5): 322-324.    
引言

众所周知维生素C(Vc)是人体必需的水溶性维生素之一，也是一种重要的维生素类药物，可用于预防和治疗相关疾病，还可作为强化剂和抗氧化剂大量地用于食品行业.而2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）是生产维生素C的前体物质，或者说是合成Vc的重要的中间体.维生素C的生产方法主要有两种：莱氏法和两步发酵法[1, 2]，所制备的2-酮基-L-古龙酸经过酸转化法或碱转化法转化为Vc[3].为了简化工艺路线和提高产品收率，近年来，各国科学家也在探索和研究一些新的途径.然而无论用什么途径生产2-酮基-L-古龙酸，对2-酮基-L-古龙酸的准确鉴定是至关重要的.而确保物质分子结构的准确性，核磁共振波谱技术(NMR)又是分子结构鉴定中最强有力的手段之一. NMR技术具有深入分子内部，而不会破坏分子本身的特点，而且检测速度快，是其它波谱法所不能替代的.

2-酮基-L-古龙酸除了熔点159 ℃~162 ℃有报道外，其物理性质如溶解性、沸点、折射率等等均为未确定，与2-酮基-L-古龙酸有关的文章也都是集中在如何转化成维生素C上[4, 5]，它本身的物化性质相关的文章极少，对2-酮基-L-古龙酸的NMR结构归属未见报道，特别是关于2-酮基-L-古龙酸在溶液中本身结构发生了改变这一情况，也未见任何报道.为此本文的研究具有重大的意义.

1 实验部分 1.1 仪器与试剂

仪器：所有1H及13C一维和二维实验均在AVⅢ-500型NMR谱仪上进行，该仪器生产厂商为德国Bruker公司，产地：瑞士.

溶剂：重水(D2O)、氘代二甲基亚砜(DMSO)、氘代甲醇(CD3OD)、氘代丙酮[(CD3)2CO]、氘代乙腈(CD3CN)、氘代三氟乙酸加少量氘代盐酸(CF3COOD+DCl)和氘代乙酸加少量氘代盐酸(CH3COOD+DCl)，氘代试剂为美国CIL产品；2-酮基-L-古龙酸（纯度为92%），工业级，石药集团维生药业（石家庄）有限公司提供.

1.2 测试条件

测定温度：室温.常温下，取2-酮基-L-古龙酸样品适量，分别溶于氘代试剂：水、二甲基亚砜、丙酮、甲醇、乙腈、醋酸和三氟乙酸中，为了增加2-KLG在醋酸和三氟乙酸中的溶解性，向其溶液中加入了少量盐酸，以TMS为内标，D2O作溶剂时，以溶剂水峰(δ 4.79)为参考峰，1H NMR和13C NMR的工作频率分别为500.13和125.76 MHz，谱宽分别为10 330.58 Hz和29 761.90 Hz.二维谱包括2D梯度场1H-1H COSY，HSQC及HMBC谱，均采用标准脉冲程序. 1H-1H COSY的F2 (1H)和F1 (1H)维的谱宽均为3 001.20 Hz，采样数据点阵t2×t1=2 048×256；HSQC的F2 (1H)和F1 (13C)维的谱宽分别为3 001.20 Hz和25 154.07Hz，采样数据点阵t2×t1=2 048×256；HMBC的F2 (1H)和F1 (13C)维的谱宽分别为3 001.20 Hz和25 154.07 Hz，采样数据点阵t2×t1=4 096× 256.

2 结果与讨论 2.1 水中的核磁共振谱归属及解析

通过核磁共振氢、碳谱(1H、13C NMR)的各种实验技术，表明了在溶液中2-酮基-L-古龙酸的结构发生如下变化：由结构式I转变为结构式Ⅱ（见图 1）.首先将2-酮基-L-古龙酸的氢谱和碳谱进行解析与归属，以重水溶液中的谱图为例进行氢和碳的归属（见表 1）.

图 1 2-酮基-L-古龙酸在结构变化中的3种可能结构式 Fig. 1 Three possible structures of 2-keto-L-gulonic acid
图选项

表 1 2-酮基-L-古龙酸在D2O中的氢、碳谱归属 Table 1 1H、13C NMR assignments for 2-keto-L-gulonic acid in D2O
δHδCHSQC1H-1H COSYHMBC
1/171.6//H-3, H-4, H-5
2/96.01//H-3, H-4, H-5, H-6
33.6873.24+H-4H-4, H-5, H-6
43.6869.03+H-3, H-5H-3, H-5, H-6
53.7272.26+H-4, H-6H-3, H-4, H-6
63.68, 3.7962.35+H-5H-3, H-4, H-5
表选项

在1H NMR谱中，各谱峰的积分面积之比（由低场至高场）为1：1：3，表明共有5个质子，由于分子结构式中的4个-OH和一个-COOH与D2O发生交换，故该活泼氢未显示出来，除去活泼氢外，该分子的氢质子数与2-酮基-L-古龙酸的质子总数相符.由于上述5个H质子间均是彼此相连，相互之间的偶合造成谱图中各CH峰间相互交叠严重，从二维同核COSY相关谱上也很难准确的归属，结合氢谱积分面积和异核HSQC近程相关，可以先确定6位氢(-CH2)上的两个质子是磁不等价质子，因它们在HSQC中具有同一个相关点，其δH值分别为δ 3.68和δ 3.79；3位和4位氢(-CH)与上述-CH2 (H-6)中的其中一个重叠在δ 3.68处，积分值为3；故剩余的δ 3.72则归属为5位氢.由于H-3，H-4和H-5化学环境相近，它们是否归属正确，还有待于下面的验证.

在13C NMR谱（图 2）中，共有6个峰，说明本品分子中含6个碳，与2-酮基-L-古龙酸的碳总数相符.其中羧基碳(C-1)的化学位移谱峰(δ171.6)很明显，且在DEPT135和DEPT90均不出峰，δ 171.6很容易辨认和归属为C-1（见图 2）；在13C-DEPT 135谱中，只有δ 62.35是负峰并与6位H有HSQC近程相关，故该碳归属C-6；上述氢谱中的δ 3.68共有3个氢，除了归属H-6a外，同时在HSQC中还与两个碳峰(δ 73.24和δ 69.03)有相关点，并与C-1在HMBC中有远程相关，故这两个碳所对应的氢应归属H-3和H-4（两氢重叠见图 3），且这两个碳在DEPT90中，均为正峰，故分别归属C-3和C-4；在13C-DEPT90中，还有一个正峰δ 72.26，表明它也是-CH基团，且在HSQC中它与H-5相关，故该碳归属为C-5.

图 2 D2O中2-酮基-L-古龙酸的核磁共振碳谱 Fig. 2 13C NMR spectrum of 2-keto-L-gulonic acid in D2O
图选项

图 3 D2O中2-酮基-L-古龙酸的核磁共振二维相关HSQC谱（局部扩展图） Fig. 3 2D HSQC spectrum expanded of 2-keto-L-gulonic acid in D2O
图选项

下面值得注意的是2-酮基-L-古龙酸的结构式中的羧基(-COOH)和羰基(-C=O)的归属，在13C NMR谱中，只有δ 96.01和δ 171.6两个峰在DEPT谱中不出峰，说明它们均为季碳，其中的δ 171.6碳很容易鉴别，因为很符合羧基碳的化学位移(δ)值，所以前面已经归属为C-1.那么从化学位移值判断，由于酮的羰基碳原子缺电子而严重去屏蔽，其共振峰应在最低场出现，不论是饱和酮还是环烷酮其羰基碳的δ值应为210±10[6]，这里的δ 96.01根本不可能是羰基碳的谱峰，依据碳谱各基团的化学位移值数据[7]和ACD Spec.Manager模拟谱图以及取代烷烃的δ值的计算公式Grant-Paul法，判断其δ 96.01应是O-C-O基团.从上述的氢、碳谱归属分析看，归属过程中只有分子结构式中的-OH因被重氢交换掉，无法归属分析外，其它碳、氢均与结构式Ⅱ或Ⅲ吻合，由此看来该分子发生了分子内环合成，分子中的羰基(-C=O)双键断开变单键，可形成2, 6位或2, 5位半缩醛衍生物，使分子内出现了O-C-O基团，本文碳谱符合该基团的δ值(95~99)出峰范围.发生这种情形类似于红霉素分子在酸性条件下分子内半缩醛合成环的案例[8]，所以δ 96.01应归属C-2.那么到底是发生2, 6位半缩醛衍生物（即结构式Ⅱ）还是2, 5位半缩醛衍生物（即结构式Ⅲ）?又或者是它们的混合物?从13C NMR谱中显示，主要是上述一种衍生物，因为谱中的其它杂质峰相比很微小.那么是结构式Ⅱ还是结构式Ⅲ还需下面的验证.

2.2 水溶液中2, 5位半缩醛衍生物（结构式Ⅲ）的确定

在无条件下，2-酮基-L-古龙酸在水中确定发生分子内半缩醛环合成，可生成两种衍生物，一种是2, 6位半缩醛产物为六元环（见结构式Ⅱ），另一种是2, 5位半缩醛产物为五元环（见结构式Ⅲ），然而这两种结构式的核磁共振氢、碳一维谱很相近，无法区别它们是哪一种，但是我们可通过核磁共振异核远程HMBC相关谱，即可确定.结构式Ⅲ所示的五元环衍生物中，6位的-CH2与1位的羧基碳是五键相隔，结构式Ⅱ所示的六元环衍生物中，5位的-CH2与1位的羧基碳是五键相隔，本文实验中，HMBC所采用的CNST实验参数值小，得到的谱图仅能显示四键以下的相关点，五键相隔的相关点几乎观察不到.从图 4中可见，5位的两个磁不等价质子都与1位的羧基碳均有HMBC相关，充分证明2-酮基-L-古龙酸发生的分子内环合成，是2, 5位半缩醛产物（即结构式Ⅲ）.同理，如果发生的是六元环的2, 6位半缩醛产物，H-6应该与羰基碳(C-1)有HMBC远程相关，而HMBC实验结果显示，并无该相关峰，再次说明了2-酮基-L-古龙酸发生的分子内环合成，主要是2, 5位半缩醛产物，即结构式Ⅲ所表示的分子.

图 4 2-酮基-L-古龙酸的核磁共振二维相关HMBC谱（局部扩展图） Fig. 4 2D HMBC spectrum of 2-keto-L-gulonic acid (expanded)
图选项

为了进一步验证NMR结果的可靠性，同时与质谱和红外光谱结果比对发生分子内环合成后的古龙酸，其分子量194与质谱结果吻合，红外光谱也显示了只有一个是羧酸的羰基伸缩振动在1 763 cm-1.

2.3 7种溶液中的核磁共振谱归属及解析

考虑到2-酮基-L-古龙酸在D2O溶液中发生的结构改变是否属于个别案例，验证这种情况的发生是否具有普遍性，所以我们又将2-酮基-L-古龙酸在7种溶剂（水、二甲基亚砜、甲醇、丙酮、乙腈、三氟乙酸+盐酸混合液、醋酸+盐酸混合液）的溶液进行了NMR测试和比较.由于受2-酮基-L-古龙酸在氯仿、苯等试剂中不溶的限制下，本实验仅测试当前的7种溶剂.

因为2-酮基-L-古龙酸结构的变化集中在羰基(C=O)碳上，所以我们只列出碳原子的化学位移值（见表 2）.

表 2 2-酮基-L-古龙酸在7种溶剂中溶液的碳谱测定结果 Table 2 13C NMR data of 2-keto-L-gulonic acid
溶剂(Solvent)C-6C-5C-4C-3C-2C-1
D2O62.3572.2669.0373.2496.01171.6
DMSO63.0272.8170.1074.1296.11171.2
CD3OD64.1574.2571.3875.6897.38172.4
(CD3)2CO64.2074.0371.2075.9696.89171.3
CD3CN64.2073.7870.8375.5796.81171.3
CF3COOD+DCl65.1875.3972.5077.0598.64172.4
CH3COOD+DCl63.8973.7870.8575.3697.14172.6
表选项

从表 2可以看出，上述7种溶液只有羧基碳(-COOH)的δ值，均没有发现羰基(C=O)碳的δ值（200左右或以上），取而代之的是O-C-O碳的δ值(96~99)，也就是说，2-酮基-L-古龙酸在这7种溶液中也都发生了分子内环合成的结构变化，这充分说明了2-酮基-L-古龙酸无论是在水中还是在有机溶剂中，不需要施加任何外力条件下，极易发生分子内半缩醛而成环的结构变化，且从7种13C NMR谱中，发现他们均以结构式Ⅲ为主要产物.

3 结论

(1) 2-酮基-L-古龙酸分子不论在水中，或在有机溶剂中，极易发生分子内环合成反应，羰基基团(-C=O)双键打开变单键，主要以2, 5位半缩醛环合成的衍生物形式存在.

(2) 通过核磁共振2D HMBC异核相关谱，充分证明了2-酮基-L-古龙酸发生的分子内环合成衍生物主要产物是构式Ⅲ，而非结构式Ⅱ.

(3)  2-酮基-L-古龙酸在多种不同溶剂的溶液中，分子结构由结构式I转变成结构式Ⅲ，这种情况虽然与红霉素发生分子内环合成的情况相近，但后者是在酸性条件下方可发生，而前者是在无条件下发生，不用做酸碱滴定等任何手段.

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