2014, Vol. 31文章信息
- 宋爱华, 沙沂, 徐晓雪, 李文, 许枬, 李晓鹏, 韩伟健, 林晓彤
- SONG Ai-hua, SHA Yi, XU Xiao-xue, LI Wen, XU Nan, LI Xiao-peng, HAN Wei-jian, LIN Xiao-tong
- 基于1H NMR技术的锥叶柴胡与北柴胡鉴别研究
- Differentiating Bupleurum bicaule from Bupleurum chinense Using 1H NMR Spectroscopy
- 波谱学杂志, 2014, 31(2): 214-221
- Chinese Journal of Magnetic Resonance, 2014, 31(2): 214-221
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文章历史
收稿日期: 2013-07-08
收修改稿日期: 2013-07-26
2. 辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600
2. College of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China
植物药是人类治疗疾病的重要药物资源.到目前为止，世界上有几万种栽培和野生植物被广泛应用，不断给各种疑难病症的治疗带来新的药物和希望[1].但同时由于商人对利益的追逐造成很多药材的混品和伪品充斥药材市场，不断曝出中毒和死亡的事件，给植物药的使用蒙上了巨大的阴影，使植物药鉴别成为植物药质量控制的首要环节[2].由于很多药材、饮片、炮制品的名称一致，外观相似，植物药的鉴别工作实际上存在诸多困难和麻烦.因此，开发和应用高效准确的植物药鉴别方法具有重要性和紧迫感[3].
《中华人民共和国药典》规定，柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzoneri folium Willd.的干燥根[4].按性状不同，分别习称“北柴胡”和“南柴胡”.但由于这两种柴胡与其同科属多种植物性状相似，难以区分[5]，再加上地方用药习惯的差异，使商品柴胡比较混乱，多种柴胡属植物的根都被做为柴胡销售，包括锥叶柴胡、银州柴胡、竹叶柴胡等[6].这些柴胡不仅外观性状相似，所含成分也很相似.柴胡皂苷是柴胡属的主要活性成分，均为五环三萜类齐顿果烷衍生物[7]，具有抗炎、解热、镇痛等多种药效作用[8]，其中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的活性较为明确，具有抑制肾小球硬化、抑制肝纤维和雌激素样作用等活性.故柴胡总皂苷和柴胡皂苷a、柴胡皂苷d被用为评定柴胡质量和真伪鉴别的指标[9].
锥叶柴胡(Bupleurum bicaule Helm.)由于主产于我国北部的内蒙古海拉尔地区，因此被药商称为“海拉尔柴胡”或“北柴胡”，造成了实际应用中与正品北柴胡(Bupleurum chinense DC.)的混淆[10].锥叶柴胡产量丰富，市场流通较广，在我国黑龙江、辽宁、吉林、河北等地的药材市场都有销售.由于锥叶柴胡化学成分研究较少，外观性状与正品柴胡相似，使用色谱或显微方法难以区别[11].代谢产物，尤其是二次代谢产物是植物的特征代谢产物，在植物的分类和鉴别中具有重要的意义[12].因此，本文在前期化学成分分离鉴定研究的基础上，采用能同时分析中药材多种代谢产物的1H NMR技术建立锥叶柴胡和北柴胡的鉴别方法，为临床鉴别使用二者提供依据.
1 材料与仪器所用仪器和试剂包括：Avance 600型核磁共振谱仪（德国布鲁克公司），超声波提取器（昆山市超声仪器有限公司，250 Hz），Satorius电子天平（德国赛多利斯公司），氘代吡啶（瑞士Armar chemicais公司），吡啶（天津科密欧试剂公司）.
20批柴胡药材收集于河北、辽宁、黑龙江等地，经辽宁中医药大学王冰教授鉴定为北柴胡Bupleurum chinense DC.和锥叶柴胡Bupleurum bicaule Helm.
| 品种 | 产地 | 批号 | 品种 | 产地 | 批号 |
| Bupleurum chinesne | 浙江 | 20120219 | Bupleurum bicaule | 内蒙古 | 20120101 |
| Bupleurum chinense | 内蒙古 | 120514 | Bupleurum bicaule | 内蒙古 | 20120203 |
| Bupleurum chinense | 河北 | 100408 | Bupleurum bicaule | 山西 | 20110301 |
| Bupleurum chinense | 辽宁 | 201201101 | Bupleurum bicaule | 内蒙古 | 20120326 |
| Bupleurum chinense | 河北 | 110401 | Bupleurum bicaule | 内蒙古 | 20120502 |
| Bupleurum chinense | 甘肃 | 111001 | Bupleurum bicaule | 陕西 | 20120506 |
| Bupleurum chinense | 吉林 | 201002083 | Bupleurum bicaule | 河北 | 110808 |
| Bupleurum chinense | 内蒙古 | 201201346E | Bupleurum bicaule | 内蒙古 | 111101 |
| Bupleurum chinense | 河北 | 120401 | Bupleurum bicaule | 内蒙古 | 120114 |
| Bupleurum chinense | 辽宁 | 20120602 | Bupleurum bicaule | 内蒙古 | 120512 |
分别取锥叶柴胡和北柴胡药材粉末50 mg，精密称定，加入吡啶1 mL超声提取30 min，离心，吸取上清液，挥干溶剂，残渣定量加入0.5 mL氘代吡啶溶解，离心，取上清液作为测试样品.
2.2 测试条件供试样品在配置BBO探头的Bruker AV 600型超导傅立叶变换核磁共振波谱仪上进行分析.在298.2 K的温度下，采用30°单脉冲程序zg30(Avance version: 07/04/03)采集图谱.采集时间：5.453 s，谱宽6 009.6 Hz，时域数据点数64 k，累积次数为128次.自由感应衰减信号经过傅立叶变换得到1D NMR图谱；TMS为内标信号(δ 0.00).手动进行基线校正和相位校正.
2.3 谱图处理和数据分析采用TOPSPIN 2.1采集1H NMR原始图谱，经分段积分(bining, 0.04)后将所有数据标准化为相对于TMS峰面积的积分值.将溶剂氘代吡啶产生的共振信号区域δ 7.10~7.22，δ 7.50~7.60及δ8.65~8.78数值去除后并将之保存为数据文件.将上述实验中所得数据文件导入SIMCA-p 11.5 (Umetrics, Sweden)进行PCA和PLS-DA分析.
3 结果与讨论 3.1 北柴胡与锥叶柴胡1H NMR谱图的PLS-DA分析由北柴胡和锥叶柴胡的1H NMR谱图（图 1）可见，采用本文方法测定的北柴胡和锥叶柴胡谱图信号灵敏度较高，主要活性成分信号分离度良好，经水峰抑制后δ 4.50~5.50区域的信号可被清楚地观察到，整个图谱的连氧脂肪碳质子信号区也有很好的分离.两种柴胡的二次代谢产物能很好识别（与化合物的相应谱图对照），具体信号归属见表 2.由此提示，本方法所测定的1H NMR可以很好表征二者成分的差异.
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| 图 1 北柴胡与锥叶柴胡的1H NMR谱图 Fig. 1 1H NMR spectra of B.chinense and B. bicaule in C5D5N |
| 化合物 | 1H NMR/δH |
| 柴胡皂苷元E（SGE） | 0.88(s), 0.93(s), 0.95(s), 1.01(s), 1.12(s), 1.24(s), 1.38(s), 6.00(d, J=10.3Hz), 5.66 (dd, J=10.3, 2.9Hz), 4.38(d, J=6.9Hz), 3.33(d, J=6.9Hz) |
| 柴胡皂苷元F（SGF） | 0.88(s), 0.91(s), 1.03(s), 1.05(s), 1.08(s), 1.42(s), 3.34(d, J=5.4Hz), 4.40(d, J=6.6Hz), 5.68(dd, J=10.4, 2.8Hz) |
| 柴胡皂苷元G（SGG） | 0.94(s), 1.01(s), 1.06(s), 1.06(s), 1.36(s), 1.60 (s), 6.05(d, J=10.3Hz), 5.70(dd, J=10.3, 2.9Hz), 3.70(d, J=10.3Hz) |
| 柴胡皂苷b2（SSb2） | 0.88(s), 0.90(s), 0.97(s), 0.99(s), 1.02(s), 1.66(s), 1.43(d, J=6.3Hz), 6.70(dd, J=10.7, 2.4Hz), 5.71(d, J=10.7Hz), 5.33(d, J=7.8Hz), 5.00(d, J=7.8Hz) |
| 柴胡皂苷b4（SSb4） | 0.96(s), 0.99(s), 1.11(s), 1.13(s), 1.39(s), 1.40(s), 5.60(d, J=3.5Hz), 4.97(d, J=7.8Hz), 5.33(d, J=7.8Hz) |
| 柴胡皂苷a（SSa） | 0.88(s), 0.91(s), 0.91(s), 0.97(s), 1.09(s), 1.39(s), 1.42(d, J=6.5Hz), 5.98(d, J=10.2Hz), 5.65(bd, J=10.2Hz), 5.34(d, J=7.8Hz), 4.97(d, J=7.8Hz) |
| 柴胡皂苷d（SSd） | 0.92(s), 0.94(s), 1.00(s), 1.00(s), 1.36(s), 1.61(s), 1.42(d, J=6.3Hz), 6.02(d, J=10.5Hz), 5.68(d, J=10.5Hz), 5.33(d, J=7.8Hz), 4.97(d, J=7.8Hz) |
| 柴胡皂苷c（SSc） | 0.86(s), 0.91(s), 0.96(s), 0.98(s), 1.15(s), 1.31(s), 1.36(s), 1.66(d, J=6.2Hz), 5.64(dd, J=10.3, 3.0Hz), 5.91(d, J=10.3Hz), 4.75(brs), 4.80(d, J=7.8Hz), 4.95(d, J=7.8Hz) |
| 前柴胡皂苷A（PSA） | 0.84(s), 0.88(s), 0.95(s), 0.98(s), 1.05(s), 1.07(s), 1.49(3H, d, J=6.4Hz), 5.67(dd, J=10.3, 2.9Hz), 4.29 (d, J=10.3Hz), 4.94(d, J=7.8Hz) |
| 前柴胡皂苷G（PSG） | 0.91(s), 0.93(s), 1.00(s), 1.01(s), 1.36(s), 1.60(s), 1.52(d, 3H, J=6.4Hz), 6.03(d, J=10.3Hz), 5.68(dd, J=10.3, 2.9Hz), 4.94(d, J=7.8Hz) |
| 前柴胡皂苷F（PSF） | 0.88(s), 0.90(s), 0.91(s), 0.96(s), 1.07(s), 1.37(s), 1.52(d, 3H, J=6.4Hz), 4.97(d, J=7.7Hz), 5.65(dd, J=10.3, 2.9Hz), 5.98 (d, J=10.3Hz) |
图 2显示北柴胡和锥叶柴胡的区别可被得分矢量图明确表征.两种柴胡样品各自集中在不同区域，说明组内样品成分接近，二者之间的差异明显.该模型的t[1]和t[2]对X变量解释达92.5%的原始变量变异，R2Y: 0.922，Q2(cum)为0.895，表明该模型稳定性很好.由载荷矢量图（图 3）可以看出，锥叶柴胡与北柴胡的主要差异成分为δ 0.84、0.88、1.24、1.28、1.32、1.36、2.12、4.40、4.32、4.56等吸收信号，提示二者差异的主要成分为柴胡皂苷、前柴胡皂苷、柴胡皂苷衍化物、柴胡皂苷元（SSa/SSd/SSc，PSF/PSG/PSA，SSb2/SSb4，SGE/SGG/SGF）.其中锥叶柴胡中含有较多的前柴胡皂苷和柴胡皂苷元，北柴胡中含有较多的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d.这一结果与HPLC分析结果一致.
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| 图 2 锥叶柴胡和北柴胡全部样品1H NMR全谱的PLS-DA得分矢量图 Fig. 2 Score plot result of PCA (PC1 vs. PC2) obtained from the 1H NMR spectra of the root of B. chinense and B. bicaule in C5D5N |
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| 图 3 全部样品1H NMR谱图的PLS-DA分析载荷矢量图 Fig. 3 Loading plot result of PCA (PC1 vs. PC2) obtained from the 1H NMR spectra of the root of B. chinense and B. bicaule in C5D5N |
由于北柴胡和锥叶柴胡中除皂苷类成分外还有较多的酚酸类成分，如黄酮、蒽醌等.为了深入研究1H NMR谱图对该类成分的差异能否明确表征，在1H NMR全图谱分析的基础上，对北柴胡和锥叶柴胡的低场部分(δ 6.52~10.00)进行了统计处理.由得分矢量图（图 4）可以看出，该模型可以完全分离这两种样品；锥叶柴胡和北柴胡样品各自比较集中，组分内成分接近，组间成分差异显著.该模型的t[1]和t[2]对X变量解释达92.5%的原始变量变异，R2Y: 0.951，Q2(cum)为0.931，表明该模型稳定性很好.结合载荷矢量图（图 5）可以看出，锥叶柴胡与北柴胡的主要差异成分为δ 6.96、6.80、6.52、6.76、6.92范围的吸收信号，提示二者的主要差别为黄酮类成分和蒽醌类成分.这与北柴胡和锥叶柴胡的化学成分和显色反应研究结果基本一致.锥叶柴胡中主要含有蒽醌类成分，北柴胡中的酚酸类成分以黄酮为主[9].
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| 图 4 全部样品1H NMR谱图低场区(δ6.52~10.00)的PLS-DA得分矢量图 Fig. 4 Score plot result of PCA (PC1 vs. PC2) obtained from the 1H NMR spectra (δ 6.52~10.00) of the root of B. chinense and B. bicaule in C5D5N |
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| 图 5 全部样品谱图低场区(δ 6.52~10.00)的PLS-DA分析载荷矢量图 Fig. 5 Loading plot result of PCA (PC1 vs. PC2) obtained from the 1H NMR spectra (δ 6.52~10.00) of the root of B. chinense and B. bicaule in C5D5N |
采用1H NMR技术鉴别中药质量是一个可行的方法，但是在实验参数上需要进行细致考察[13].本文采用的样品制备方法和测试条件是经多种提取溶剂、处理方法筛选后确定的.考虑到柴胡中主要的化学成分为皂苷和酚酸类成分，对比了甲醇、含水甲醇、氘代吡啶为提取溶剂，氘代甲醇、氘代吡啶为测试溶剂，结果表明吡啶为提取溶剂，氘代吡啶为测试溶剂，采用水峰抑制技术，所得1H NMR谱图能很好表征柴胡中的皂苷、酚酸类成分，信号灵敏度高，尤其是对具有醚环的柴胡皂苷类成分中具有鉴别意义的C11位双键上的质子信号[δ 5.98(d, J=10.2 Hz), 5.65(dd, J=10.2, 3.4 Hz)]几乎无干扰，利于代谢谱图的统计分析.以含水甲醇为提取溶剂，所得1H NMR谱图中糖类成分信号过高，皂苷类成分被严重干扰.以甲醇为测试溶剂信号分离度稍差，而且难以与已知成分核磁数据对照.因此本文采用吡啶为提取溶剂，氘代吡啶为测试溶剂，采用水峰抑制技术测定锥叶柴胡和北柴胡的1H NMR谱图.
由于植物代谢产物的1H NMR数据复杂，因此本文采用偏最小二乘法和主成分分析结合的分统计学方法对所获得的实验数据进行分析，提取了北柴胡和锥叶柴胡的代谢产物特征的轮廓.实验结果表明，北柴胡和锥叶柴胡的差异较大成分为柴胡皂苷a、d、c、b2、b4，前柴胡皂苷F、G、A和柴胡皂苷元E、F、G，提示这些柴胡皂苷成分可以作为北柴胡和锥叶柴胡鉴别指标.
柴胡皂苷具有抗炎、调节免疫等多种药效活性，且其剂量与活性有密切关系.由北柴胡和锥叶柴胡的化学成分差异较大提示二者的药效作用可能也有明显的差异，因此有必要在本研究的基础上，对锥叶柴胡和北柴胡的活性成分及功效的差异应进行深入分析，以便在临床上区别使用二者，保证疗效.
4 结论本文依据两种柴胡的代谢产物差异，第一次建立基于1H NMR技术的锥叶柴胡和北柴胡的鉴别方法，用于鉴别北柴胡及其主要混品.研究结果表明，两种不同植物的代谢产物的1H NMR谱图轮廓有明显差异，可以明确鉴别北柴胡及其主要混品锥叶柴胡.由此说明，将1H NMR谱与统计分析方法结合可以为中药材的真伪鉴别研究提供有效实验依据和手段.
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