2014, Vol. 31文章信息
- 杨茵, 陈家良, 苏循成
- YANG Yin, CHEN Jia-liang, SU Xun-cheng
- 蛋白质顺磁标记技术与生物核磁共振中的赝接触位移
- Paramagnetic Labeling of Proteins and Pseudocontact Shift in Structural Biology
- 波谱学杂志, 2014, 31(2): 155-171
- Chinese Journal of Magnetic Resonance, 2014, 31(2): 155-171
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文章历史
收稿日期: 2013-05-02
收修改稿日期: 2013-05-06
近年来，高分辨核磁共振在生物大分子的结构、动力学研究和近年来兴起的细胞内原位检测等方面发挥着重要的作用.在生物大分子中引入顺磁性物质，如含有未配对电子的金属离子或游离基，利用未配对电子与观测核间的偶极相互作用产生的顺磁效应可以提供非常有用的结构信息.这类顺磁信息通常可以用顺磁弛豫增强(paramagnetic relaxation enhancement, PRE)，赝接触位移(pseudocontact shift, PCS)和残余偶极耦合(residual dipolar coupling, RDC)描述[1-4].随着高场NMR谱仪和蛋白质标记技术的发展，顺磁核磁共振在结构生物学中的应用引起了人们的极大兴趣.
生物体系电子顺磁共振(electron paramagnetic resonance, EPR)和顺磁核磁共振研究中经常用到氮氧自由基、过渡金属Mn2+(3d5)和稀土金属Gd3+(4f7)，这些物质都具有磁各向同性的特点.由于这类顺磁物质的电子弛豫时间长，与生物大分子体系内自旋核的偶极作用能极大增强到观察核的弛豫速率，即PRE效应.PRE是一种非常重要的距离限制性约束，并可以用来测定蛋白质的构象、蛋白质复合物的瞬态构象和瞬态变化[3, 5].
而一些过渡金属离子Fe2+（高自旋）、Fe3+、Co2+、Ni2+和稀土金属离子Ln3+（除La3+、Gd3+和Lu3+外），在磁场中表现出各向异性的磁感应性.在生物大分子体系中引入这类具有磁各向异性的顺磁金属离子，能产生非常有用的顺磁结构信息，包括PCS、RDC和交叉相关弛豫(cross-correlated relaxation, CCR)[1, 2, 4]，其中PCS更具通用性且容易定量测量.过渡金属离子的磁各向异性比稀土金属离子要小很多，在生物大分子研究体系中的应用性较小.而关于顺磁弛豫增强已经有非常详细的综述文章[5].因此本文着重介绍了PCS和稀土金属离子的引入以及PCS在结构生物学中的应用.
1 PCS NMR 1.1 PCS原理PCS是指顺磁中心未配对电子通过与自旋核间的偶极-偶极相互作用，引起自旋核的化学位移发生变化.图 1(c)中的等值面示意图形象展示了顺磁中心与蛋白的空间关系对PCS的影响，观测核的PCS由其相对顺磁金属离子的位置决定.磁感应性通常用χ-张量表示，如图 1所示，在正交坐标系中的3个主轴分量分别可以用χx、χy和χz表示.如果χ-张量是各向同性的，即χx=χy=χz，不产生PCS；各向异性的磁感应张量通常用Δχ-张量表示，PCS可以用关于Δχ-张量的轴分量Δχax和斜方分量Δχrh的方程来表述.
| $PCS = \frac{1}{{12{\rm{ \mathsf{ π} }}{r^3}}}[\Delta {\chi _{ax}}(3{\cos ^2}\theta - 1) + 1.5\Delta {\chi _{rh}}{\sin ^2}\theta \cos 2\mathit{\Phi }]$ | (1) |
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| 图 1 (a)磁感应张量的三维正交空间示意图(χx，χy和χz分别表示3个主轴分量)；（b）自旋核与磁各向异性顺磁离子作用：PCS的产生机制；(c) PCS等值面示意图：human ubiquitin中顺磁标记Dy3+后的PCS等值面示意图，深色区域为+5.0或-5.0ppm，浅色区域为+1.5或-1.5 ppm Fig. 1 (a) Representation of the χ-tensor, where the χx, χy and χz are the axial components of χ-tensor. (b) Definition of PCS generated by an anisotropic Δχ-tensor, illustrating the interaction of the unpaired electron and nuclear spin H [equ.(1)]. (c) PCS isosurface of Dy3+ in complex with paramagnetic tag derivatized human unbiquitin A28C. The isosurface identifies the locations of PCS of +/-5.0 and +/-1.5 ppm |
(1)式中PCS表示观测自旋核在逆磁和顺磁样品中化学位移的差别（以ppm表示），r表示金属离子与自旋核间的距离，θ和Φ是表示自旋核在以顺磁离子为中心的主轴坐标系中的空间取向，其中
从上述表述中，我们可以看到：1) PCS与顺磁离子的磁各向异性相关；2) (1)式中所获得的PCS以ppm表述，其大小与磁场强度无关；3) PCS既含有生物大分子观测核相对顺磁中心的角度信息，又含有距离信息，是一种与常规NOE或RDC不同的结构限制性约束.
1.2 PCS分析PCS可以通过计算顺磁和逆磁的化学位移差别而精确得到.现在有多种软件可以进行PCS分析，包括早期的Fantasian[6, 7]和最近发表的Numbat[8].这些软件都基于蛋白质的三维坐标，根据蛋白质的结构和获得的PCS，进行张量分析.需要指出的是利用一种顺磁离子的PCS数据通常情况下很难获得可信的金属离子坐标和Δχ-张量，在这种情况下获得的顺磁信息很难有效地应用到蛋白质复合物体系中.因此获得可信的金属离子坐标和各向异性磁感应Δχ-张量是分析PCS的关键.由于稀土金属离子化学性质相似但顺磁性质各异的特点，利用多种稀土金属离子的PCS数据共同拟合，通常可以获得合理的金属离子坐标和Δχ-张量[9].Numbat可以同时拟合多套PCS数据，并且操作界面简单，而且可以进行误差分析.
1.3 稀土金属离子三价阳离子是稀土金属的稳定价态，稀土金属的离子半径从La3+到Lu3+逐渐减小.因为彼此接近的半径，不同稀土离子与目标分子的同一结合位点作用时的亲和性差异较小，其与目标分子配合物的三维结构也不会显著改变.但在相近的化学环境中，不同稀土离子展现出迥异的各向异性和张量强度（表 1）.除La3+和Lu3+外，Gd3+(4f7)具有最强的顺磁弛豫增强效应；其他稀土离子均具有不同程度的磁各向异性，其中Dy3+、Tb3+、Tm3+顺磁性高，而Ce3+、Nd3+的顺磁性则较小.
| 电子构型 | 离子半径/0.1 nm | 角动量J | g-朗德因子 | 电子弛豫时间(τs/s) | PRE(R2/s-1)a | Δχax/(10-32m3)b | PCS/ppm r=1.5 nm | |
| La3+ | 4f0 | 1.032 | ||||||
| Ce3+ | 4f1 | 1.010 | 5/2 | 6/7 | 2×10-13 | 1 | 2.1 | 0.33 |
| Pr3+ | 4f2 | 0.990 | 4 | 4/5 | 3×10-13~6×10-14 | 3 | 3.4 | 0.53 |
| Nd3+ | 4f3 | 0.983 | 9/2 | 8/11 | 4×10-13 | 3 | 1.7 | 0.27 |
| Gd3+ | 4f7 | 0.938 | 7/2 | 2 | 10-8~10-9 | |||
| Tb3+ | 4f8 | 0.923 | 6 | 3/2 | 4×10-13 | 88 | 42.1 | 6.62 |
| Dy3+ | 4f9 | 0.912 | 15/2 | 4/3 | 7×10-13 | 147 | 34.7 | 5.46 |
| Ho3+ | 4f10 | 0.901 | 8 | 5/4 | 5×10-13 | 156 | 18.5 | 2.91 |
| Er3+ | 4f11 | 0.890 | 15/2 | 6/5 | 5×10-13 | 106 | 12.2 | 1.92 |
| Tm3+ | 4f12 | 0.880 | 6 | 7/6 | 1×10-12 | 40 | 26.0 | 4.09 |
| Yb3+ | 4f13 | 0.868 | 7/2 | 8/7 | 3×10-13 | 4 | 8.5 | 1.34 |
| Lu3+ | 4f14 | 0.861 | ||||||
| a.在600 MHz NMR和温度298 K条件下，对一个相关时间为10 ns的蛋白质，距离顺磁中心1.5 nm的氢原子所感受到的弛豫增强.b.假定Δχrh=0，自旋核在距离顺磁中心1.5 nm处最大的PCS a. was calculated for a proton spin with a distance of 1.5 nm to the paramagnetic center at a magnetic field of 14.1 T, where protein correlation time of 10 ns was used. b. the maximum PCS for the proton spin with a distance of 1.5 nm to the paramagnetic center | ||||||||
在高场中，具有顺磁各向异性的稀土金属离子与生物大分子自旋核的居里自旋弛豫会造成很强的PRE效应[(2)式][2].
| ${\Gamma ^{{\rm{curie}}}} = \frac{1}{5}{\left( {\frac{{{\mu _0}}}{{4\pi }}} \right)^2}\frac{{{{({\gamma _1}{B_0})}^2}g_e^4\mu _B^4{S^2}{{(S + 1)}^2}}}{{{{(3kT)}^2}{r^6}}}(4{\tau _r})$ | (2) |
其中
PRE的衰减与1/r6成正比（r即金属离子与自旋核间的距离），而PCS的衰减与1/r3成正比，在距顺磁中心足够远的位置，PRE影响已经可忽略时，仍能观察到较大的PCS.Dy3+周围1.5 nm范围内PRE效应较强，自旋核的NMR信号可能因此很难观察，但其PCS的影响范围可达4 nm[10].Yb3+的顺磁性较小，它引起的PCS和PRE也相应较小，能够观察到顺磁中心更近范围内的PCS效应.
PCS是通过顺磁态和逆磁态间的化学位移差异获得的，因此具有稳定化学环境的顺、逆磁参照体系非常重要.Y3+并不属于稀土离子但与稀土离子具有相似的配位化学性质，且与Tb3+拥有相似的离子半径，它与La3+、Lu3+可以提供理想的逆磁参照体系.
利用稀土离子上述特点，不仅能够通过计算目标分子在顺磁或逆磁金属离子结合状态下NMR谱图中的化学位移差别，简单快捷地获得PCS数据；而且通过不同稀土离子的使用，可以实现对张量取向、强度、影响范围的调整，获得丰富的结构信息.稀土离子的PCS效应涵盖了实用的长程结构信息，且易于高精度测量，因此常被应用于蛋白的NMR结构分析.尤其在蛋白质复合物分子间作用和蛋白质动态学研究方面，PCS能发挥独特作用.
2 顺磁标记方式及研究进展除部分钙离子结合蛋白和少数以Mn2+或Mg2+为催化活性中心的蛋白能与稀土离子结合外，绝大部分蛋白质和核酸都没有稀土离子的结合中心.要获得长程有效的顺磁信息，通常需要对生物大分子进行标记（路线1）.由于NMR技术的高灵敏性，生物大分子顺磁标记除了满足标记反应的高选择性和修饰的高效性外，顺磁探针还需要具备以下几点：1)与稀土离子较强的结合能力；2)顺磁探针的刚性，顺磁中心与目标分子间的柔性会引起PCS的平均化；3)尽量避免手性中心的产生，非对应异构体会引发多重PCS信号，使后续数据处理极为复杂和困难；4)标记方式的简易性和可操作性；5)不引起蛋白结构或功能的明显改变.目前关于PCS NMR的顺磁标记研究主要集中于蛋白质[11].
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| 路线1 常用的蛋白质顺磁标记路线 Scheme1 Strategies in site-specific labeling of proteins with paramagnetic metal ions |
而对DNA或RNA的标记主要用来研究EPR或PRE，这方面的工作主要以Sigurdsson小组的研究为主[12-14].下面我们主要介绍蛋白质的标记方法及进展.
2.1 金属蛋白中顺磁中心的构建 2.1.1 天然金属蛋白与稀土离子的结合在生物体内，金属蛋白是蛋白酶体系的重要组成成分.其中钙结合蛋白具有非常重要的生物学作用.由于稀土金属离子与钙离子具有相似的离子半径，某些钙结合蛋白中的钙离子可以被稀土金属离子直接取代, 将稀土金属固定在蛋白分子的结构框架内，同时不会显著改变蛋白的三维结构.例如，parvalbumin蛋白中EF-hand结构域中的两个Ca2+能够被一个Yb3+取代[14]；而对于Calbindin蛋白，EF-hand结构域中仅一个Ca2+会被Ln3+代替，另一个Ca2+则不受影响[10].除钙结合蛋白外，一些二价金属离子参与催化的金属酶体系中，该金属酶的金属结合位点在有些情况下结合稀土离子.例如T4 DNA聚合酶的外切核酸酶亚基和E.coli DNA复制酶的ε/θ亚基含有的两个Mg2+或Mn2+也能够被一个Ln3+取代[16, 17].通过这种方式，在尽可能不影响蛋白本身结构的情况下，可以利用稀土金属各向异性的顺磁效应，研究蛋白质复合物构象与动力学性质.
2.1.2 稀土离子结合位点的特异性构建在不含金属结合位点或不能天然结合稀土离子的蛋白分子中，通过定点突变的方式改变某个或某几个残基，可以使蛋白质局部呈现出适于稀土结合的特征，特异性的引入了稀土结合位点或增强蛋白分子与稀土离子的亲和性，使原本逆磁性的蛋白分子可以与顺磁稀土离子结合，从而具有顺磁特性.例如，由于Ln3+和Ca2+在电荷和配位性上的差异，蛋白CaM中的Ca2+结合位点并不能直接与Ln3+形成较强的配位[18]，通过定点突变改变结合位点附近的电荷分布，即可显著提高其与Ln3+的结合能力[19].
这种构建稀土结合位点的方式，对蛋白质结构要求较高，具有较高的挑战性.首先，须在已知蛋白结构信息的条件下进行，根据蛋白自身情况设计突变位点.其次，改造后的蛋白质与稀土离子的结合须具备足以支持后续研究的亲和性和刚性.此外，要注意这些定点突变对蛋白结构和功能的影响.与钙离子相比，为增强与稀土离子的结合常数往往需要通过突变引入更多的酸性氨基酸酸的参加，这样就改变了蛋白的电荷分布，可能对蛋白分子内的静电作用等产生一定的影响，从而影响整体的结构与功能.例如，Li等人[20]在细胞粘连蛋白CD2的N端结构域内引入了R31D和K43D突变，使蛋白分子产生了与野生型不同的非折叠结构.
2.2 稀土离子结合多肽与蛋白质分子的连接在钙离子结合片断EF-hand结构域的基础上进一步通过氨基酸的改变，可以优化得到对稀土离子结合能力更高的多肽，这类多肽可以通过融合蛋白表达和体外连接等不同的方式与目的蛋白连接.
2.2.1 包含稀土结合多肽的融合蛋白的构建将标签多肽与目的蛋白作为融合蛋白表达，是生物学中最常用和传统的方式之一.Ma等人[21]将一段钙离子结合肽EF-hand结构域与一个膜蛋白的N端连接，成功地使该膜蛋白具有了稀土结合位点.Nitz等人[22]在EF-hand结构域基础上，发展出了稀土结合多肽标签(lanthanide binding tag, LBT)，将这类LBT与稀土离子的结合常数从103(mol-1·L)提高到了109(mol-1·L).单个LBT[23]或两个LBT[24]可以融合到目标蛋白质的碳或氮末端，这类融合了LBT的蛋白可以结合稀土离子并产生的较大PCS和RDC.最近Schwalbe课题组成功地把LBT引入到蛋白interleukin-1β的无规则结构区并观测到了较大的PCS[25].
与其他连接方式相比，融合蛋白共同表达的方式具有可靠易操作的特点.但是可供标签连接的位置很少，大部分只能连接在目的蛋白的N端或C端，由于蛋白质肽链末端的柔性较大，顺磁信息的平均化较严重.虽然LBT也可以通过严密的设计插入到蛋白的无结构区[25]，但是对蛋白结构和功能的影响往往难以忽略，降低了这种连接方法的普适性.
2.2.2 稀土结合多肽与蛋白分子的体外连接除了表达融合蛋白的方式外，稀土结合多肽也可以通过化学连接的方式与目的蛋白进行位点特异性的连接.由于LBT的体积较大，往往通过化学方式可以获得较为刚性的蛋白-LBT复合物.LBT和蛋白分子中要各选定一个L-半胱氨酸残基作为修饰位点.目标蛋白的半胱氨酸首先经过Ellman试剂(DTNB)活化，然后再与LBT反应，获得二硫键链接的蛋白质-LBT复合物.未连接蛋白和成功连接产物又可以通过离子交换、凝胶排阻等层析进行分离.两步连接反应中都会产生深黄色的TNB，便于对反应情况进行观测[26].通过改变LBT氨基酸序列中半胱氨酸的位置，可以有目的地获得不同的LBT-蛋白质复合物.这些不同的复合物与稀土离子配位后，产生的PCS也会不同.甚至同一稀土离子在不同LBT-蛋白质复合物中能够产生符号相反的PCS.通过这种标记方式，蛋白质的同一位点与不同LBT作用，可以获得不同角度的各向异性Δχ-张量和定向张量[27].
为增强LBT标签的刚性，Saio等人[28]则将表达融合蛋白和二硫键连接两种方法结合起来，在GB1蛋白分子的N端引入LBT2标签作为融合蛋白表达，蛋白纯化后再利用DTNB介导的连接策略[26]，使LBT2标签N端的Cys与GB1内部的Cys通过二硫键实现分子内连接.这一额外的二硫键大幅提高了多肽标签与蛋白分子间的刚性.
稀土结合多肽与蛋白分子二硫键连接的方式具有明显的优势：1)多肽标签的连接位点可以有更多更灵活的选择，而且可以在目的蛋白特定位置通过定点突变引入Cys，极大的提高了多肽标签的普适性.2)多肽标签和目的蛋白分子可以实现同位素的差异化标记，这为NMR分析提供了极大的便利.3)与融合蛋白相比，二硫键明显缩短了顺磁中心和蛋白间的距离，提高了连接的刚性，使顺磁中心和蛋白间的位置和相对取向更加固定，有利于抑制PSC的平均化现象.4)多肽标签与稀土结合后具有较固定的结构，在与蛋白同一Cys连接时，通过改变标签中Cys的位置就可以获得多套PCS和RDC数据.
2.3 化学合成标签与蛋白质分子的作用LBT与稀土金属离子的结合能力(Ka)一般在109(mol-1·L)左右，但是链接到蛋白质上(Ka)通常会降低到106(mol-1·L)[26]，因此设计合成与稀土离子螯合性强的配体对获得稳定的蛋白质-标签稀土配合物非常重要.稀土离子与碱土金属离子相似，属于较强的Lewis酸，较易与羧酸根配位，并且稀土离子的配位数一般在8~9个.因此含有多个羧酸基团的有机配体是比较理想的顺磁标签，图 2中列出了已报道的一些代表性的顺磁标签.可以看到这些标签主要以乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)、1, 4, 7, 10-四氮杂环十二烷-1, 4, 7, 10-四羧酸(DOTA)、吡啶-2, 6-二甲酸(DPA)、胺三乙酸(NTA)和胺二乙酸(IDA)的衍生物或类似物为主.下面具体介绍一些比较典型的有机合成标签.
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| 图 2 定点特异标记蛋白质的常用顺磁标签 Fig. 2 Paramagnetic tags for site-specific labeling of proteins with metal ions |
通过二硫键与蛋白连接的化学合成标签是目前应用最广泛的研究热点之一.这些标签大部分都含有活化的巯基，可以与目的蛋白反应；另一部分标签只有自由巯基，需要与活化的目标蛋白反应（见路线1）.EDTA衍生物T1是顺磁标记研究中曾经最常用的顺磁标签，特别是在PRE NMR和EPR研究中，因为T1可以与Mn2+等过渡金属作用形成较稳定的化合物.但是T1与Co2+或稀土离子作用后会产生手性中心，在NMR谱图上出现两种顺磁信号[29, 30].为改变T1的潜在手性问题，Griesinger小组在有机合成路线设计上巧妙把手性中心引入到顺磁标签上，比如T2与稀土配位后只形成一种顺磁物种，并且改进后的标签与稀土离子的结合能力达到1018(mol-1·L)，比T1有几个数量级的提高[31, 32].
与EDTA相比，DTPA具有8个配位点并且与稀土离子形成的配合物具有更强的稳定性.T3含有两个活化的巯基，可以与具有两个半胱氨酸的蛋白反应而得到蛋白-T3复合物.在合适条件下，T3可以与蛋白分子内相距0.8~1 nm的两个Cys分别生成二硫键.T3在其蛋白衍生物中具有很好的刚性，但其稀土配合物具有多种对映异构体，在NMR谱图中呈现至少5组不同的顺磁信号[33].与以上EDTA或DTPA衍生物标签不同，T4含有9个配位基团，能完全占满稀土离子的所有配位数，因此T4的稀土配合物中没有溶剂水分子参与配位，这在一定程度上避免了溶剂PRE造成的影响.另外，T4中的苯环带有一定刚性，在与ubiquitin形成的复合物中限制了标签的柔性，因此在NMR谱图中能观测到很大的PCS和RDC[34].
为考虑原子经济性并尽量避免手性中心的产生，Su等人发现体积小的标签可以通过蛋白质酸性氨基酸侧链的配位来限制标签的柔性[35].在此基础上，Swarbrick等人以L-Cys为起始原料设计合成了T5[36].T5含有一个手性碳原子，可以通过氨基酸侧链的配位得到很好的固定；另外，一个蛋白质可以链接两个T5，在距离合适的条件下，两个T5可以同时螯合一个稀土金属离子并产生较大的PCS和RDC.L-Cys的亚氨基二乙酸衍生物(IDA)虽然可以作为顺磁标签，但是由于其稀土配合物的稳定性较弱，在结构生物学中的用途会受到一定的限制[37, 38].
DPA是配位化学中广泛应用的有机螯合配体，其与稀土离子能形成稳定的配合物[Ka > 1010(mol-1·L)].Su等人发现DPA衍生物T6可以方便地修饰到蛋白质上，并且T6能非常刚性地通过蛋白质氨基酸侧链与稀土离子的配位而固定到蛋白质表面上[35].由于T6的体积小而且刚性，对蛋白质的二级结构影响通常可以忽略.通过对多种蛋白质的链接实验，待突变的氨基酸残基（包括L-Cys）的β-碳与另外一个酸性氨基酸(Glu或Asp)侧链氧的合适距离在0.6~0.8 nm范围内时，T6都能很好地被固定在蛋白质表面.这个距离经验可以为设计链接位点，定点突变L-Cys提供很好的参考.T7[39]和T8[40]是比T6更小的顺磁探针，与不同蛋白的复合物都能产生较大的PCS和RDC.这类DPA标签避免了与顺磁稀土离子配位后多个顺磁中心的产生，其蛋白配合物的NMR谱图能够观察到单一的顺磁信号.
标签T9~T12是DOTA类大环配体的衍生物，这类顺磁标签与以上其他标签的不同在于DOTA稀土配合物通常都有显著的动力学惰性，在常温下DOTA类配体与稀土离子无法形成稳定的配合物，而需要通过长时间的加热或回流才能制备.因此要获得此类标签的蛋白质复合物，需要首先制备标签的稀土配合物，之后再与蛋白质反应.T9中由于单个链接不能很好地在蛋白质表面固定而使得顺磁信息平均化严重，在此基础上含有双臂功能团的T10能有效稳定标签的柔性[41].为了避免对映异构体的出现，T11是在T9基础上设计引入更多的手性中心，与ubiquitin链接后能产生很大的PCS和RDC，但是NMR谱图中仍有少量对映异构体的出现[42].T12是体积更大的顺磁探针而与蛋白质形成复合物的NMR谱图中没有对映异构体的影响，并且能观测到非常大的PCS和RDC[43].
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| 图 3 (a)通过类Michael加成方式获得的ubiquitin T22C与标签T7的复合物；(b) ubiquitin T22C-T7分别与等浓度的稀土金属配合物Dy3+(黑色), Y3+(灰色)的1H-15N HSQC谱图 Fig. 3 (a) Structure representation of paramagnetic tag T7 derivatized human ubiquitin T22C mutant via thiol-ene Michael reaction. (b) Superposition of 1H-15N HSQC spectra of ubiquitin T22C-T7 adduct in complex with Dy3+ (black) and Y3+ (grey), respectively |
通过二硫键修饰的蛋白-探针复合物对环境剂(DTT或TCEP)敏感，并且在较高pH下二硫键易发生交换反应.此外，大多数蛋白所处的生理环境都为还原性，而二硫键在还原条件下不稳定，这限制了连接产物的应有范围.Li等人[44]在DPA上引入一个碳碳双键获得了T13.通过吡啶环的吸电子性，T13能与蛋白质表面的Cys发生类似Michael式的加成反应，得到了蛋白质-T13复合物.T13在两种蛋白质复合物中的应用都表现出较强的刚性.这种通过硫醚键链接的蛋白质与顺磁探针非常稳定，而且不受还原剂或pH的影响.T14是一种非常强的稀土螯合配体，它含有一个活化的碳碳双键并且具备7个配位基团.T14能与暴露在溶剂中的Cys发生加成反应而与蛋白质形成稳定的复合物，Yang等人发现这类蛋白质的稀土配合物具有高稳定性的特点并且可以研究复杂条件，如拥挤或原位条件下蛋白质的构象变化[9].
2.3.3 通过稀土配合物与蛋白质分子的特异性非共价作用标记蛋白质DPA与稀土金属离子形成的[Ln(DPA)3]3-含有3个疏水的芳香环和3个负电荷，在位置合适的情况下能与蛋白质表面发生特异性的非共价作用（图 4）.Su等人发现配合物[Ln(DPA)3]3-可与一系列表面带有正电势的蛋白作用，并产生PCS和RDC[45].尤其对于DNA结合蛋白ArgN，其结合常数达到106(mol-1·L).在ArgN与[Ln(DPA)3]3-形成的复合物中，[Ln(DPA)3]3-与蛋白质内α-螺旋中的两个正电荷氨基酸残基(相隔3个氨基酸残基，K45和R48)发生特异性作用，形成稳定的蛋白复合物.[Ln(DPA)3]3-的特异性结合位点可以通过定点突变的方式引入到一些蛋白中，如在hnRNPLL的RRM1结构域内，在远离Glu和Asp的位置引入带正电的氨基酸残基，就能够使其与[Ln(DPA)3]3-特异性结合，并得到可观的PSC数据[46].Wei等人[47]则通过对DPA进行不同的取代基修饰，实现对[Ln(DPA)3]3-与蛋白特异性作用的调节，人为进行磁性调控.在不进一步改变蛋白的情况下，这种简单的取代基修饰改变了[Ln(DPA)3]3-配体的几何性质与带电性，从而改变配体与蛋白的结合强度和顺磁张量的取向，通过这些不同的PCS能够获得更多的角度和距离信息.
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| 图 4 (a) DPA与稀土离子配合物([Ln(DPA)3]3-)的晶体结构示意图，其中稀土离子用黑色球表示；(b)通过改变DPA取代基调控相应稀土配合物与蛋白质的特异性作用 Fig. 4 (a) Crystal structure of [Ln(DPA)3]3-, formed by dipicolinic acid (DPA) and lanthanide metal ion, where the lanthanide is labeled in black sphere. (b) Ligands used in fine-tunning of paramagnetic effects on proteins via non-covalent tagging proteins with the lanthanide complexes of DPA derivatives |
稀土结合多肽和化学合成标签与蛋白分子的共价连接都需要蛋白质中Cys的参与，这对Cys的数量和位置都有一定的要求.若蛋白内有多个能够参与连接的Cys时，为得到单一连接产物通常经定点突变去除不需要的Cys残基，这往往会改变蛋白的结构与功能.非共价的标记方式避免了共价连接中的这些困难，不需要考虑Cys的数量位置和连接产率、产物纯化等问题；另外目标蛋白质较易回收，通常可以通过离子交换柱重新获得目标蛋白质，非共价标记对于难以制备的目标蛋白质显得尤其重要.
2.4 通过非天然氨基酸引入离子结合位点通过对DNA序列的改造和酰基tRNA合成酶的筛选，在蛋白质表达过程中利用生物正交系统引入非天然氨基酸现在已是比较成熟的技术[48]，因此在蛋白内引入能与金属离子形成稳定配合物的非天然氨基可以成为顺磁标记的另一种方式.这种标记方法不再受蛋白分子内Cys的限制，也不需进行其他电荷性质的改变，而且因为避免了化学连接和修饰，能够更自由的选择标记位点.Nguyen等人成功地把带有2, 2’-联吡啶修饰的丙氨酸引入到蛋白质内，这种修饰后的蛋白质能与Co2+结合并观测到了明显的PCS[49].Loh等人通过生物正交系统引入了带有叠氮基团的非天然氨基酸，利用点击化学分别与顺磁标签T15和T16反应获得了较好的产率[50].由于DOTA的刚性，这类T15和T16修饰的稀土蛋白配合物能产生明显的PCS.由于稀土离子具有较大的配位数，引入单个螯合能力强的非天然氨基酸是一种非常大的挑战；另外非天然氨基酸的引入是否对蛋白质的折叠引起额外的影响也需要考虑.虽然点击化学在生物大分子修饰中越来越引起人们的兴趣，但如何在链接修饰过程中保持蛋白质结构和功能的稳定是特别需要注意的地方.与荧光等其他技术比较，生物核磁共振是精确到原子分辨率水平上的一种非常灵敏的技术，如何有效引入非天然氨基酸对蛋白质进行生物核磁共振研究，目前仍是一种挑战.
3 PCS NMR在结构生物中的应用通过稀土离子顺磁标记，PCS技术在生物大分子结构研究中提供了丰富的结构信息，有潜力成为结构生物学中的重要工具.本文中我们介绍PCS在蛋白质构象优化、结构动力学与蛋白质复合物测定和药物研发中的一些应用.
3.1 蛋白质构象优化的研究生物大分子构象分析是生物核磁共振最重要的功能之一.引入顺磁标记后，PCS可以提供大量关于结构的限制条件，用于蛋白溶液结构的优化.Bertini课题组在应用顺磁核磁共振解析蛋白质构象方面做出了非常杰出的贡献，早期主要集中于利用PCS实验数据对已知结构进行拟合，计算出Δχax和Δχrh等磁感应张量数据，根据这些张量重新计算蛋白结构.而后再次用PCS实验数据对新计算结构进行拟合，计算出新一组的张量数据.如此循环，直至得到归一性较好的张量数据[51].在此基础上，他们发展了Xplor-NIH加入PCS的算法程序[52].最近利用多位点的PCS数据，可以通过PCS-Rosetta直接获得蛋白质的三维结构[53].
3.2 蛋白质结构域的动态学研究蛋白质的结构域一般具有良好稳定的结构；而多结构域蛋白内的不同结构域间常具有一定的柔性，其相对取向和运动往往对蛋白功能有重要作用.Bertini等人[54]利用PCS对钙调蛋白(CaM)N端和C端结构域间的关系进行了研究.CaM的N端和C端结构域各含有两个EF-hand结构，能够分别结合两个Ca2+，两端结构域间通过一长α-螺旋连接，蛋白整体呈哑铃型.通过定点突变的方式CaM中N端的Ca结合位点可以与稀土离子形成高稳定的配合物，利用Tb3+、Tm3+选择性结合CaM的N端结构域，比较分析N端和C端的PCS和RDC数据，获得了溶液中CaM的N端和C端结构域间的相互关系.Bertini等人在以上工作基础上，进一步结合PCS和PRE等技术，又发展了分析多结构域蛋白的MO(maximum occurance)方法[55, 56].
对于没有顺磁结合中心的多结构域蛋白质，PCS可以通过顺磁标记的方式获得.由于多结构域蛋白内结构域链接的柔性，顺磁标记中顺磁标签的设计需要考虑链接后的刚性与非特异作用.顺磁标签的柔性会降低PCS的强度，以此平均化的PCS会降低结果的分辨率，因此刚性标签的设计非常重要.
3.3 蛋白-蛋白复合物的结构研究蛋白-蛋白复合物一般具有较大的分子量，传统研究方式通常需要3种同位素标记，对蛋白样品和NMR谱仪都有较高的要求.在已知蛋白单体结构的情况下，PCS为快速简便获得复合物结构提供了新的思路.Pintacuda等人[57]通过PCS成功获得了E.coli DNA复制酶Ⅲθ亚基和外切核酸酶N端ε186结构域的蛋白质复合物结构，所得结果与传统NOE方法计算的结果一致，证明了PCS计算方法的可行性和有效性.通过顺磁标记方法，在没有稀土离子结合的蛋白上引入顺磁中心，同样可以快速获得蛋白质-蛋白质复合物的结构[58].
3.4 蛋白-小分子配体复合物与药物筛选NMR研究PCS同样可以应用于蛋白和小分子配体复合物溶液结构的研究.通过对蛋白质的顺磁标记可以获得非常有效的Δχ-张量，通过观察小分子的化学信号，根据小分子的PCS可以拟合出相对蛋白质的取向.John等人[59]使用ε186/θ亚基复合物与胸腺嘧啶(Thymidine)的结合体系证明了PCS计算方法的可行性.Thymidine与ε186亚基的结合力较弱（解离常数为7 mmol/L），在NMR谱图中表现为明显的快交换，只能观察到结合和解离两种状态的平均结果，不能满足传统计算方法所需的谱图要求.利用Dy3+、Tb3+、Er3+等顺磁离子的PCS特点，从thymidine完全平均化的PCS数据中，计算出结合态所占比例和化学位移，并拟合出了thymidine相对顺磁中心的各个张量.
NMR在基于结构片断的药物设计中发挥着重要作用，如何快速有效地获得小分子与蛋白质靶体的作用方式是研究中的关键[59].PCS在蛋白质与小分子或药物先导分子的弱相互作用过程中显得尤其重要和灵敏.在药物设计上，通过PCS可以获得有效的药物靶体和先导分子的三维作用构象[61-64].
4 PCS NMR技术发展的前景和展望随着高场核磁共振谱仪的发展，生物核磁共振的分辨率不断提高，为结构生物学的研究创造了条件.随着越来越多生物大分子结构得到解析，如何关联结构与功能是生物核磁共振目前研究的重点，顺磁核磁共振对生物大分子瞬态结构和运动的研究是生物核磁共振的发展趋势之一.稀土离子顺磁标记技术因其成体系的顺磁特性，在NMR谱图分析、蛋白结构解析、分子间相互作用等方面展示了巨大的潜力，在蛋白动态学研究中更具有独特的优势.由于NMR高灵敏度的特点，顺磁标记需要满足高选择性和低副作用的要求.目前，适用于生物大分子的顺磁标记技术取得了长足的发展，但仍有许多问题需要解决.譬如顺磁标签的普适性较差，针对特定蛋白仍需经过复杂的实验才能筛选出合适的标记方案.另外，大体积的标签无疑会带来额外的非特异作用，尤其是DOTA类顺磁探针一般都带有很强的疏水性、带电荷多且体积大，与小分子蛋白质的非特异作用是不容忽视的问题.如何设计体积小、电荷低而又稳定、刚性的标签是目前需要解决的问题.现在的顺磁标记大部分都集中在Cys的化学链接上，如何提高链接效率并开发除Cys外的链接方式也有探索的空间.随着NMR技术在细胞内原位测定技术的发展[65]，如何在细胞内环境下对目标蛋白分子进行顺磁标记无疑会增强该技术的灵敏度和信息量.最近通过顺磁标记方法利用PCS研究固体状态下蛋白质的聚集状态为发展PCS在固体核磁共振中的应用开创了诱人的前景[66].
蛋白质的动态学分析对了解蛋白质的结构与功能尤其重要，最近发现蛋白质瞬态构象与作用方式往往与其功能密切相关[5]，因此利用PCS并结合PRE等技术无疑为解决此类问题提供灵敏有效的方法.
随着顺磁标记和NMR技术的不断发展，包括PCS在内的顺磁核磁共振为生物核磁共振研究提供了新的技术与方法，在结构生物学中将会发挥更重要的作用.
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