波谱学杂志  2014, Vol. 31 Issue (1): 100-107
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蝎子尾腺分泌的毒液主要含有蛋白质、脂类、有机酸、游离的氨基酸等成分，其中蛋白质组份大部分是具有生物活性的多肽，例如抗菌肽、抗原虫肽、阳离子防御肽以及神经毒素，这些神经毒素我们称之为蝎毒素，一般由28~76个氨基酸残基构成[1].蝎毒素通常能特异性地作用于钾离子通道，是很好的多肽类离子通道调节剂.而钾离子通道失调是诸如长QT综合症、家族性婴儿惊厥、先天性耳聋等疾病的致病病因，因此，蝎毒素肽类的相关研究受到持续广泛的关注[2].在前期研究中，我们发现了一个新的蝎毒素LmKTT-1a，它除了具有蝎毒素常见的钾离子通道抑制剂活性外，还具有未曾在其他蝎毒素中发现的胰蛋白酶（Trypsin）抑制活性，是一种双功能多肽分子.我们利用液体NMR手段对其进行了三维结构解析，发现其三维结构属于Kunitz-type型折叠，不同于蝎毒素的其他亚类采用的CS-α/β和CS-α/α折叠模式.综合了蝎毒素LmKTT-1a的功能与结构特点，并结合基因组学的研究，我们认为LmKTT-1a属于一个新的蝎毒素亚类，并将之命名为d-KTx[3].在对LmKTT-1a进行功能研究的过程中，我们利用生化手段确定了LmKTT-1a能够抑制Trypsin的活性，但是其作用机制和位点尚不清楚，有待进一步研究.本文以液体NMR为手段，利用化学位移扰动分析[4, 5]的方法确定了LmKTT-1a与Trypsin相互作用可能的界面及活性位点，并进一步构建了突变体对这一结果进行了生物活性验证，最终确定了二者相互作用最关键的氨基酸位点，对LmKTT-1a具有双功能活性的结构基础进行了阐释.
1 实验部分 1.1 样品制备蝎毒素LmKTT-1a的15N标记样品由武汉大学病毒与分子癌学实验室提供（蛋白样品全长79个氨基酸，其中N端tG1~tM20为表达标签，K1~C59为成熟肽，成熟肽的序列为KKKCQLPSDVGKGKASFTRYYYNEESGKCETFIYGGVGGNSNNFLTKED CCRECAQGSC）.Trypsin购买于Sigma公司.LmKTT-1a的NMR实验样品浓度为0.8 mmol/L，由于Trypsin在pH=8.0的条件下具有最佳生理活性，而本研究组已发表的LmKTT-1a的溶液结构是在pH=6.0条件下测得[3]，本文需测定在pH=8.0条件下LmKTT-1a的溶液结构是否发生了明显的变化，故配制样品的缓冲溶液为0.02 mol/L磷酸钠缓冲液，10% D2O，pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0.
1.2 NMR实验和数据处理NMR实验使用Bruker AVANCE Ⅲ 800型谱仪和z梯度场的三共振超低温探头完成，试验温度为298 K.所有2D 1H-15N HSQC实验谱宽均为9 615 Hz×2 757 Hz，采样点数为1 280×200，累加8次.实验数据使用NMRPipe[6]进行变换处理，处理后的谱图用CARA[7]进行分析.结构显示用MOLMOL[8]软件.
pH值滴定实验：我们在采集了pH=6.0条件下LmKTT-1a的1H-15N HSQC谱图后，用Amicon超滤膜离心管置换缓冲液，保持同样的溶液体积和采样参数，分别采集pH=6.5，7.0，7.5和8.0条件下LmKTT-1a的1H-15N HSQC谱图，比较其信号的变化.
化学位移扰动实验：将高浓度的Trypsin溶液逐步滴入0.8 mmol/L的LmKTT-1a溶液中，在总体积变化不大的情况下使得LmKTT-1a与Trypsin的浓度比例为1：0、1：1/3、1：2/3、1：1、1：2和1：3，保持采样参数不变，检测各滴定比例下的HSQC谱图.
1.3 化学位移扰动计算HSQC谱图用CARA进行分析，分别记录信号的1H和15N化学位移值，用下式计算蛋白质各残基信号的化学位移扰动值Dd[5]：
| $\Delta \delta = \sqrt {{{\left[ {\delta {{{(^1}{\text{H}})}_{free}} - \delta {{{(^1}{\text{H}})}_{obs}}} \right]}^2} + 0.04{{\left[ {\delta {{{(^{15}}{\text{N}})}_{free}} - \delta {{{(^{15}}{\text{N}})}_{obs}}} \right]}^2}} $ | (1) |
突变体构建：采用QuikChange定点突变试剂盒（Stratagene, USA）突变野生型质粒pET-28a-LmKTT-1a，通过测序确认突变结果.
胰蛋白酶抑制剂活性检测：LmKTT-1a及其突变体的抑制剂活性检测基于色原底物法，具体方法参见本课题组已发表的流程[3]，抑制常数Ki由米氏方程与双倒数作图法测得.
1.5 圆二色光谱分析LmKTT-1a及其突变体二级结构的稳定性通过圆二色光谱（circular dichroism）进行分析，所有的样品被溶解于水中，浓度为0.2 mg/mL，实验仪器为Jasco-810型分光偏振计，扫描波长范围是250 nm~190 nm，温度为25℃，扫描速率为50 nm/min.
2 结果与讨论 2.1 pH=8.0下LmKTT-1a结构的稳定性1H-15N HSQC谱图中的信号来源于蛋白质中的NH基团，而蛋白质中的NH基团分为主链NH基团（除PRO）和部分氨基酸（ASN、GLN、LYS、ARY）的侧链NH2基团，且主链和侧链的信号分布于HSQC谱图的不同区域，因此，HSQC信号与氨基酸残基的NH基团一一对应[9].由于构成蛋白质分子的原子的化学位移取决于它所处的化学环境，当氨基酸残基的局部化学环境发生变化的时候，相应区域原子的化学位移也会发生变化.因此，我们可以用1H-15N HSQC实验检测蛋白质结构是否发生了变化.Trypsin在pH=8.0时具有最好的生物活性，我们选择在该条件下研究LmKTT-1a与Trypsin的相互作用.在早前发表的工作中[3]，我们获得了pH=6.0条件下LmKTT-1a的主链归属和溶液结构，因此，我们首先需要确定不同pH条件下LmKTT-1a结构的稳定性.pH滴定结果发现：从pH=6.0滴定至8.0，LmKTT-1a的主体结构并没有发生变化（图 1）.主要表现在，除了表达标签中的tS3、tS10、tS11、tS18、tR16、tG12、tG17在pH=8.0的溶液条件下HSQC信号消失外，多肽序列仅有K1、K2、K14、G36、G38、G39、S58共7个残基的NH基团信号以及R39的支链NH基团信号消失，其余52个残基主链NH信号从pH=6.0~8.0几乎是完全重叠的，滴定前后信号半峰宽未发生变化，这说明LmKTT-1a的主体结构几乎没有发生变化，pH=8.0条件下进行的实验可以使用早前工作中LmKTT-1a的归属结果和计算所得的溶液结构.消失的残基处于多肽的loop结构区或碱性氨基酸侧链，由于可交换质子与溶剂水质子的交换速率随pH值的升高而变大，导致信号变弱或消失.
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| 图 1 pH=8.0（黑色）和pH=6.0（灰色）的1H-15N HSQC谱图叠加 Fig. 1 Overlay of HSQC spectra at pH=6.0 (gray) and 8.0 (black) |
当蛋白质分子间由于相互作用导致某些残基的局部化学环境发生变化时，相应残基的NH基团的化学位移也会发生扰动，体现在HSQC谱图上相应的NH信号发生变化，由此可以通过NH基团的化学位移受到扰动的显著性来推断分子间相互作用的结合位点和结合面[5].在蝎毒素LmKTT-1a的滴定过程中，将其与Trypsin不同浓度比例下的HSQC谱图叠加后可以观察到某些信号在滴定的过程中逐渐消失，然后在新的位置逐渐出现，信号的半峰宽不变，这是NMR时间尺度下的慢交换行为[9]，表明LmKTT-1a与Trypsin的相互作用属于专一性的强结合[图 2(a)].当滴定到HSQC谱图的谱峰强度不再发生变化时，LmKTT-1a与Trypsin的结合达到饱和.我们根据（1）式计算出化学位移的扰动值[图 2(b)]，发现化学位移变化值大于化学位移变化平均值加标准差的残基有V10、K12、A15、F17和G35，这些残基或其附近的残基很可能参与了LmKTT-1a与Trypsin的相互作用.
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| 图 2 (a) 1H-15N HSQC叠加图，黑色的谱峰表示未加入Trypsin时LmKTT-1a各残基的信号，灰色的谱峰表示LmKTT-1a与Trypsin滴定比例为1：3时的LmKTT-1a各残基的信号；(b)滴定后化学位移变化值Dd对残基序号作图，虚线表示化学位移变化值Dd的平均值加上标准差；(c)将发生显著变化的残基在LmKTT-1a的溶液结构(PDB: 2M01)上标注出来，椭圆内为可能的作用位点 Fig. 2 (a) Overlay of HSQC spectra. The black peaks are signals from LmKTT-1a without Trypsin, and the gray peaks are signals when the concentration ratio of LmKTT-1a and Trypsin was 1:3. (b) Diagram of the chemical shift change against residue number, the dash line represents the average value plus the standard deviation. (c) The residues with significant chemical shift change are labeled in the NMR structure of LmKTT-1a (PDB: 2M01). The possible binding site was highlighted by the ellipse |
LmKTT-1a分子的液体NMR结构（PDB ID：2M01）呈现上宽下窄的楔形结构，上面的刚性部分由反平行的β折叠和C端的α螺旋构成，下端含有loop状的柔性区域形成了一个狭长的锥形结构.将图 2(b)中化学位移变化较大的残基在LmKTT-1a的结构上标记出来[图 2(c)]，可以发现这些残基都位于LmKTT-1a的楔形下端，因此可以推断LmKTT-1a与Trypsin相互作用的界面可能位于分子下端的loop区域，从结构上看该区域的柔性特征有利于LmKTT-1a分子深入到Trypsin分子表面的“缝隙”中，使二者发生相互作用.
2.3 LmKTT-1a突变体活性实验根据上述试验结果，对LmKTT-1a进行定点突变，表达了一系列突变体：K2N、V10R、K14A、A15F、S26G和K2N/S26G；圆二色光谱的结果显示，上述突变体都保持了结构的稳定性[图 3(b)].酶活试验的结果表明：K14位点的突变使LmKTT-1a失去了Trypsin抑制剂活性，A15的突变体使LmKTT-1a的Trypsin抑制剂活性较之野生型降低了约600倍，V10位点突变体也下降约3倍[图 3(a)]，这一实验结果，有力的印证了通过化学位移扰动分析所得到的LmKTT-1a与Trypsin相互作用的界面，且说明了K14可能是最为关键的结合位点.
值得一提的是，通过基因组的同源比对分析，K2和S26位点是最常见的蝎毒素与钾离子通道相互作用的关键氨基酸，而构建的K2N、S26G、K2N/S26G三个突变体其Trypsin抑制活性没有受到影响[图 3(a)]，这说明了LmKTT-1a与Trypsin相互作用的位点和与钾离子通道相互作用的位点并不重合，有两个独立的结构域执行LmKTT-1a的双功能.
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| 图 3 (a) LmKTT-1a的突变体酶活测试；(b) LmKTT-1a各突变体的圆二色光谱 Fig. 3 (a) Enzymatic inhibiting activities of LmKTT-1a mutants; (b) CD spectra of LmKTT-1a mutants |
我们采用化学位移扰动分析的方法研究了在pH=8.0条件下蝎毒素LmKTT-1a与胰蛋白酶的相互作用，并确定了可能的作用位点和界面；然后构建了突变体，用生化试验进行了验证.研究表明，蝎毒素LmKTT-1a的柔性下端形成的狭长结构是其与Trypsin相互作用的界面，K14等氨基酸残基是相互作用的关键位点；且LmKTT-1a与钾离子通道相互作用的位点对其胰蛋白酶抑制活性没有影响，LmKTT-1a分子存在着两个独立的结构域行使着其双功能，该结果为我们进一步理解LmKTT-1a这一类新的蝎毒素亚类的特性提供了基础数据.
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