2014, Vol. 31文章信息
- 毛希安
- MAO Xi-an
- 一个获得压水峰良好效果的简单方法
- A Simple Method for Clean Water Signal Suppression
- 波谱学杂志, 2014, 31(1): 1-6
- Chinese Journal of Magnetic Resonance, 2014, 31(1): 1-6
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文章历史
收稿日期: 2013-10-08
收修改稿日期: 2013-11-07
经过几十年的研究，生物样品的压水峰问题已经不是NMR的热点了.一方面是因为技术方法较为成熟，几乎任何研究体系都有合适的或较为合适的压水峰方法以资利用[1, 2]；另一方面是因为研究工作者已经满足于这些方法，或者说只能将就于这些方法，因为要获得更好的方法实在很困难。在蛋白质结构研究中所使用的压制水峰的主要方法之一是基于异核单量子相干转移的梯度场方法[3, 4].有3个参数可以对梯度场进行调节，梯度场强度、梯度脉冲长度和梯度形状.在现代化的仪器上这3种参数都有默认值.绝大多数实验工作者都取默认值进行实验.例如梯度脉冲长度基本上都是1 ms，梯度形状基本上都是正弦钟形或圆角矩形（smoothed square），在1H-15N HSQC实验中，用于选择相干转移路径的2个梯度脉冲的强度比为9.88:1（一般为4×10-3 T /cm:4.05×10-4 T/cm），而在1H-13C HSQC实验中，这2个梯度脉冲的强度比为3.98:1（一般为4×10-3 T/cm:1.005×10-3 T/cm）.如果样品浓度较高，仪器灵敏度又较高，而主磁场又比较均匀，那么用默认值做实验便能够获得足够好的图谱.但是如果条件不够理想（主要是样品浓度不够高），那么用默认值压水峰的效果就比较差.
本文介绍一种简单的，通过调节脉冲梯度长度来达到较好的压水峰效果的实验方法.该方法十分简单，但效果却很显著，具有广泛的推广价值.
1 实验部分实验样品为15N, 13C双标记的一个分子量为14 000的蛋白质分子，浓度为1.0 mmol/ L，溶于pH=6.5的90%H2O/10%D2O的磷酸缓冲溶液.
2D NMR实验在Bruker Avance 900型谱仪上进行.所用探头为超低温TXI探头.90°脉冲宽度分别为，1H 9.55 ms，13C 13.5 ms，15N 50 ms.样品温度为298 K.
研究中进行了1H-13C HSQC和1H-15N HSQC二种实验，脉冲序列示于图 1中.在实验中仅对G1和G2的长度进行变动，而保持其它所有的参数不变.这些不变的参数主要有：1H载频d 4.7，谱宽d 13；13C载频d 40，谱宽d 76；15N载频d 118，谱宽d36.在1H-13C HSQC实验中，trim脉冲为1 ms，用于选择单量子相干的二梯度脉冲强度分别为4.0和1.005×10-3 T/cm，用于相干转移的耦合常数为145 Hz.在1H-15N HSQC实验中，清洗梯度强度为2.5×10-3T/cm，用于选择单量子相干的二梯度强度分别为40和4.05×10-4T/cm，用于相干转移的耦合常数为90 Hz.梯度形状均为圆角矩形.实验中单量子相干选择梯度G1和G2保持相等的长度，但同时进行变化，以观测压制水峰的效果.在1H-13C HSQC实验中，G1和G2的长度值从1 ms改变到1.7 ms.在1H-15N HSQC实验中，G1和G2的长度值从1 ms改变到2.5 ms.
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| 图 1 用于实验的HSQC脉冲序列.X代表13C和15N，实心棒表示90°脉冲，空心矩形表示180°脉冲.对于13C HSQC实验，1H通道施加了一个trim脉冲，用虚线脉冲表示.而对于15N HSQC实验，施加了一个清洗PFG脉冲，也用虚线脉冲表示 Fig. 1 HSQC pulse sequence used in the study. X represents 13C and 15N. Filled narrow bar and unfilled wide bar represent 90° and 180° pulses, respectively. For 13C HSQC experiments, a trim pulse was applied, which is denoted with a dashed line pulse. For 15N HSQC experiments, a purge PFG pulse was applied, which is also denoted with a dashed line pulse |
时域中直接维采样点数为1 024，间接维采样点数为128，累加次数为2，空扫次数为8.频域中直接维和间接维都为1 024点.两维中的窗函数均为平方余弦钟.
2 结果与讨论 2.1 实验结果实验中对样品进行了1H-15N HSQC和1H-13C HSQC的测试.在所有的实验中，每当梯度脉冲变长时，总能得到更好的压水峰效果.部分实验结果示于图 2和图 3.图 2是1H-15N HSQC实验当用于选择相干转移的梯度脉冲分别为1 ms和2.5 ms所得到的图谱.图 3是1H-13C HSQC实验当梯度脉冲分别为1 ms和1.7 ms所得到的图谱.为更清楚地比较梯度脉冲长度变化对压水峰效果的影响，在图 4中显示了2D 1H-15N HSQC谱在1H维度上的投影.
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| 图 2 某蛋白质分子当单量子相干转移选择梯度长度为1 ms (a)和2.5 ms (b)的1H-15N HSQC实验图谱 Fig. 2 1H-15N HSQC spectra of a protein with varied gradient pulse length of single quantum coherence selection. (a) 1 ms, (b) 2.5 ms |
HSQC的脉冲序列虽然简单，但也有非常多的变种，例如有灵敏度增强的序列，水峰返回的序列，用“水门”压水峰的序列等等.但无论用何种序列做实验，如果仅仅用默认值做实验，要想彻底地将水峰从图谱中消灭掉几乎不可能.本实验所用的样品浓度是相当高的（1 mmol/L），而且匀场条件也比较好（谱中最窄的小分子峰仅为1.8 Hz），但用默认值所得到的图谱如图 2(a)、图 3(a)和图 4最左边的谱那样难以令人满意.从图 4中1 ms的图谱（最左边）可以看出，用默认值做实验，残留的水峰常常变得很宽，这是非常普遍的现象.对于15N谱来说，所有的信号都远离水峰（见图 2），压水峰效果好与差对结构分析影响不大.可是对于13C谱来说，压水峰效果的好与差对于结构分析就有很大的影响了.如果像图 3(a)那样，便有好几个a-CH相关峰被永远地埋在水峰里.虽然只有那么几个信号消失了，可是对于蛋白质结构解析来说，就等于在一个整体的解析链中产生了几个断点.有时为了恢复那么一、二个断点，不惜花上几个星期做好几个三维实验，而且还可能得不到所需的结果.或者对样品进行干燥处理后溶解于100%的D2O中重新做实验.可是问题是D2O中的化学位移和H2O中的化学位移是有区别的，实验工作者总是希望能不换溶剂而得到所有的图谱.另外一个问题是在干燥后重新溶解容易造成样品的损失.对于非常珍贵的样品，不到万不得已的时候谁都不愿意采取这种办法.可是如图 3(b)所示，只需要简单地改变梯度脉冲的长度，那几个长眠在水里的a-CH峰便活过来了.因此本文所介绍的方法，虽然简单，却有“起死回生”之功效.
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| 图 3 某蛋白质分子当单量子相干转移选择梯度长度为1 ms (a)和1.7 ms (b)的1H-13C HSQC实验图谱的Ca区域 Fig. 3 1H-13C HSQC spectra in the a-carbon region of a protein with varied gradient pulse length of single quantum coherence selection. (a) 1 ms, (b) 1.7 ms |
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| 图 4 2D 1H-15N HSQC在1H维度上的正投影.谱中标明的是实验中的梯度长度值 Fig. 4 Positive projection of two dimensional 1H-15N HSQC spectra onto the 1H dimension. The gradient pulse length has been given |
用长的梯度脉冲能获得较好的压水峰效果符合梯度NMR的理论.理论指出[5]，在梯度作用下的磁化强度散相是一个sinc函数的变化过程.时间越长，散相就越彻底.除此之外，梯度作用下水分子的扩散也是不可忽视的因素，因为单纯的扩散效应也能导致有效的压水峰效果[1].
仔细地比较图 4中的4个图谱容易发现：（1）大多数酰胺峰在梯度脉冲长度变化时不怎么变化；（2）某些酰胺峰的强度在梯度脉冲比较长的时候显得更弱；（3）某些峰的变化无规律.从理论上说，不变化的峰说明这些质子的结构比较刚性，有规律发生变化的峰说明这些质子的结构比较松散，易于受到水分子进攻从而有较快的化学交换速率，无规律的变化不能用分子的结构和动态来解释，而只能说明电子仪器具有一定的随机性.所以如果需要探索规律性，必须克服电子仪器的无规性，例如通过增加累加次数，或提高数字分辨率等等.但从整体上看，蛋白质信号峰和水峰在梯度脉冲变长时都有下降趋势，但水峰的下降是数量级的，而蛋白质信号的变化只是微小的.用微小的损失换来较大的成功，是实验工作者所乐意接受的.
比较图 3中的2个图谱可以看出，几乎所有峰的强度在梯度脉冲长度变化时没有什么变化.这是因为与13C连接的质子不可能有化学交换发生，所以不会受梯度脉冲的影响.
在确定的脉冲序列里，梯度脉冲的长度局限在相干转移时间1/4J内，此处J为异核耦合常数.由于1H-15N的耦合常数（90 Hz）比1H-13C耦合常数（145 Hz）小，所以在1H-15N实验中，梯度脉冲的变化范围就比1H-13C实验中的变化范围更大.
HSQC实验的另一种主要形式是用“水门”压制水峰[6, 7].但在水门方法中，选择性脉冲需要1 ms左右的长度，因而梯度脉冲长度的变化范围受到限制，所以本文推荐的方法在水门实验中效果不明显.此外，水门实验相当于在水峰处挖了一个洞，对于13C实验来说，那些本来就掩埋在水峰里的蛋白质峰仍然恢复不出来，相当于在将洗澡水泼洒出去的时候连盆子里的孩子也泼洒出去了.所以在进行13C实验时用水门方法压水峰不是明智的选择.但是对于同核实验，基于“水门”实验的压水峰方法是非常有效的和难以避免的选择.
3 结论本文介绍了一种通过在HSQC实验中延长梯度脉冲的长度从而获得良好压制水峰效果的实验方法.该方法简单易行，具有广泛的推广价值.
致谢: 感谢Cleveland Clinics的刘建民博士为此研究提供了蛋白质样品.| [1] | Zhang X, Mao X A, Liu M L. Solvent Resonance Suppression Methods in NMR Spectroscopy//Encyclopedia of Spectroscopy & Spectrometry[M]. in press. |
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| [5] | Chen Jin-hong(陈金鸿), Mao Xi-an(毛希安) . Radiation damping effects in NMR experiments of pulsed field gradients(脉冲梯度场实验中的辐射阻尼效应)[J]. Chinese J Magn Reson(波谱学杂志) , 1996, 13 (6) : 547-555 |
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| [7] | Liu M L, Mao X A, Ye C H et al . Improved WATERGATE pulse sequences for solvent suppression in NMR spectroscopy[J]. J Magn Reson , 1998, 132 : 125-129 |