2023, Vol. 50文章信息
- miR-9500靶向SMAD2调控肺腺癌细胞的迁移和侵袭
- miR-9500 Regulates Migration and Invasion of Lung Adenocarcinoma Cells by Targeting SMAD2
- 肿瘤防治研究, 2023, 50(3): 236-242
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2023, 50(3): 236-242
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2023.22.0826
- 收稿日期: 2022-07-26
- 修回日期: 2022-11-24
引用本文 |
世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的全球癌症报告显示，2020年全球肺癌新发病例约220万例，死亡约180万例，位居全球癌症死亡人数第一[1]。肺癌起病隐匿，大多肺癌患者在确诊时已发生远端转移，使得肺癌患者5年平均生存率仅约20%[2-3]。肺腺癌作为肺癌的主要类型，其发病率近年来持续上升[4]。MicroRNAs（miRNAs）是真核生物中一类由21~25个核苷酸组成的短链非编码RNA，它可通过结合靶基因3’UTR序列来抑制靶基因翻译[5]。越来越多的研究证据表明miRNAs在肺腺癌转移中发挥重要调控作用[6-8]。目前关于miR-9500在肺腺癌细胞迁移侵袭中的作用机制相关报道较少。本研究基于生物信息学筛选miR-9500的靶基因，进一步作蛋白互作网络分析并筛选其核心靶基因，进行GO和KEGG富集分析及生存分析。通过体外实验探究miR-9500靶向SMAD2调控肺腺癌细胞迁移侵袭的相关分子机制，从而为肺腺癌的进展机制研究及其靶向治疗提供新的思路。
1 材料与方法 1.1 miR-9500共同靶基因的筛选利用TargetScan、miRDB、miRWalk数据库分别预测miR-9500的靶基因，并使用在线韦恩图工具Draw Venn Diagram制作韦恩图取交集，筛选miR-9500的共同靶基因。
1.2 蛋白互作网络分析及miR-9500核心靶基因筛选利用STRING在线数据库中的Multiple proteins工具对miR-9500共同靶基因进行蛋白互作网络分析。操作步骤如下：（1）在List Of Names中输入miR-9500的共同靶基因；（2）Organisms选择Homo sapiens；（3）点击SEARCH；（4）在Settings中minimum required interaction score选择high confidence（0.700），并在network display options选择hide disconnected nodes in the network；（5）导出蛋白互作表格及网络图。运用Cytoscape3.9.1软件中的cytoHubba插件进行核心基因筛选，采用度值（Degree）拓扑分析方法，将排名前20的基因视为miR-9500的核心靶基因。
1.3 GO功能分析与KEGG信号通路富集分析将cytoHubba得到的核心靶基因导入DAVID在线数据库，进行GO功能分析和KEGG信号通路富集分析。使用DAVID在线数据库中Functional Annotation分析工具，设置条件如下：（1）Enter Gene List输入miR-9500核心靶基因；（2）Select Identifier里选择OFFICIAL_GENE_SYMBOL，并在Select species中填写Homo sapiens；（3）List Type选择Gene List；（4）Submit List。提交列表后在Gene Ontology中进行GO功能分析，在Pathways中进行KEGG信号通路富集分析，并利用微生信网站将DAVID在线数据库得到的靶基因富集结果进行可视化。
1.4 miR-9500关键靶基因生存分析借助UALCAN数据库分析miR-9500关键靶基因（排名前10的核心靶基因）的表达水平与肺腺癌患者总生存期的关系。设置条件如下：（1）在Enter gene symbol输入miR-9500关键靶基因；（2）TCGA dataset中选择Lung adenocarcinoma，点击Explore；（3）Links for analysis下选择Survival进行生存分析。
1.5 细胞培养与处理人肺腺癌细胞系A549购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。培养基为含10%FBS的F12K培养基，于37℃、5%CO2培养箱内培养。将A549细胞铺于6孔板内，细胞密度达到50%~60% 时，按照所用jetPRIME转染试剂（Polyplus）说明书进行转染；NC对照和miR-9500 mimics作用的终浓度均为50 nmol/L，并分别于24 h和48 h后提取肺腺癌细胞A549的总RNA和总蛋白进行后续实验。
1.6 miR-9500与SMAD2的靶向关系验证借助TargetScan数据库预测miR-9500与SMAD2的结合位点。通过双荧光素酶报告实验验证miR-9500与SMAD2之间的靶向关系，即：合成含有miR-9500结合位点的SMAD2 3’UTR序列及miR-9500结合位点突变的SMAD2 3’UTR序列，分别构建SMAD2-wt与SMAD2-mut双荧光素酶报告重组质粒。肺腺癌细胞A549密度达到60%左右时进行转染，实验共分为4组，分别为SMAD2- wt+NC、SMAD2-mut+NC、SMAD2-wt+miR-9500 mimics和SMAD2-mut+miR-9500 mimics。利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各处理组酶活性的变化，以海肾荧光素酶活性作为内参。
1.7 细胞迁移和侵袭能力的检测划痕实验：将A549细胞接种于6孔板中，转染，用10 μl枪头垂直沿6孔板中线轻轻划线，PBS清洗除去悬浮细胞，换1%血清培养基，分别于0、24、48和72 h拍照，以检测分析各处理组细胞的迁移能力。Transwell实验：将转染后的A549细胞计数并接种于上室中，培养48 h后用0.1%结晶紫染色，计数膜背面穿膜细胞数并拍照，后用DMSO洗脱下室滤膜上着色细胞，酶标仪检测光密度OD值，以检测分析各处理组细胞的迁移能力。基质胶侵袭实验：在滤膜上平铺一层基质胶，将转染后的A549细胞计数并接种于上室中，培养48 h后用0.1% 结晶紫染色，计数膜背面穿膜细胞数并拍照，洗脱并测定OD值，以分析各处理组细胞的侵袭能力。
1.8 Western blot与qRT-PCR检测SMAD2蛋白和mRNA的表达Western blot：按常规步骤操作。RIPA裂解液提取NC对照组与miR-9500 mimics处理组细胞总蛋白，BCA蛋白定量、电泳、转膜、封闭、抗体孵育、ECL曝光，分析各处理组细胞中MMP2、MMP9及SMAD2的蛋白表达水平差异。所用一抗均来自于Proteintech（中国武汉），稀释比例如下：MMP2（1:1 000）、MMP9（1:1 000）、SMAD2（1:1 000）、β-actin（1:4 000）。qRTPCR：TRIzol法分别提取NC对照组与miR-9500 mimi cs处理组细胞总RNA，用反转录试剂盒（TransGen Biotech）将所提RNA反转录为cDNA，并用qRT-PCR试剂盒（TargetMol）检测各处理组细胞中SMAD2 mRNA相对表达水平的差异。
1.9 统计学方法采用SPSS21.0软件进行统计学分析，两组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 miR-9500靶基因预测及其蛋白互作网络分析通过筛选共获得698个miR-9500的共同靶基因，见图 1。借助STRING在线数据库构建了这些靶基因的蛋白互作网络，见图 2A。进一步利用Cytoscape软件中的cytoHubba插件进行核心靶基因筛选，将Degree排名前20的基因作为miR-9500的核心靶基因，结果见图 2B。
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| 图 1 韦恩图取交集获得miR-9500的靶基因 Figure 1 Venn diagram of miR-9500 target genes |
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| 图 2 蛋白互作网络分析(A) 及miR-9500核心靶基因筛选(B) Figure 2 Protein interaction network analysis(A) and screening of miR-9500 core target genes(B) |
GO功能分析结果表明这些基因在生物学过程（BP）方面主要集中于细胞内信号转导和凋亡抑制等；这些基因的产物在执行功能时所处细胞成分的结构位置（CC）主要集中于细胞质的核周区域和细胞质等；这些基因及其产物的分子功能（MF）主要集中于β-catenin结合和蛋白激酶结合等，见图 3A。KEGG信号通路富集分析结果表明，miR-9500核心靶基因相关通路主要富集于癌症通路（如：前列腺癌、胃癌、肾细胞癌、结直肠癌、小细胞肺癌等）、ErbB信号通路、黏着斑、TGF-β信号通路、细胞周期等，见图 3B。
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| 图 3 miR-9500核心靶基因的GO功能分析(A)和KEGG信号通路富集分析(B) Figure 3 GO analysis(A) and KEGG signaling pathway enrichment analysis(B) of miR-9500 core target genes |
将排名前1 0的m i R - 9 5 0 0核心靶基因作为miR- 9 5 0 0关键靶基因，分别为：EP 3 0 0、AKT1、VAMP2、AR、SP1、GSK3B、STX1A、SMAD2、RXRA、STX16。其中只有VAMP2、SMAD2及RXRA的表达水平与肺腺癌患者的总生存期显著相关；且相比于低表达组，VAMP2和RXRA高表达组肺腺癌患者的总生存期均显著延长，而SMAD2高表达组肺腺癌患者的总生存期显著缩短，见图 4。
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| 图 4 miR-9500关键靶基因与肺腺癌患者总生存期之间的关系 Figure 4 Relationship between miR-9500 key target genes and overall survival of patients with lung adenocarcinoma |
生物信息学分析结果提示：SMAD2可能是miR-9500的关键靶基因之一。TargetScan数据库分析发现，SMAD2 3’UTR有3个miR-9500的结合位点，这两者有着较为可靠的靶向关系，见图 5A。本研究中所验证的结合位点为7638~7644位，其野生型和突变型序列见图 5B。合成含有miR-9500结合位点的SMAD2 3’UTR序列及miR-9500结合位点突变的SMAD2 3’UTR序列，分别构建SMAD2-wt与SMAD2-mut双荧光素酶报告重组质粒，并通过测序比对证实重组质粒载体构建成功（图请扫描本文OSID码）。双荧光素酶报告实验结果显示，miR-9500 mimics转染组与NC组相比，SMAD2-wt共转染组荧光素酶活性显著降低；而SMAD2-mut共转染组荧光素酶活性无明显变化，见图 5C。qRT-PCR与Western blot检测结果显示，过表达miR-9500可显著降低SMAD2的mRNA相对表达水平和蛋白表达水平，见图5D~E。综上，miR-9500可靶向结合SMAD2并下调SMAD2的表达水平。
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| A: Predicted binding sites of miR-9500 and SMAD2; B: Wild-type and mutant sequences of SMAD2 3'UTR; C: Dual luciferase reporter assay; D-E: The effects of miR-9500 overexpression on the relative mRNA expression level and protein expression level of SMAD2. **: P < 0.01, ***: P < 0.001, compared with NC group. 图 5 miR-9500靶向结合SMAD2并抑制SMAD2表达 Figure 5 miR-9500 targeted SMAD2 and inhibited the expression of SMAD2 |
划痕实验与Transwell实验结果均表明，miR-9500 mimics处理组肺腺癌细胞的迁移能力显著低于NC对照组，见图6A~B。基质胶侵袭实验结果表明，过表达miR-9500可显著降低肺腺癌细胞的侵袭能力，见图 6C。Western blot结果表明，过表达miR-9500可显著降低肺腺癌细胞迁移侵袭标志分子MMP9和MMP2的蛋白表达水平，见图 6D。综上，miR-9500可通过靶向SMAD2进而显著降低肺腺癌细胞的迁移侵袭能力。
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| A-B: Effect of miR-9500 overexpression on the migration of lung adenocarcinoma cells was analyzed by Wound healing and Transwell assays; C: Matrigel invasion assay was used to determine the effect of miR-9500 overexpression on the invasion ability of lung adenocarcinoma cells; D: Western blot was used to analyze the effect of miR-9500 overexpression on the protein expression levels of MMP2 and MMP9 in lung adenocarcinoma cells; *: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001, compared with NC group. 图 6 过表达miR-9500可抑制肺腺癌细胞迁移侵袭 Figure 6 Overexpression of miR-9500 could inhibit the migration and invasion of lung adenocarcinoma cells |
肺腺癌是肺癌的常见类型，约占所有肺癌病例的40%，是最具侵袭性和致命性的肿瘤之一[9]。发生转移是造成晚期肺腺癌患者治疗失败和死亡的主要原因之一，但目前关于肺腺癌转移的分子机制尚未完全阐明[10-11]。本研究结果表明，miR-9500可通过靶向SMAD2来抑制肺腺癌细胞的迁移和侵袭，提示miR-9500可能作为肿瘤抑制因子在肺腺癌的发生发展中发挥重要调控作用。
研究表明miRNAs在肺腺癌细胞的迁移侵袭调控中扮演着重要角色。如：miR-21-5p在肺腺癌中呈显著高表达，可通过靶向WWC2（WW和C2结构域蛋白2）促进肺腺癌细胞的迁移和侵袭[12]。而miR-191-5p可通过靶向SATB同源盒1（SATB1）来抑制Wnt/β-catenin信号通路激活，从而降低肺腺癌细胞的迁移能力[13]。miR-365可通过靶向ETS1（ETS原癌基因1）显著降低肺腺癌细胞的迁移和侵袭能力[14]。除Yoo等首次发现并报道miR-9500可通过靶向AKT丝/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）来抑制肺腺癌进展外，目前鲜有关于miR-9500在肺腺癌调控中的报道[15]。本研究发现过表达miR-9500可显著抑制肺腺癌细胞A549迁移侵袭，与Yoo等研究结果一致。
由于miRNAs与其靶基因3’UTR区配对的非严格性，使得一个miRNA可与多个靶基因结合，反之，不同miRNA也可与同一个靶基因结合进而发挥调控作用[16]。故本研究中，我们利用3个不同的数据库预测miR-9500的靶基因，取交集得到698个基因作为miR-9500的共同靶基因；并借助STRING和Cytoscape筛选出包括SMAD2在内的前20个基因作为miR-9500的核心靶基因。这些核心靶基因相关信号通路主要富集于癌症通路、ErbB信号通路、黏着斑、TGF-β信号通路等。ErbB家族由四个成员组成，包括EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4且均为受体酪氨酸激酶。其中EGFR异常激活与包括肺腺癌在内的多种肿瘤发病机制密切相关[17-18]。黏着斑是细胞与周围环境的接触点，与肿瘤细胞迁移侵袭过程密切相关，该通路的异常激活可显著提高肺腺癌细胞的迁移侵袭能力，进而促进肺腺癌的发生发展[19-21]。TGF-β信号通路对细胞的增殖、分化、黏附、衰老和凋亡等多方面具有调控作用，并且在肿瘤迁移侵袭、肿瘤微环境及免疫反应中发挥重要作用[22]。如：非SMC凝聚素I复合亚基G（NCAPG）可通过TGF-β信号通路促进肺腺癌细胞的迁移[23]。miR-206可通过抑制TGF-β信号通路进而抑制肺腺癌的生长转移[24]。研究发现TGF-β/SMAD2信号通路在肿瘤进展早期可抑制肿瘤增殖，但在肿瘤进展后期发挥促进上皮间质转化（EMT）进程和肿瘤转移的作用[25]。这些研究证据提示，miR-9500可能通过ErbB信号通路、黏着斑、TGF-β信号通路等途径参与调控肺腺癌细胞迁移侵袭。
有研究表明MDM2原癌基因（MDM2）可通过激活SMAD2/3信号通路促进肺腺癌细胞迁移侵袭[26]。此外，miR-155-5p可通过靶向SMAD2进而显著降低肺腺癌细胞的迁移侵袭能力[27]。本研究通过生信分析发现排名前10的miR-9500关键靶基因中，仅有VAMP2、SMAD2及RXRA三者的表达水平与肺腺癌患者的总生存期显著相关。且与低表达组相比，VAMP2和RXRA高表达组肺腺癌患者的总生存期均显著延长，而SMAD2高表达组肺腺癌患者的总生存期显著缩短。这些研究证据表明SMAD2可能作为促癌因子参与调控肺腺癌细胞迁移侵袭。考虑到SMAD2与miR-9500之间的靶向评分高于VAMP2和RXRA这两个靶基因，且其3’ UTR有3个miR-9500结合位点，两者间可能存在较为可靠的靶向关系，我们进一步探究了miR-9500是否通过靶向SMAD2来抑制肺腺癌细胞迁移侵袭。结果表明：miR-9500可靶向结合SMAD2进而抑制SMAD2表达；过表达miR-9500可显著降低肺腺癌细胞的迁移侵袭能力。综上，miR-9500可通过靶向SMAD2来抑制肺腺癌细胞迁移侵袭，其可能作为肿瘤抑制因子在肺腺癌发生发展中发挥重要调控作用。
作者贡献：李 芳：选题与实验设计、论文审阅校正 韩采利：生信分析与作图、论文起草与修改 王 丽：细胞实验设计与实施 沈 慧：参与数据分析以及论文校对
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